细胞破碎专业知识讲座.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,生物分离过程普通流程,本章内容,1,细胞破碎专业知识讲座,第1页,常见细胞壁结构,细胞破碎技术,包涵体纯化方法,本章主要内容,2,细胞破碎专业知识讲座,第2页,概述,不一样类型细胞分泌目标产物类型：,动物细胞多分泌到细胞外培养液,植物细胞多为胞内产物,微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外,对于胞内产物需要搜集菌体或细胞进行破碎。,3,细胞破碎专业知识讲座,第3页,概述,大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。,有些目标产物存在于生物体中。,尤其是由基因工程菌产生大多数蛋白质是在细胞内沉积。,脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。,4,细胞破碎专业知识讲座,第4页,概 述,细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包含目标产物成份释放出来技术。,细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成非分泌型生化物质（产品）基础。,为了研究细胞破碎，提升其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁组成和结构。,5,细胞破碎专业知识讲座,第5页,15.1,细胞壁结构对破碎影响,微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。,通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，所以细胞破碎阻力主要来自于细胞壁。,不一样细胞壁结构和组成不完全相同，故细胞壁机械强度不一样，细胞破碎难易程度也就不一样。,6,细胞破碎专业知识讲座,第6页,细菌细胞壁结构,几乎全部细菌细胞壁都是由肽聚糖组成，它是难溶性聚糖链；,相邻聚糖链上短肽又交叉相联，组成了细胞壁三维网状结构，包围在细胞周围；,使细胞含有一定形状和强度。,7,细胞破碎专业知识讲座,第7页,细菌细胞壁结构,破碎细菌主要阻力是来自于,肽聚糖网状结构，,其网结构致密程度和强度取决于聚糖链上所存在肽键数量和其交联程度。,革兰氏阴性菌细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不一样。,革兰氏阴性菌经典生物是大肠杆菌，经过这种细胞生产了很多细胞重组产物。,药品名称,宿主,用途,胰岛素,大肠杆菌,治疗糖尿病,人生长激素,大肠杆菌,治疗侏儒病,-干扰素,大肠杆菌,治疗毛状细胞白血病等,8,细胞破碎专业知识讲座,第8页,酵母细胞壁结构示意图,最里层是由葡聚糖细纤维组成，它组成了细胞壁刚性骨架，使细胞含有一定形状，,上面是一层糖蛋白，,最外层是甘露聚糖，由1,6-磷酸二酯键连接成网状。在该层内部，有甘露聚糖-酶复合物。,破碎酵母细胞壁阻力主要决定于壁结构交联紧密程度和它厚度。,9,细胞破碎专业知识讲座,第9页,真菌细胞壁,真菌细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次还含有较少许蛋白质和脂类。,不一样真菌，细胞壁组成有很大不一样，其中大多数真菌多糖壁是由几丁质和葡聚糖组成，少数含纤维素。,与酵母和细菌细胞壁一样，真菌细胞壁强度和聚合物网状结构相关，不但如此，它还含有几丁质或纤维素纤维状结构，所以强度有所提升。,10,细胞破碎专业知识讲座,第10页,红面包霉菌细胞壁含有同心圆层状结构主要存在三种聚合物,最外层(a)是-和-葡聚糖混合物，,第2层(b)是糖蛋白网状结构,第3层(c)主要是蛋白质，,最内层(d)主要是几丁质。