生物化学第9章兰州大学经典课件酶促反应动力学.ppt

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ES,。,酶以,E,和,ES,两种状态存在。,根据平衡学说推导速度方程,设V,f,为E与S结合的速度，V,r,为ES解离的速度，则,V,f,k,1,(E,0,ES)(SES),V,r,k,2,ES,平衡时,V,f,V,r,k,1,(E,0,ES)(S,ES),k,2,ES,又,S,ES,S,ES,S,根据平衡学说推导速度方程,k,1,(E,0,ES)S,k,2,ES,解出,ES,得,令,，,则,根据平衡学说推导速度方程,由于,V=k,3,ES,，代入前式,得,因为当所有的,E,都成为,ES,时，可达最大反应速度，即,V,m,=k,3,E,0,，所以,这就是米氏方程。,米氏方程,米氏方程是一个双曲线方程，若以,S,为自变量，,V,为因变量，可以作出双曲线，与实验测得的结果相符。,（2）稳态理论,1925年，Briggs和Haldane提出了稳态（steady state）理论，对米氏方程做了一项很重要的修正：,在 反应式中，k,3,值不小，后一步骤不是限速步骤。,所谓稳态是指反应进行一段时间后，系统中的酶底物复合物浓度由零逐渐增加到一定数值，然后保持不变，即处于稳态水平，,此时ES的解离和分解速率之和等于ES的形成速率,，,根据稳态学说推导速度方程,产生ES的速率,消耗ES的速率,稳态时,所以,根据稳态学说推导速度方程,移项得,令,，代入上式得,将上式中的,ES,解出得,此,ES,即为稳态时的复合物浓度。,根据稳态学说推导速度方程,因为酶反应速率与,ES,成正比，即,所以,又因为当所有的酶都与底物结合形成复合物时，反应速率达到最大，即 ，代入上式得,（稳态法）,（快速平衡法）,两个米氏方程的区别,这两个方程的区别就在于快速平衡法推导的方程中米氏常数是,Ks，而稳态法推导的米氏方程中米氏常数是K,m,。,Ks,是,ES,的解离平衡常数,米氏方程的几个特点,从米氏方程中可以看出：,当,S K,m,时，反应速率达到最大，并与底物浓度无关，属零级反应；,当,S=K,m,时，所以，,K,m,的意义是使反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度。,米氏方程曲线,米氏常数的意义,K,m,是酶的特征性常数，其单位是浓度单位。在一定的反应条件下，对于一定的底物，K,m,是定值。,K,m,可以判断酶的天然底物。有些酶可以作用于几个底物，其中K,m,最小的底物是天然底物。,当k,3,K,m,时，,V=V,m,=k,3,E,0,，此时对底物来说是零级反应，对酶来说是一级反应，,k,3,是一级反应速率常数，,k,3,表示当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数（又称为转换数），这时的,k,3,又可以写成,k,cat,，,k,cat,越大，说明酶,的催化效率越高。,k,cat,/,K,m,的意义,K,cat,/,K,m,表示酶的催化效率，,K,cat,/,K,m,越大，催化效率越高。，其最大值极限是,k,1,，而,k,1,是酶与底物结合的速率常数，此常数受到底物在溶液中扩散速度的影响。,作图法求,K,m,和,V,m,值,（,Lineweaver-Burk,双倒数作图法）,将米氏方程两边取倒数得,在一系列S下测出相应的反应速率v，以,对 作图，可得出K,m,和V,m,值。,米氏方程的双倒数图,多底物的酶促反应动力学,（,酶促反应按底物分子数的分类,）,底物数,酶分类,催化反应,酶种类占总酶百分数,单底物,单向单底物,假单底物,异构酶,裂合酶,水解酶,A B,A B+C,A-B+H,2,O AOH+BH,5%,12%,26%,双底物,氧化还原酶,转移酶,AH,2,B A+BH,2,A,2+,+B,3+,A,3+,+B,2+,A+BX AX+B,27%,24%,三底物,连接酶,A+B+ATP AB+ADP+Pi,A+B+ATP AB+AMP+PPi,6%,多底物反应按动力学机制分类,（,序列反应,）,底物的结合和产物的释放有一定的顺序：,E+A+BEABEPQE+P+Q,产物不能在两种底物都结合之前释放。