植物组织基因组DNA的提取与分析CTAB法.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1,试验六 植物组织中DNA提取与分析,温馨提醒：1、请将教室水浴锅打开，温度调至65。2、试验中-20冰浴时，请将样品放入6309室冰箱冷冻层。,植物组织基因组DNA的提取与分析CTAB法专家讲座,第1页,2,（,1,）,掌握植物组织中DNA提取原理和方法。,（2）,掌握DNA琼脂糖凝胶电泳检测方法,一、试验目标,植物组织基因组DNA的提取与分析CTAB法专家讲座,第2页,二、试验原理,通常采取,机械研磨,方法破碎植物组织和细胞，因为植物细胞匀浆含有各种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA抽提产生不利影响，在抽提缓冲液中需加入,抗氧化剂或强还原剂,(如巯基乙醇)以降低这些酶类活性。在,液氮,中研磨，材料易于破碎，并降低研磨过程中各种酶类作用。,CTAB,SDS,等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。,植物组织基因组DNA的提取与分析CTAB法专家讲座,第3页,二、试验原理,再加入,苯酚和氯仿,等有机溶剂，能使,蛋白质变性,，并使抽提液分相，因,核酸(DNA、RNA)水溶性很强,，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。,上清液中加入,异丙醇,或,乙醇,使DNA沉淀，沉淀DNA溶于,双蒸水,或,TE溶液,中，即得植物总DNA溶液。,之后可加入RNA酶降解其中RNA，再用氯仿除去RNA酶，得到较纯DNA制剂。,植物组织基因组DNA的提取与分析CTAB法专家讲座,第4页,CTAB法流程图,：,植物材料,裂解液,上层溶液,液氮研磨,抽提,细胞裂解,干燥溶解,离心洗涤,异丙醇沉淀,DNA溶液,植物组织基因组DNA的提取与分析CTAB法专家讲座,第5页,6,三、仪器和试剂,1,、仪器,：,恒温水浴锅、高速离心机、水平电泳槽、电泳仪。,2,、试剂,：,液氮、,CTAB提取缓冲液,、氯仿:异戊醇（24:1）、异丙醇、70%乙醇、TE缓冲液、上样缓冲液（,0.5%,溴酚蓝,+40%,蔗糖）、,1,TAE电泳缓冲液。,植物组织基因组DNA的提取与分析CTAB法专家讲座,第6页,四、试验步骤,称取,0.1g,植物幼苗,加入适量液氮充分,研磨,，全部转入1.5ml离心管中,加入0.5m,l,CTAB提取缓冲液,，充分混合均匀,65水浴10min，其间迟缓颠倒3次,加,入0.5ml,氯仿,:,异戊醇，,上下,颠倒,充分,混匀,12,000r,/min离心,10min,将上层水相移入另一新离心管,加,0.5ml,预冷异丙醇，,-20冰浴30,min,12,000r,/min离心,10min,弃上清，沉淀用0.5ml70%乙醇悬浮,弃上清，加20LTE溶解沉淀，即得,DNA溶液,12,000r,/min离心,10min,1,、,DNA,提取,植物组织基因组DNA的提取与分析CTAB法专家讲座,第7页,8,四、试验步骤,2,、,DNA,电泳检测,（,1,）,1%,琼脂糖凝胶：称取,0.3g,琼脂糖，加入,30mL 1TAE,缓冲液，在微波炉中加热，重复加热、振荡,2-3,次，使琼脂糖充分融化。待凝胶冷却至,60,左右，倒入插入梳子凝胶板中（防止产生气泡），让凝胶自然凝固。,（,2,）待凝胶凝固后，小心拔出梳子，防止前后左右摇摆，以免破坏胶面及加样孔，小心将凝胶和胶床放入电泳槽中，加样孔靠近阴极一端。,植物组织基因组DNA的提取与分析CTAB法专家讲座,第8页,9,四、试验步骤,2,、,DNA,电泳检测,（,3,）上样电泳：将,20LDNA,样品溶液和,5L,上样缓冲液混匀后，上样，,100V,稳压电泳检验，依据指示剂迁移位置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。,（,4,）照胶、拍照：将凝胶泡在,EB,溶液（,注意：,EB,溶液为剧毒物，需带上一次性手套拿取凝胶,）中,10min,左右，进入暗室，使用凝胶成像系统照胶并拍照。,植物组织基因组DNA的提取与分析CTAB法专家讲座,第9页,10,五、试验结果与分析,1 2 3,4,图,1,植物组织基因组,DNA,提取结果,将凝胶图片打印出来，需要说明：,1、小组点样孔号；,2、DNA质量分析。,植物组织基因组DNA的提取与分析CTAB法专家讲座,第10页,六、注意事项,（1）叶片磨得,越细越好,。,（2）移液器使用。,（3）因为植物细胞中含有大量,DNA酶,，所以，除在抽提液中加入EDTA抑制酶活性外，第一步（研磨）操作应,快速,，以免组织解冻，造成细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。,植物组织基因组DNA的提取与分析CTAB法专家讲座,第11页,12,1,、,在DNA抽提过程中造成DNA分子断裂主要原因有哪些,？,2、,本试验中所用到以下试剂,（,CTAB,、,氯仿,、,异丙醇,、,75%乙醇,）,作用各是什么?,七、思索题,植物组织基因组DNA的提取与分析CTAB法专家讲座,第12页,