,红面包霉菌细胞壁结构示意图,11,细胞破碎专业知识讲座,第11页,微生物,革兰氏,阳性细菌,革兰氏,阴性细菌,酵母菌,霉菌,壁厚,20-80 nm,10-13 nm,100-300nm,100-250nm,层次,单层,多层,多层,多层,主要,组成,肽聚糖(40-90%),多糖,胞壁酸,蛋白质,脂多糖(1-4%),肽聚糖(5-10%),脂蛋白,脂多糖(11-22%),磷脂,蛋白质,葡聚糖(30-40%),甘露聚糖(30%),蛋白质(6-8%),脂类(8.5-13.5%),多聚糖,(80-90%),脂类,蛋白质,细胞壁组成和结构,微生物,革兰氏,阳性细菌,革兰氏,阴性细菌,酵母菌,真菌,壁厚,20-80 nm,10-13 nm,100-300nm,100-250nm,层次,单层,多层,多层,多层,主要,组成,肽聚糖(40-90%),多糖,胞壁酸,蛋白质,脂多糖(1-4%),肽聚糖(5-10%),脂蛋白,脂多糖(11-22%),磷脂,蛋白质,葡聚糖(30-40%),甘露聚糖(30%),蛋白质(6-8%),脂类(8.5-13.5%),多聚糖,(80-90%),脂类,蛋白质,细胞壁组成和结构,12,细胞破碎专业知识讲座,第12页,植物细胞壁结构,对于已生长结束植物细胞壁可分为,初生壁和次生壁两部分。,初生壁是细胞生长久形成。初生壁普通较薄（13m），富有弹性。,由多糖和蛋白质组成，多糖主要成份为纤维素、半纤维素和果胶类物质。纤维素是长链D-葡聚糖，许多这么长链形成微纤丝。,它是组成细胞壁骨架，细胞壁机械强度主要来自于微纤丝。,13,细胞破碎专业知识讲座,第13页,植物次生细胞壁,一些植物细胞，当生长停顿后，在细胞质和初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁普通较厚(4m以上)，常有三层组成。,在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素沉积。,所以次生壁形成提升了细胞壁坚硬性，使植物细胞含有很高机械强度。,14,细胞破碎专业知识讲座,第14页,研 磨,15.2 细胞破碎技术,15,细胞破碎专业知识讲座,第15页,机械破碎,捣碎法,研磨法,匀浆法,超声法,物理破碎,温度差破碎法,压力差破碎法,化学破碎,有机溶剂：,表面活性剂：,酸碱,酶促破碎,自溶法,外加酶制剂法,经过机械运动产生剪切力，使组织、细胞破碎。,经过各种物理原因作用，使组织、细胞外层结构破坏，而使细胞破碎。,经过各种化学试剂对细胞膜作用，而使细胞破碎,经过细胞本身酶系或外加酶制剂催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而到达细胞破碎,细胞破碎方法及其原理,16,细胞破碎专业知识讲座,第16页,一机械法,机械破碎法又可分为,高压匀浆破碎法（homogenization）,高速珠研磨破碎法（bead grinding）,超声波破碎法（ultrasonication）,17,细胞破碎专业知识讲座,第17页,采取高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）。,1.,高压匀浆法,（High-pressure homogenization）,细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出浆液又射到静止撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了高速剪切、碰撞及压力骤降，造成细胞破碎。,18,细胞破碎专业知识讲座,第18页,19,细胞破碎专业知识讲座,第19页,高压匀浆器种类,高压匀浆器种类较多,：,WAB企业AVP Gaulin 31MR型,Bran and luebbe 企业SHL40型,意大利Niro Soavi,高压匀浆机,20,细胞破碎专业知识讲座,第20页,高压匀浆法使用时注意事项,高压匀浆器操作温度上升约-/10MPa为了控制温度升高，可在进口处用干冰调整温度，使出口温度调整在20左右。,能够采取单次经过匀浆器或屡次循环经过等方式。,在工业规模细胞破碎中，对于酵母等难破碎及浓度高或处于生长静止期细胞，常采取屡次循环操作方法。,21,细胞破碎专业知识讲座,第21页,高压匀浆法适用范围,大规模细胞破碎惯用方法,高压匀浆法适用范围：,酵母和大多数细菌细胞破碎；,料液细胞浓度能够很高，20%左右。,不宜使用高压匀浆法。,易造成堵塞团状或丝状真菌，,较小革兰氏阳性菌，,含有包含体基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）,22,细胞破碎专业知识讲座,第22页,影响高压匀浆器细胞破碎原因,被破碎细胞分率符合以下公式：,ln1/(1-R)=KNP,(15-1),式中 R 破碎率，为N次循环后，蛋白质释放量Rn与最大释放量Rm之比；,K 与温度相关速度常数；,P 操作压力，MPa；,与微生物种类相关常数。