这类反应又可以分为两种类型。,有序反应,（,ordered reaction,）,其中,P是B转变的产物，Q是A转变的产物。,如脱氢酶的辅酶NAD(P),+,相当于A，NAD(P)H相当于Q。,随机反应,（,random reaction,）,如肌酸激酶催化肌酸与ATP反应生成磷酸肌酸和ADP。,乒乓反应,（,ping pong reaction,）,如转氨酶催化转氨反应：,氨基酸1,酮酸2,酮酸1,氨基酸2,A B P Q,三、酶的抑制作用,因酶蛋白变性而酶活力丧失称为酶的失活作用，而因为某种物质与酶结合使酶活力丧失称为酶的抑制作用，酶受抑制丧失活力时酶蛋白并没有变性。能抑制酶活力的物质称为酶的抑制剂（inhibitor）。,研究酶的抑制作用是研究酶的结构和功能、酶的催化机制，以及阐明代谢途径的基本手段，也可以为医药设计新药物和为新农药的研制提供理论依据。,抑制程度的表示方法,（,1,）相对活力分数（残余活力分数）,（,2,）相对活力百分数（残余活力百分数）,（,3,）抑制分数（被抑制而失去活力的分数）,（,4,）抑制百分数,抑制作用的类型,1不可逆抑制作用（irreversible inhibition）,抑制剂与酶活性的某些基团以共价键结合，不能用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除。,2可逆抑制作用（reversible inhibition）,抑制剂与酶活性的某些基团以非共价键结合，可以用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除而使酶恢复活力。,可逆抑制作用的,3,种类型,（,1,）竞争性抑制（competitive inhibition）,I,和,S,竞争与酶的活性中心结合，二者只能结合一个。竞争性抑制剂通常是底物类似物，它可以与酶结合，但不能被酶催化发生反应。,竞争性抑制剂举例,可逆抑制作用的,3,种类型,（,2,）非竞争性抑制（noncompetitive inhibition）,I,与,S,可以分别与酶结合，谁先结合都可以，形成,ESI,三元复合物，但,ESI,中的,S,不能转变成产物。这类,抑制剂是与酶活性中心之外的某个部位结合。,竞争性和非竞争性抑制剂的抑制机理,可逆抑制作用的,3,种类型,（3）反竞争性抑制剂（uncompetitive inhibition）,I,只与,ES,结合，只有,ES,能分解出产物，,ESI,中的,S,不能转变成产物。由于,I,的存在促进了,E,和,S,的结合，所以称为反竞争性抑制。,可逆抑制作用和不可逆抑制作用的动力学鉴别,在反应系统中加入一定量的抑制剂，以及不同量的酶，测定反应速率与酶量的关系。斜率较小的直线是可逆抑制剂，不通过原点但斜率与对照相同的是不可逆抑制剂。,1.control,2.i,rreversible inhibitor,3.reversible inhibitor,可逆抑制作用和不可逆抑制作用的动力学鉴别,在反应系统中加入不同量的酶及抑制剂，作不同抑制剂浓度下反应速率对酶量的直线。可逆抑制剂得到的是一组通过原点但斜率不同的直线，不可逆抑制剂得到的是一组不通过原点但斜率与对照相同的平行线。,一些重要的不可逆抑制剂,（1）非专一性不可逆抑制剂,有机磷化合物,有机汞、有机砷化合物,重金属盐,烷化试剂,氰化物、硫化物和,CO,青霉素,（2）专一性不可逆抑制剂,Ks,型不可逆抑制剂,K,cat,型不可逆抑制剂,有机磷化合物,很多农药是有机磷化合物，它们能抑制某些蛋白酶及酯酶的活力，与酶分子活性部位的丝氨酸羟基共价结合而使酶失活。这类化合物强烈地抑制胆碱酯酶活力，使乙酰胆碱不能水解成乙酸和胆碱，导致乙酰胆碱积累，引起神经中毒症状。