DB21∕T 2707-2016 桃叶卫矛组培快繁技术规程.pdf

DB21 辽宁省地方标准 桃叶卫矛组培快繁技术规程 technical regulations for tissue culture of Euonymus maackii Rupr. . 2016 - 10 - 13 发布 2016 - 12 - 13 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 ICS 65.020.01 B 05 DB21/T 27072016 DB21/T 27072016 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准的附录A、附录B、附录C均为资料性附录。 本标准由辽宁省林业厅提出并归口。 本规程起草单位：沈阳农业大学、辽宁省实验林场、辽宁省生态实验林场、辽宁省林业种苗管理总站、辽宁省林业厅外资项目办公室、辽宁省固沙造林研究所、国有昌图付家机械林场、辽宁省卫生计生委卫生计生监督局、辽宁省林业调查规划院、抚顺市清原县林业局 本规程主要起草人：张丽杰、陆秀君、王玉涛、周强、倪鹏跃、金星、丛健、王斯彤、曹颖、扈延武、腾贵波、刘景强、凌帅、周宏、王明先、陈敏、张克 DB21/T 27072016 II 目 次 前言 1 范围. 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 3.1 外植体 . 1 3.2 污染 . 1 3.3 母液 . 1 3.4 初代培养 . 2 3.5 增殖培养 . 2 3.6 增殖系数 . 2 3.7 生根培养 . 2 3.8 炼苗 . 2 3.9 驯化 . 2 3.10 移栽 . 2 4 外植体采集与处理. 2 4.1 外植体采集 . 2 4.2 外植体处理 . 3 5 培养基配制 . 3 5.1MS 培养基母液配制 . 3 5.2 植物生长调节物质母液配制 . 3 5.3 培养基的制作 . 3 5.4 培养基灭菌 . 4 5.5 培养基保存 . 4 5.6 培养基选择 . 4 6 接种 . 4 6.1 接种环境 . 4 6.2 接种 . 4 7 组织培养 . 5 7.1 培养条件 . 5 DB21/T 27072016 III 7.2 诱导培养 . 5 7.3 增殖培养. 5 7.4 壮苗培养. 5 7.5 生根培养. 5 8 炼苗 . 5 9 驯化 . 5 9.1 驯化基质 . 5 9.2 驯化方法 . 5 9.3 驯化时间. 6 10 移栽 . 6 11 苗期管理 . 6 11.1 水肥管理 . 6 11.2 病虫害防治 . 6 11.3 苗木档案管理 . 6 12 定植 . 6 附录 A . 7 附录 B . 8 附录 C . 9 参考文献. 10 DB21/T 27072016 1 桃叶卫矛组培快繁技术规程 1 范围 本标准规定了桃叶卫矛（Euonymus maackii Rupr.）组织培养快繁技术的术语和定义、外植体采集与处理、培养基的配制、接种、培养条件、驯化、移栽、定植。 本标准适用于辽宁省范围内桃叶卫矛的组培快繁育苗。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 6000 主要造林树种苗木质量分级 GB/T 6001 育苗技术规程 LY/T1000 容器育苗技术 DB33/T 752-2009 植物种苗组培快繁技术规程 NY/T2306-2013 花卉种苗组培快繁技术规程 3 术语和定义 桃叶卫矛（Euonymus maackii Rupr.）为卫矛科卫矛属的落叶小乔木。该树种对风和烟尘有很强的抵抗力，病虫害少，且枝叶娟秀细致，树冠饱满形美，是园林绿化观赏树种，同时具有较高的经济价值。生物学特性参见附录A。 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 外植体 植物组织培养所利用植物体离体的器官（如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）组织（如形成层、表皮、皮层、髓布细胞、胚乳等）或细胞以及原生质体，称为外植体。 