,23,细胞破碎专业知识讲座,第23页,升高压力有利于破碎，,降低细胞循环次数，甚至一次经过匀浆阀就可到达几乎完全破碎，这么就可防止细胞碎片不至过小。,但p大到一定值时对匀浆器磨损增加，也有试验表明p超生一定值时，R增加但很慢。,在工业生产中，通常采取压力为5570Mpa。,破碎性能还随菌体种类和生长环境不一样而不一样,大肠杆菌细胞比酵母细胞轻易破碎，,生长在简单合成培养基上大肠杆菌比生长在复杂培养基上轻易破碎。,影响高压匀浆器细胞破碎原因,24,细胞破碎专业知识讲座,第24页,高压匀浆法-X-挤压器,改进高压方法：将浓缩菌体悬液冷却至-25至-30形成冰晶体，利用500MPa以上高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。,细胞破碎是因为冰晶体在受压时相变，包埋在冰中细胞变形所引发。,主要用于试验室中。,优点是适用范围广，破碎率高，细胞碎片粉碎程度低以及活性保留率高,对冷冻一融解敏感生化物质不适用。,25,细胞破碎专业知识讲座,第25页,2）珠磨法 bead mill,珠磨是惯用方法,细胞悬浮液与极细玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间相互剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。,在工业规模破碎中，常采取高速珠磨机,WSK卧式高效全能珠磨机,26,细胞破碎专业知识讲座,第26页,高速珠磨机工作原理,磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上园盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动；,细胞破碎是由剪切力层之间碰撞和磨料滚动引发,在出口处，旋转园盘和出口平,板之间狭缝很小，可阻挡玻,离小珠，使不被料液带出。,因为操作过程中会产生热量，,故磨室还装有冷却夹套，以冷,却细胞悬浮液和玻离小珠。,27,细胞破碎专业知识讲座,第27页,Netzsch LM-20型珠磨机,A-含有冷却夹套圆筒形磨室,B-含有冷却装置搅拌轴和圆盘,C-环形震动侠缝分离器,D-变速马达,1和2料液进出口,3和4 搅拌冷却剂进出口,5和6磨室冷却剂进出口,园盘以两种位置交织地安装在轴上，,一个处于径向，一个与轴倾斜，,径向盘使磨料沿径向运动，倾斜盘则产生轴向运动。,因为交织运动，提升了破碎效率。,28,细胞破碎专业知识讲座,第28页,珠磨机破碎作用方程,破碎作用是相对于时间一级反应速度过程，符合以下公式：,ln1/(1-R)=Kt 15-2,R 破碎率；K一 一级反应速度常数；t一 时间。,K与搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环速度、玻璃小珠装量和珠体直径，以及温度等相关。,珠磨法破碎率普通控制在80%以下：降低能耗、降低大分子目标产物失活、降低因为高破碎率产生细胞小碎片不易分离而给后续操作带来困难。,29,细胞破碎专业知识讲座,第29页,3）超声波破碎,超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波振荡器发射15-25kHz超声波探头处理细胞悬浮液。,超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，普通破碎效果后者比前者好。,超声波细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波声频、声能相关。,30,细胞破碎专业知识讲座,第30页,超声波破碎机理,JY92-II D超声波,细胞粉碎机,普通认为在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation),液体中局部空穴形成、增大和闭合产生极大冲击波和剪切力，引发粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。,操作过程产生大量热，所以操作需在冰水或外部冷却容器中进行。