所以这类化合物又称为神经毒剂。用解磷定（碘化醛肟甲基吡啶）或氯磷定（氯化醛肟甲基吡啶）能把酶上的毒剂夺取下来，使酶恢复活力，达到解毒的作用。,有机磷化合物,解磷定的解毒机理,有机汞化合物,有机汞化合物能与酶的巯基结合而使酶失活。,过量的半胱氨酸或还原型谷胱甘肽,能解毒。,有机砷化合物,有机砷化合物能与酶的巯基结合而使酶失活。,BAL,（二巯基丙醇）能解毒。,路易斯毒气,为了六十一个阶级兄弟,重金属盐,Ag,+,、,Cu,2+,、,Hg,2+,、,Pb,2+,、,Fe,3+,在高浓度时能使酶蛋白变性，低浓度时抑制某些酶的活力。可用金属螯合剂,EDTA,、半胱氨酸等螯合除去重金属离子。,烷化试剂含有一个活泼的卤素离子，能够修饰酶分子中的许多基团，如巯基、氨基、羧基、咪唑基及硫醚基等。,烷化试剂,氰化物、硫化物和,CO,氰化物能与细胞色素氧化酶中的,Fe,2+,结合，使酶失活不能呼吸。CO与血红蛋白结合阻止氧运输。硫化物能与多种含金属的酶形成,较为稳定的络合物，使酶失活。,糖肽转肽酶在细菌细胞壁合成中使肽聚糖链交联。青霉素与糖肽转肽酶的丝氨酸羟基结合，使细菌细胞壁不能合成。,青霉素,青霉素的抗菌机理,Ks,型不可逆抑制剂,此类抑制剂结构与底物类似，并带有高反应性基团，与酶活性部位结合后，修饰活性部位的基团使酶失活。主要修饰活性部位，其它部位也可能修饰。,胰蛋白酶的人工底物,胰蛋白酶的,Ks,型抑制剂,K,cat,型不可逆抑制剂,此类抑制剂不但结构与底物类似，而且需要经酶催化反应后才产生高反应性基团，比,Ks,型不可逆抑制剂专一性更强。,-卤代-D-丙氨酸 磷酸吡哆醛,丙氨酸消旋酶,可逆抑制剂,（,底物的类似物,）,合成叶酸的组分,磺胺药物竞争抑制二氢叶酸合成酶的活性,蝶呤 对氨基苯甲酸 谷氨酸,叶酸,（磺胺药物）,可逆抑制剂,（,过渡态底物类似物,）,过渡态底物类似物抑制力更强，因为酶对过渡态底物的亲和力比对底物的亲和力强得多。,多种酶催化反应时的过渡态底物,过渡态底物类似物,可逆抑制剂,（,过渡态底物类似物,）,可逆抑制剂,（,过渡态底物类似物,）,四、温度对酶反应的影响,在较低温度范围内，酶反应速率随着温度的升高而增加，当温度高到一定程度时，酶开始变性失活，反应速率反而下降。所以对于酶反应来说，有一个最适反应温度。一般来说，动物细胞内酶的最适反应温度在3540，植物细胞中的酶可达4050，也有一些生长在堆肥、温泉中的微生物酶的最适温度更高，如Taq DNA聚合酶的最适温度可高达70。,需要注意的是，最适温度,值不是酶的特征性常数，此值随着反应时间的延长而有所下降。,温度对酶反应速率的影响,五、,pH,对酶反应的影响,酶的活力受环境pH的影响，存在一个最适反应pH。酶的最适反应pH也不是一个特征性常数，而是受到底物种类和浓度、缓冲液种类和浓度的不同而改变。,4种酶的,pH,-酶活性曲线,胃蛋白酶,木瓜蛋白酶,胆碱酯酶,胰蛋白酶,pH影响酶活力的原因,pH影响酶活力的原因有以下几方面：,过酸或过碱使酶变性失活。,pH偏离最适pH不多时，酶分子中及底物分子中各可解离基团的,解离状态,发生了变化，不利于底物与酶的结合及催化反应。,由于酶分子可解离基团的解离状态发生了改变，导致酶分子,构象,发生改变，不利于底物与酶的结合及催化反应。,最适反应pH示意图,六、激活剂对酶反应的影响,有些物质与酶结合后可以提高酶活力，这些物质称为酶的激活剂（activator）或活化剂，它们大部分是无机离子或小分子化合物，少数是大分子物质如蛋白质。作为激活剂的金属离子有K,+,、Na,+,、Ca,2+,、Mg,2+,、Zn,2+,、Fe,2+,等，它们与酶蛋白结合后，或稳定酶蛋白的构象，或参与底物的结合，或催化反应。,激活剂对酶反应的影响,不同的激活剂激活不同的酶，有些激活剂激活一种酶，却又抑制另一种酶。激活剂的浓度也对其效应有影响，一定浓度时起激活作用，超过这个浓度又起抑制作用。,在机体内有许多调节酶活力的方式，其中抑制剂和激活剂的调节属于最快速的方式。,谢谢！,