3.2 污染 培养基或培养材料生长有真菌或细菌等微生物的现象。 3.3 母液 为称量准确和方便， 按照培养基配方将培养基的成分配制成一定浓度和比例的溶液或混DB21/T 27072016 2 合溶液。 3.4 初代培养 把灭过菌的外植体接种于琼脂培养基上，诱导出愈伤组织或芽的培养过程。 3.5 增殖培养 将培养材料周期性的分株，分割后转接入新鲜培养基中继续培养的过程。 3.6 增殖系数 一个培养周期内试管苗增殖的倍数，即单芽培养一个周期后的平均增殖芽数。 3.7 生根培养 诱导无根离体芽苗产生根的培养过程。 3.8 炼苗 无菌苗及培养容器一起移至室外近自然环境中培养， 提高苗木的木质化程度， 增强苗木对自然光照和温差变化适应能力的过程。 3.9 驯化 炼苗后的组培苗，移栽到驯化基质中，适应自然光照、温湿度变化而使之成活的过程，驯化保持湿度，提高成活率。 3.10 移栽 驯化后的组培苗种植到温室或扦插棚移栽基质中， 并使苗木逐渐适应自然条件下健壮生长的过程。 4 外植体采集与处理 4.1 外植体采集 4.1.1 在生长旺盛的季节，选择连续 3 天以上的晴天，采集优良母树的当年生枝条作为外植体。 4.1.2 外植体当天取材， 当天处理， 若需长途运输， 需将外植体保存至装有冰块的保鲜盒内。 DB21/T 27072016 3 4.2 外植体处理 4.2.1 把取回的外植体枝条剪去叶片，剪成长约 2cm3cm 的带顶芽或腋芽的茎段，放入烧杯中用洗衣粉或洗洁精浸泡 5min，然后流水冲洗 2h3h，最后用蒸馏水冲洗，转至超净工作台。 4.2.2 在超净工作台上，用已配制好的 75%乙醇浸泡 30s，然后用无菌水冲洗 2 次3 次。 4.2.3 称取 1g 氯化汞，加蒸馏水溶解后定容至 1L，配制成 0.1%的升汞消毒液。用其浸泡材料（带顶芽的茎段 1min3min，带腋芽的茎段 2min5min）后，用无菌水冲洗 5 次7 次，并用无菌滤纸吸干水分后，剪成 1cm2cm 的带顶芽或腋芽的茎段备用。 5 培养基配制 5.1 MS 培养基母液配制 5.1.1 制作培养基前需先配制培养基母液，MS 培养基母液配制比例参见附录 B。 5.1.2 母液配制应用蒸馏水。 5.1.3 配制大量元素母液时，每个组分单独溶解，避免沉淀发生。 5.1.4 配制后的母液应置于 4冰箱中冷藏保存，微量元素母液用棕色瓶盛装保存，母液配制后应及时使用，贮存时间不宜超过 3 个月。 5.1.5 母液容器上应贴好标签，注明名称、配制日期，发现母液中有沉淀或絮状物出现应停止使用。 5.2 植物生长调节物质母液配制 5.2.1 植物生长调节物质母液的配制浓度为 0.1mg/mL1.0mg/mL，其配制方法参见附录 C。 5.2.2 母液配制好后贴好标签并置于 4冰箱中冷藏，保存期不超过 3 个月。 5.3 培养基的制作 5.3.1 准备好培养容器（1L 烧杯）、蒸馏水、琼脂粉、蔗糖和各类母液等。 5.3.2 先用烧杯盛有少量蒸馏水，参考用量参见附表 B。 5.3.3 按蔗糖浓度 30g/L，计算用量，称量后用蒸馏水溶解，然后用容量瓶定容。 5.3.4 将称量好的琼脂粉（6g/L7g/L）加入烧杯中加热搅拌至完全溶解。 5.3.5 根据要求加入计算好的激素，玻璃棒搅拌均匀。 5.3.6 充分搅拌后，用 pH 试纸测试酸碱度，调节 pH 值至 5.65.8。 5.3.7 根据不同需要若进行定量分装时， 要尽快将培养基分装到培养瓶内， 以免培养基凝固或变稠而难以分装。 5.3.8 分装培养基时，勿将培养基粘在培养瓶瓶口，粘上后应立即擦拭干净，否则容易引起污染。分装后立即用封口膜盖上，并用绳子扎紧。 DB21/T 27072016 4 5.4 培养基灭菌 5.4.1 将分装好的盛有培养基的三角瓶放入高压蒸汽灭菌锅内。当气压达 0.05Mpa 时，打开冷凝阀，排尽灭菌锅内的冷空气。当气压达到 0.1Mpa、温度升至 121时开始计时，保持温度并进行压力灭菌 20min。 5.4.2 切掉电源， 以慢排方式排放热气。 