,31,细胞破碎专业知识讲座,第31页,超声波破碎适用范围,超声波破碎是很强烈破碎方法，适合用于多数微生物破碎。,普通杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌效果较差。,但超声波产生化学自由基团能使一些敏感性活性物质失活。,超声波破碎有效能量利用率极低,因为对冷却要求相当苛刻，所以不易放大，但,在试验室小规模细胞破碎中惯用,。,32,细胞破碎专业知识讲座,第32页,技术,原理,效果,成本,举例,匀浆法(孔型),须使细胞经过小孔，使细胞受到剪切力而破碎,猛烈,适中,细胞悬浮液大规模处理,珠磨破碎法,细胞被玻璃珠或铁珠捣碎,猛烈,廉价,细胞悬浮液和植物细胞大规模处理,超声波法,用超声波空穴作用使细胞破碎,适中,昂贵,细胞悬浮液小规模处理,研磨法,细胞被研磨物磨碎,适中,廉价,匀浆法(片型),细胞被搅拌器劈碎,适中,适中,动物组织及动物细胞,不一样机械破碎方法比较,33,细胞破碎专业知识讲座,第33页,非机械破碎方法,酶溶破碎法（enzyme lysis）,化学破碎法（chemical treatment）,去垢剂破碎法（detergents）,渗透压冲击破碎法（osmotic shock）,冻融破碎法（freezing and thawing）,34,细胞破碎专业知识讲座,第34页,二 非机械法,非机械方法很多,1 酶解,2 化学法溶胞,3 物理法,渗透压冲击,冻结和融化,干燥法,其中酶法和化学法溶胞应用最广,。,二,35,细胞破碎专业知识讲座,第35页,1 酶解,（酶溶法 Enymatic lysis),酶解是利用溶解细胞壁酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。,1）外加酶法,惯用溶酶,溶菌酶、,-1，3-葡聚糖酶、,-1，6-葡聚糖酶、,蛋白酶、,甘露糖酶、,糖苷酶、,肽键内切酶、,壳多糖酶等,36,细胞破碎专业知识讲座,第36页,外加酶法,酶解法特点是专一性强，所以在选择酶系统时，必须依据细胞结构和化学组成来选择。,溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子-1,4糖苷键，所以主要用于细菌类细胞壁裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采取溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTA一起使用。,放线菌细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成份，所以也能采取溶菌酶，,酵母和真菌因为细胞壁组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，惯用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。,植物细胞壁主要成份是纤维素，常采取纤维素酶和半纤维素酶裂解。,37,细胞破碎专业知识讲座,第37页,外加酶法,有时采取几个酶混合物会产生更加好效果，加入时需确定对应次序。,对酵母细胞采取酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露葡聚糖层，最终只剩下原生质体，这时若缓冲液渗透压改变，则细胞膜破裂，释出胞内产物。,38,细胞破碎专业知识讲座,第38页,酶解法特点,优点：,发生酶解条件温和,能选择性地释放产物,胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整,缺点：,溶酶价格高，,溶酶法通用性差（不一样菌种需选择不一样酶),产物抑制存在。,39,细胞破碎专业知识讲座,第39页,酶解-自溶作用,自溶作用是酶解另一个方法，,利用生物体本身产生酶来溶胞，而不需外加其它酶,。,在微生物代谢过程中，大多数都能产生一个能水解细胞壁上聚合物酶，方便生长过程继续下去。,自溶作用：改变其生长环境（温度、缓冲液），能够诱发产生过剩这种酶或激发产生其它自溶酶，以到达自溶目标。