液相色谱常见问题及其对策.ppt

SHIMADZU,Solutions for Science,Since 1875,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,液相色谱常见问题及其对策,1,现象：无压力，流动相不流动,可能原因,1,、保险丝断或电源问题,2,、柱塞杆折断,3,、泵头内有空气或流动相不足,4,、单向阀损坏,5,、漏液,6,、压力传感器损坏,(,流动相流动正常，但无压力,),液相色谱常见问题及其对策,压力异常,2,峰产生有肩或分叉的原因,再生纤维素滤膜：,液相色谱常见问题及其对策峰形异常,复位 （PSET）,使用氟树脂膜的减压脱气法,2、流动相组分变化,1、样品过载,3、色谱柱没有平衡,液相色谱常见问题及其对策基线问题,1、温度波动,使宝石球与垫片分开,液相色谱常见问题及其对策压力异常,现象：漏液,1、样品过载,液相色谱常见问题及其对策压力异常,更换密封圈,峰产生有肩或分叉的原因,现象：压力持续偏高或不断上升,1,、流速设定过高,2,、保护柱或柱子筛板堵塞,3,、流动相使用不当或有缓冲盐析出,4,、色谱柱选择不当,5,、进样阀损坏,6,、线路过滤器堵塞,液相色谱常见问题及其对策,压力异常,3,现象：压力持续偏低,1,、流速设定过低,2,、色谱柱选择不当,3,、柱温过高,4,、系统漏液,液相色谱常见问题及其对策,压力异常,4,现象：压力波动,可能原因,1,、泵头中有气泡,2,、单向阀损坏,3,、柱塞密封圈损坏,4,、脱气不充分,5,、系统漏液,6,、使用了梯度洗脱,液相色谱常见问题及其对策,压力异常,5,接头处漏液,1,、接头处松动,2,、接头磨损,3,、接头被污染,4,、部件不匹配,液相色谱常见问题及其对策,漏液,6,泵漏液,1,、单向阀松动,2,、泵密封损坏,3,、放空阀损坏,4,、接头松动（不要拧的太紧）,液相色谱常见问题及其对策,漏液,7,进样阀漏液,可能原因,1,、转子密封损坏,2,、定量环堵塞,3,、进样口密封松动,4,、进样针尺寸不合适,5,、废液管产生虹吸,6,、废液管堵塞,液相色谱常见问题及其对策,漏液,8,检测器漏液,可能原因,1,、流通池垫片损坏,2,、流通池透镜破碎,3,、手紧接头处漏液,4,、废液管堵塞,5,、流通池堵塞,液相色谱常见问题及其对策,漏液,9,保留时间漂移,可能原因,1,、柱温变化,2,、流动相组分变化,3,、色谱柱没有平衡,4,、流速变化,5,、泵中有气泡,6,、流动相选择不当,7,、键合相流失,8,、缓冲容量不够,液相色谱常见问题及其对策,保留时间漂移,10,基线漂移,可能原因,1,、温度波动,2,、流动相不均匀,(,脱气，使用纯度更高的溶剂,),3,、流通池被污染或有气泡,4,、流通池窗口破裂,5,、流动相配比不当或流速变化,6,、柱子平衡（约,30,60min,）,液相色谱常见问题及其对策,基线问题,11,基线漂移,可能原因,7,、流动相污染，变质或由低品质溶剂配成,8,、样品中有强保留的物质以馒头样峰被洗出,9,、检测器没有设定在最大吸收波长处,液相色谱常见问题及其对策,基线问题,12,基线噪声（规则的）,可能原因,1,、流动相、泵、检测器中有气泡,2,、有地方漏液,3,、流动相混和不均匀,4,、温度影响（检测器和柱温差别太大）,5,、其他电子设备的影响,液相色谱常见问题及其对策,基线问题,13,基线噪声（不规则的）,可能原因,1,、流动相污染、变质或由低质溶剂配成,2,、有地方漏液,3,、流动相各溶剂不相溶或混和不均匀,4,、流通池污染,5,、检测池能量不足,6,、系统内有气泡,液相色谱常见问题及其对策,基线问题,14,前沿峰、拖尾峰,可能原因,1,、柱塞板堵塞,2,、色谱柱塌陷,3,、柱外效应,4,、干扰峰,5,、缓冲不足或不合适,6,、化学或次级保留（硅羟基效应）,液相色谱常见问题及其对策,峰形异常,15,前