待灭菌锅内的气压表指针降至 0 时再打开高压灭菌锅盖，取出培养基。将培养基平放置于接种室或培养室内进行冷却。 5.5 培养基保存 灭菌后的培养基应注明培养编号及配制日期， 同时按培养基种类、 配制先后顺序分别储存于接种室或培养室。储存时间不宜超过 2 周。 5.6 培养基选择 诱导培养基为：MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L；MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L；MS+6-BA 2.0mg/L+NAA0.2mg/L ； MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L ； 增 殖 培 养 基 ：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L；生根培养基：MS+NAA0.2mg/L；MS+NAA0.5mg/L；1/2MS+NAA0.2 mg/L；1/2MS+NAA0.5 mg/L 6 接种 6.1 接种环境 接种人员和接种室内保持清洁。 每次接种前接种室内要进行紫外线消毒25min 30min，为避免紫外线损伤皮肤和眼睛， 操作人员应在关闭紫外灯15min后再进行操作。 接种结束后，应及时清理超净工作台及杂物。 6.2 接种 6.2.1 接种时，超净工作台的风机要始终保持开启状态，确保通风顺畅。 6.2.2 用酒精灯或电热消毒器将接种工具消毒， 消毒后应使其冷却后方可使用， 避免烫伤外植体。 每转接完一个培养瓶中的培养材料， 均应将接种工具放在酒精灯外燃火焰上或电热消毒器内灼烧 10s，同时更换接种器皿中的滤纸，以避免交叉感染。 6.2.3 在无菌的接种器皿中，将带腋芽或顶芽的茎段切分成 1cm1.5cm 的单芽茎段，接种于诱导培养基上， 培养数日后再将萌发的丛生芽或单个壮芽进行切割， 再接种到新鲜的培养基上进行继代培养， 并可将单个壮芽接种到生根培养基上诱导生根培养。 每个培养瓶内接种小芽或单芽的数量为 3 株4 株，并分布均匀。转接完成后，用记号笔在培养瓶上标注接种日期、编号或名称。 6.2.4 每次接种完毕后，应用 75%的乙醇将超净工作台的台面及两边挡板等擦拭干净，同时将接种器皿及接种工具重新按照 5.4 方法进行消毒处理。 DB21/T 27072016 5 7 组织培养 7.1 培养条件 培养室内温度为 252，培养瓶上部的光照强度为 2000Lx3000Lx，光照时间为每天12h16h。 7.2 诱导培养 将已消毒的接种材料接种在诱导培养基上， 10d15d后芽开始萌发， 20d左右茎尖变绿并伸长生长，茎段腋芽萌发新芽，30d左右芽可长高至2cm3cm。 7.3 增殖培养 将初代培养诱导形成的幼芽或丛生芽，接种到增殖培养基上进行培养。 增殖培养周期为30d40d。 7.4 壮苗培养 将增殖培养的单个芽或丛生芽切分后接种到壮苗培养基中，培养20d30d后，幼苗株高可达3cm4cm。 7.5 生根培养 选取壮苗后的幼苗，接种于生根培养基中进行生根培养。 8 炼苗 生根培养2周3周后，选取叶片绿色、株高大于3cm，根长1.5cm2.5cm，须根柔软且不少于3条的无菌苗，将组培苗放置温室自然散射光下，打开封口炼苗2d3d，控制温度在1828。 9 驯化 9.1 驯化基质 细河沙、珍珠岩与草炭土比例为1:1:1，并加入0.5g/L的多菌灵搅拌均匀，然后装入穴盘中压紧待用。 9.2 驯化方法 将无菌苗从培养容器中小心取出， 注意保护根系， 将根部粘附的琼脂用清水 （或用0.01%高锰酸钾）清洗干净，移到营养钵中，扶正小苗，使根系尽量舒展，用基质将根埋好。用镊DB21/T 27072016 6 子等工具在容器钵中扎能容纳根系的小孔，将组培苗的根系放入孔内压实，浇透水，覆膜。并用镊子在膜上扎几个透气小孔。每天用细雾喷壶喷水，使环境湿度保持在90%左右。外面用遮阳网罩着， 避免阳光直射。 当发现小苗基部或基质上出现白色絮状菌丝时， 用多菌灵700倍液喷洒基质，尽量避免药液滴在苗木上。 