,缺点是：易引发所需蛋白质变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,40,细胞破碎专业知识讲座,第40页,一些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，能够改变细胞壁或膜通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。,2 化学渗透法,（,Chemical permeation）,该法取决于化学试剂类型以及细胞壁膜结构与组成。,41,细胞破碎专业知识讲座,第41页,酸处理能够使蛋白质水解成氨基酸，通常采取6mol/L HCl。,碱能溶解细胞壁上脂类物质或使一些组分从细胞内渗漏出来。,成本低，反应激烈，不具选择性。,（1）酸、碱处理法,42,细胞破碎专业知识讲座,第42页,细胞破碎惯用表面活性剂：,十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；。,非离子型如Triton X-100和吐温（Tween）等,对疏水性物质含有很强亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜磷脂双分子层，使一些胞内物质释放出来。,（2）表面活性剂,不论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性，既能和水作用也能和脂作用，,能与细胞壁上脂蛋白结合，形成微泡，使膜通透性增加或溶解,43,细胞破碎专业知识讲座,第43页,能分解细胞壁中磷脂，使细胞结构破坏，胞内物质被释放出来。,有机溶剂可采取丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等,（3）有机溶剂,（4）EDTA螯合剂,处理G-细菌，对细胞壁外层有破坏作用。,G-细菌壁外层结构通常靠二价阳离子Ca,2+,或Mg,2+,结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca,2+,或Mg,2+,螯合，大量脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。,44,细胞破碎专业知识讲座,第44页,通用性差；,时间长，效率低，普通胞内物质释放率不超出50%；,有些化学试剂有毒。,化学试剂加入常会给随即产物纯化带来困难，并影响最终产物纯度,化学渗透法特点：,缺点,对产物释放有一定选择性，可使一些较小分子量溶质如多肽和小分子酶蛋白透过，而核酸等大分子量物质仍滞留在胞内；,细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和深入提取。,优点,45,细胞破碎专业知识讲座,第45页,3 物理法,渗透压冲击法,冻结-融化法,干燥法,46,细胞破碎专业知识讲座,第46页,1）渗透压冲击法,渗透压冲击是较温和一个破碎方法，,将细胞放在高渗透压溶液中（如一定浓度甘油或蔗糖溶液），因为渗透压作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当到达平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，因为渗透压突然改变，胞外水快速渗透胞内，引发细胞快速膨胀而破裂。,仅适合用于细胞壁较脆弱细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入一些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺点，强度减弱。,47,细胞破碎专业知识讲座,第47页,2）冻结-融化法,将细胞放在低温下冷冻（约-15），然后在室温中融化，重复屡次而到达破壁作用。,首先能使细胞膜疏水键结构破裂，从而增加细胞亲水性能，,另首先胞内水结晶，形成冰晶粒，引发细胞膨胀而破裂。,适合用于细胞壁较脆弱菌体，破碎率较低，需重复屡次，另外，在冻融过程中可能引发一些蛋白质变性。,48,细胞破碎专业知识讲座,第48页,使细胞结合水分丧失，从而改变细胞渗透性。当采取丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就轻易被抽提出来。,气流干燥主要适合用于酵母菌，普通在25-30气流中吹干；,真空干燥多用于细菌。,冷冻干燥适合用于不稳定生化物质,3）干燥法,气流干燥,真空干燥,喷雾干燥,冷冻干燥,49,细胞破碎专业知识讲座,第49页,50,细胞破碎专业知识讲座,第50页,选择破碎方法依据：,细胞处理量；,细胞壁强度和结构(高聚物交联程度、种类和壁厚度)；,目标产物对破碎条件敏感性；,破碎程度；,目标产物选择性释放,51,细胞破碎专业知识讲座,第51页,选择性释放目标产物普通标准,仅破坏或破碎存在目标产物位置周围,当目标产物存在于细胞膜附近时，可采取较混和方法，如酶溶法、渗透压冲击法和冻结融化法等。当目标产物存在于细胞质内时，则需采取强烈机械破碎法,当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合状态时，调整溶液PH值，离子强度或添加与目标产物含有亲和性试剂如：螯合剂、表面活性剂等，使目标产物轻易溶解释放。,(2),机械破碎法和化学法并用可使操作条件愈加温和，在相同目标产物释放率条件下，降低细胞破碎程度。,52,细胞破碎专业知识讲座,第52页,讨论题：青霉素酰化酶细胞破碎研究 一.化学法,20%(W/V)大肠杆菌悬浮液+B.A 37搅拌 高速离心 测上清液酶活。,1.处理时间,R%,2.5h,2.丁酯用量,条件：37，搅拌3小时,适宜B.A加量为12%，,释放率,R=55%,12%,55%,R,12%,2.03U/mg,比活,53,细胞破碎专业知识讲座,第53页,二,.,化学法冻融法结合,加B.A(12%,37搅拌3h）菌悬液 冻融(冻结14h 融化),释放率,70%；比活2.69 u/mg,三.化学超声波振荡法结合,先丁酯处理，再超声波（90秒），,释放率,72%,小型设备，不能工业大规模生产。,四.高压匀浆法,20%(W/V)菌悬液，P=50MPa，N=3。,释放率,R=38.4%，,原因:细胞破碎后,仍有较多酶吸附在细胞碎片上。,五.高压匀浆化学法结合,先高压匀浆，再加10%丁酯，37搅拌3h，高速离心(3万rpm)，,释放率,：R=60%,六.珠磨,直径0.4mm玻璃珠。,释放率,：R=95%,54,细胞破碎专业知识讲座,第54页,破碎率测定,细胞破碎后，大量带电荷内含物被释放到水相，使导电率上升。,直接测定法,目标产物测定法,导电率测定法,采取染色法把破碎细胞与未破碎细胞区分开来。,如破碎革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌颜色；,采取革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整细胞呈紫色，而受损害细胞呈亮红色。,将破碎后细胞悬浮液离心，测定上清液中目标产物含量或活性，并与100%破碎率标准值比较，计算其破碎率。,55,细胞破碎专业知识讲座,第55页,破碎技术研究方向,各种破碎方法相结合,化学法、酶法、机械法相结合。,酶法与高压匀浆、超声波震荡、鳌合剂、渗透压法结合,如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa压力下匀浆4次，总破碎率靠近100%。而单独采取高压匀浆法，一样条件下破碎率只有32%。,有机溶剂与冻融法、干燥法结合,56,细胞破碎专业知识讲座,第56页,破碎技术研究方向-,与上游过程相结合,在发酵培养过程中，培养基、生长久、操作参数（如pH、温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等原因都对细胞壁膜结构与组成有一定影响。,在生长后期，加入一些能抑制或阻止细胞壁物质合成抑制剂(如青霉素)，继续培养一段时间后，新分裂细胞其细胞壁有缺点，利于破碎；,选择较易破碎菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌；,用基因工程方法对菌种进行改造，如在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。,57,细胞破碎专业知识讲座,第57页,破碎技术研究方向-与下游工程相结合,举例：萃取破碎法提取酵母醇脱氢酶,58,细胞破碎专业知识讲座,第58页,（inclusion bodies IBs),15.4 基因工程包含体纯化,基因工程菌培养液不一样表示形式前处理,胞外分泌型表示：离心,搜集液相浓缩纯化。,胞内表示：,胞内可溶性表示：离心,搜集菌体细胞破碎离心，搜集上清纯化,胞内周质表示：离心,搜集菌体低浓度溶菌酶或渗透压冲击等溶解目标物离心,搜集上清液纯化。