9.3 驯化时间 2周3周 10 移栽 经过2周3周驯化后，当苗木表现为叶色深绿，叶片增大，有新叶长出时，可将苗木移栽至直径12cm12cm相同基质的塑料营养钵中。 11 苗期管理 11.1 水肥管理 移栽后，在遮荫且通风条件下培养 4d5d，每天向叶面喷水 1 次，1 周后，撤掉遮荫，但要注意通风。 11.2 病虫害防治 移栽后经常检查新叶生长情况。 桃叶卫矛在生长过程中易发生红蜘蛛侵害， 可喷施 500倍1000 倍的乐果稀释液。 11.3 苗木档案管理 每批移栽驯化的苗木都要配有标签，建立管理技术档案。 12 定植 翌年春季移栽至圃地。 DB21/T 27072016 7 附录 A （资料性附录） 桃叶卫矛生物学特征 桃叶卫矛（Euonymus maackii Rupr.）别名: 丝绵木、明开夜合、华北卫矛，卫矛科、卫矛属小乔木，高达 6m。叶卵状椭圆形、卵圆形或窄椭圆形，长 4cm8cm，宽 2cm5cm，先端长渐尖，基部阔楔形或近圆形，边缘具细锯齿，有时极深而锐利；叶柄通常细长，但有时较短。淡白绿色或黄绿色，直径约 8mm；小花梗长 2.5mm4mm；雄蕊花药紫红色，花丝细长，葫果倒圆心状，成熟后果皮粉红色；种子长椭圆状，种皮棕黄色，假种皮橙红色，全包种子，成熟后顶端常有小口。花期 5 月6 月，果期 9 月。 桃叶卫矛属于喜光，稍耐荫；耐寒植物，对土壤要求不严，耐干旱，也耐水湿，而以肥沃、湿润而排水良好之土壤生长最好。根系深而发达，能抗风；根蘖萌发力强，生长速度中等偏慢。对 SO2的抗性中等。 主要分布地区：产地区域广阔，北起黑龙江包括华北、内蒙古各省区，南到长江南岸各省区，西至甘肃，除陕西、西南和两广未见野生外，其他各省区均有，但长江以南常以栽培为主。分布达乌苏里地区、西伯利亚南部和朝鲜半岛。 主要价值： （1）使用价值：木材可供器具及细工雕刻用；树皮含硬橡胶，种字含油率达40%以上，可做工业用油。 （2）食用价值：叶可代茶。 （3）药用价值：花果充当合欢与根均入药。 DB21/T 27072016 8 附录 B （资料性附录） MS 培养基母液的配制表 母液 化合物 原配方量 (mg) 扩大倍数 称取量 （mg） 母液体积 （mL） 配制1L培养基应吸取量（mL） NH4NO3 1650 33000 KNO3 1900 38000 CaCI22H2O 440 8800 MgSO47H2O 370 7400 大量元素 KH2PO4 170 20 3400 1000 50 KI 0.83 166 H3BO3 6.2 1240 MnSO44H2O 22.3 4460 ZnSO47H2O 8.6 1720 NaMoO42H2O 0.25 50 CuSO45H2O 0.025 5 微量元素 CoCI26H2O 0.025 200 5 1000 5 FeSO47H2O 28.7 5560 铁盐 Na2.EDTA2H2O 37.3 200 7460 1000 5 肌醇 100 20000 烟酸 0.5 100 盐酸吡哆醇 0.5 100 盐酸硫胺素 0.1 20 维生素和 氨基酸 甘氨酸 2 200 400 1000 5 DB21/T 27072016 9 附录 C （资料性附录） 常用植物生长调节物质配制方法 类别 种类 配制方法 配制浓度（mg/mL） 细胞分裂素 6-BA 先用少量的 95%的乙醇溶解， 然后加蒸馏水定容。 1 mg/mL 生长素 NAA 先用少量 0.1mol/L 的 NaOH 溶解，然后加蒸馏水定容。 1 mg/mL DB21/T 27072016 10 参考文献 1GB/T 16620-1996 林木育种及种子管理术语 2张丽杰,贾斌英,崔建国,周强,祁金玉.桃叶卫矛的组织培养及植株再生J.植物生理学通讯，2007 年 12 月，第 43 卷第 6 期 3张丽杰， 王强恩， 周强， 张才.桃叶卫矛组织培养的研究J.北方园艺， 2010 （17） ： 141143 4张丽杰，陈晓旭，周强，张才，温伟，贾斌英.光照、琼脂和碳源对桃叶卫矛腋芽离体培养的影响J.辽宁林业科技，2009（1） ：3135 5沈海龙.植物组织培养.中国林业出版社，2006