,不溶性包涵体：离心,搜集菌体细胞破碎离心,搜集沉淀包涵体洗涤目标蛋白变性溶解复性纯化。,59,细胞破碎专业知识讲座,第59页,外源蛋白在大肠杆菌中积累,蛋白,产物占菌体总蛋白,外源蛋白积累,人胰岛素,50%,形成包涵体,-丙酰胺酶,20%,在细胞间区,-人体干扰素,25%,形成包涵体,凝乳酶原,形成包涵体,牛生长激素,30%,形成包涵体,-内酰胺酶,形成间区包涵体,人胰岛素原,5%26%,形成包涵体,60,细胞破碎专业知识讲座,第60页,包涵体：一个蛋白质不溶性聚集体，包含目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白一级结构是正确，但立体结构是错误，所以没有生物活性。,包涵体形成：大肠杆菌中目标产物表示水平过高，超出正常代谢水平，过多表示产物聚集在细胞内，形成不溶性包涵体。,高表示产生积聚物在细胞内部形成不溶物原因？,蛋白过量积聚，超出溶解度，造成沉淀；,蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；,蛋白生成太快，分子内部二硫键错误连接造成沉淀；,表示蛋白过多，与其结合/诱导组分不足，不能形成溶解状态,蛋白质本身不稳定。,包含体组成,61,细胞破碎专业知识讲座,第61页,基因工程包涵体纯化方法,搜集菌体细胞,细胞破碎,包涵体,洗涤,目标蛋白变性溶解,目标蛋白复性,包含体出现不但增加了生物分离设计难度，也为蛋白质折叠机理研究提出了新课题。,欲取得天然活性态目标产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中目标蛋白恢复应有天然活性。,62,细胞破碎专业知识讲座,第62页,包涵体取得几个常见工艺路线(一),机械破碎,(高压匀浆、高速珠磨）,离心提取包含体,加变性剂溶解,除变性剂复性,63,细胞破碎专业知识讲座,第63页,特点:,是利用了包含体与细胞碎片密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，取得了洁净包含体，再对包含体溶解复性。,优点：,摆脱了大量杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面分离纯化简单了。从这个角度上讲，包含体形成对分离纯化亦有好处。,缺点:,要经过几次离心才能除去大部分细胞碎片，加工时间较长。,路线1 特点,64,细胞破碎专业知识讲座,第64页,包涵体取得,几个常见工艺路线（二）,机械破碎,膜分离取得包涵体,加变性剂溶解包含体,除变性剂复性,65,细胞破碎专业知识讲座,第65页,路线（二）应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质。,优点是封闭式操作，不污染环境也不受环境污染，能量消耗也比离心法少。,缺点：细胞碎片和包含体一起被膜挡住，难以分开；而且膜堵塞和浓差极化经常造成可溶性蛋白质滞留。,路线2 特点,66,细胞破碎专业知识讲座,第66页,包涵体取得,几个常见工艺路线（三）,化学破碎,（加变性剂）,离心除细胞碎片,除变性剂复性,67,细胞破碎专业知识讲座,第67页,用化学法破碎，所采取试剂既能够破碎又能够溶解包含体，将两道工序和为一道，节约了设备和时间，比前二者更适合于试验室操作。,缺点是全部可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分离带来困难。,路线三：,68,细胞破碎专业知识讲座,第68页,1）包涵体洗涤,细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。,洗涤主要性：,搜集沉淀中，除包涵体外，还包含许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。,洗涤剂：,温和表面活性剂、蔗糖、低浓度弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。,洗涤剂浓度,以溶解杂质，不溶解包涵体中表示产物为标准。,69,细胞破碎专业知识讲座,第69页,2）目标蛋白变性溶解,包涵体中不溶性目标蛋白必须溶解到液相中，才能深入纯化。普通水溶液极难将其溶解，只有采取蛋白质变性才能使其形成可溶性形式。,惯用变性剂：,5-8 mol/L盐酸胍和6-8 mol/L尿素,作用：破坏离子间相互作用；,表面活性剂如1-2 SDS，,作用：破坏蛋白质肽链间疏水相互作用。,PH9.0碱溶液和有机溶剂，使用较少。,影响变性原因：时间、pH、离子强度、变性剂种类和浓度。,70,细胞破碎专业知识讲座,第70页,原理：,在变性剂溶液中，溶解蛋白质呈变性状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成含有活性正确构型，该过程称复性。,复性方法：,稀释法除变性剂 加入大量水或缓冲液。,膜分离法除变性剂 透析、超滤、电渗析。,层析法：凝胶层析，,高效疏水层析,3）目标蛋白复性,71,细胞破碎专业知识讲座,第71页,蛋白质复性影响原因：,变性剂浓度,目标蛋白浓度；,pH和离子强度；,氧化还原条件。,还原剂：,二硫苏糖醇、-巯基乙醇、还原型谷胱甘肽；,氧化剂：,氧化型谷胱甘肽;,碱性下通空气。,复性区,多聚物生成区,絮凝沉淀区,盐酸胍浓度mol/L,红血球碳酐酶复性操作中变性剂,与蛋白质浓度对复性影响,蛋白质浓度 mol/L,72,细胞破碎专业知识讲座,第72页,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白在E.coli中高密度发酵过程中以两种形式表示：,细胞内有活性可溶性蛋白形式（约占目标蛋白30%）,无活性包涵体形式（约占目标蛋白70%）。,悬浮破壁,PBS,洗涤,离心,硫铵沉淀,亲和层析,阳离子交换层析,溶解,复性,亲和层析,湿菌体,发酵液,洁净菌体,上清液,包涵体,纯品,活性检测,破壁液,离心,离心液,洗涤,举例：TRAIL分离纯化,73,细胞破碎专业知识讲座,第73页,1.包涵体洗涤,粗制包涵体用 50mM磷酸盐缓冲液，含150mM NaCl pH=7.4(1:3 w/v),洗涤2-3次；,用含有1M NaCl磷酸缓冲液洗涤1次(1:3 w/v)，将粘附其表面大部,分蛋白及水溶性杂质除去；,用6M尿素及0.5%TritonX-100 联合洗涤1次(1:3 w/v)，去除另一些,杂蛋白，这时得较纯包涵体（纯度达80%左右）；,用SDS-PAGE电泳检测纯度。,2.包涵体变性溶解,洗涤后包涵体用含有30mM DTT及5mol/l盐酸胍Tris 缓冲液 pH=8.0,(1:5 w/v)变性溶解 室温搅拌2h，95%以上包涵体可被溶解；,离心，13000rpm，20min 弃沉淀得到溶解液。,74,细胞破碎专业知识讲座,第74页,3.包涵体复性（间歇式流加稀释复性法）,以含DTT和ZnSO4Tris-HCl为复性缓冲液，再添加0.4M L-Arg，0.5M尿素，0.5M NaCl作为蛋白聚集抑制剂，,变性溶解液可屡次流加，每次流加时间是以上一次流加蛋白已到达部分复性为准。本试验中，流加间隔时间确定为90min，每次流加浓度为150mg/L，变性液流加次数可高达6次，最终浓度可到达1mg/ml，4迟缓搅拌一段时间，,对50mM Tris-HCl，300mM NaCl，0.1M尿素及0.2mM ZnSO4 混合液透析过夜，透析后离心除去复性过程中聚集蛋白，,超滤浓缩（也可用硫酸铵沉淀进行浓缩）得复性蛋白液。,75,细胞破碎专业知识讲座,第75页,5.复性后纯化,复性浓缩后蛋白,金属亲和层析,吸附,洗涤：40mmol/L咪唑，洗除非特异性吸附杂蛋白,洗脱：100mmol/L咪唑,目标蛋白,纯度达95%以上（由SDS-PAGE和RP-HPLC判定）,收率75%,76,细胞破碎专业知识讲座,第76页,包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）,77,细胞破碎专业知识讲座,第77页,来自发酵罐菌体经过离心除去培养液后加入缓冲液悬浮，通入高压匀浆器重复破碎三次。匀浆经过离心和水洗除去细胞碎片，再添加溶菌酶、EDTA和促进剂以除去脂蛋白和未破碎细胞。包含体经离心沉淀和水洗后进行变性溶解，溶解剂为6mol/L盐酸胍。溶解同时通入空气氧化以打断错误连接双硫键。离心除去沉淀，含变性蛋白质上清液经超滤浓缩后过凝胶柱除去杂蛋白，再加入复性缓冲液进行透析复性。复性过程中产生絮凝沉淀用离心除去。,包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）,78,细胞破碎专业知识讲座,第78页,