沿峰、拖尾峰,可能原因,7,、重金属污染,8,、样品溶剂选择不当,9,、样品过载,10,、柱温过低,液相色谱常见问题及其对策,峰形异常,16,分叉峰,可能原因,1,、保护柱或分析柱污染,2,、样品溶剂不溶于流动相,液相色谱常见问题及其对策,峰形异常,17,峰展宽,进样体积过大,流动相粘度过高,检测池体积过大,保留时间过长,柱外体积过大,样品过载,液相色谱常见问题及其对策,峰形异常,18,峰变形,可能原因,1,、样品过载,2,、样品溶剂选择不当,液相色谱常见问题及其对策,峰形异常,19,鬼峰,1,、进样阀残余峰,2,、样品中未知物,3,、柱未平衡,4,、水污染,5,、三氟乙酸氧化,液相色谱常见问题及其对策,峰形异常,20,1、柱塞板堵塞,2、流动相不均匀(脱气，使用纯度更高的溶剂),措施：5稀硝酸，超声波清,表现：样品池和参比池能量相差较大,*使折射率变化,8、缓冲容量不够,如污染严重，拆开样品池，将透镜等放入异丙醇中超声波清洗。,再用蒸馏水清洗,更换氘灯（紫外检测器）,3、泵头内有空气或流动相不足,b 样品太脏,措施：5稀硝酸，超声波清,液相色谱容易出问题的部件,维护流程图,吸滤头,单向阀,柱塞密封圈,线路过滤器,手动进样器,检测器,21,材料：不锈钢烧结，孔径10um,故障：堵塞,表现：管路中不断有气泡生成,措施：用520的稀硝酸，超声波清洗，,再用蒸馏水清洗,注意点：吸滤头拆下时不必将塑料管剪断,吸滤头,液相色谱容易出问题的部件,22,LC-10ATvp泵：串联 式往复泵,LC-10ADvp泵：并联式 往复泵,液相色谱容易出问题的部件,23,液相色谱容易出问题的部件,单向阀结构,抛光面,透明塑料垫片,宝石球,吸液冲程,排液冲程,出口单向阀,进口单向阀,泵头,流动相,单向阀原理,吸液冲程,排液冲程,出口单向阀,进口单向阀,泵头,24,液相色谱容易出问题的部件,故障,1,：宝石球粘附于垫片,表现：泵无法吸液或排液，流路不通,措施：,1,）用针筒抽出口单向阀以产生负压，,使宝石球与垫片分开,2,）拆下单向阀，放入异丙醇或水中，,用超声波清洗,单向阀,25,液相色谱容易出问题的部件,故障,2,：宝石球或塑料垫片受污导致密封不好,表现：系统压力波动大,措施：拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超,声波清洗,单向阀,26,故障：密封圈磨损而导致,密封不良,现象：系统压力波动大或,漏夜措施：更换密封圈,注意点：,更换密封圈,拆卸泵头前，柱塞杆,复位 （PSET）,柱塞密封圈,流动相,泵头清洗管路,柱塞杆,密封圈,液相色谱容易出问题的部件,27,故障：堵塞,现象：系统压力波动大或压,力偏高,措施：5稀硝酸，超声波清,洗,判断依据：关闭排液阀，断开出口管路，设定流速1mL/min，如压力3kgf/cm,2,，则可能堵塞。,线路过滤器,排液阀,压力传感器,线路过滤器,流动相,液相色谱容易出问题的部件,28,手动进样阀,故障：转子密封损坏,现象：漏液,原因：,a,拧的太紧,b,样品太脏,c,针头损坏或不使用液相专用针,解决措施：更换转子密封，并在使用,时注意保养,液相色谱容易出问题的部件,29,液相色谱容易出问题的部件,手动进样阀,故障：载样困难,原因：,a,定量环堵塞,b,进样器污染,解决措施：清洗或更换定量环、进样器,30,柱子,故障,：,系统高压、峰型变差（拖尾峰、前沿峰、分叉峰），保留时间的改变,解决措施：清洗,正相柱，正庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇,反相柱，甲醇、乙腈、氯仿、异丙醇、稀硫酸,液相色谱容易出问题的部件,31,液相色谱容易出问题的部件,峰产生有肩或分叉的原因,1.,柱子劣化,（进口处产生不均匀的空隙）,2.,样品劣化,（生成氧化物、分解物等）,判断标准,所有的峰都产生有肩峰或分叉时则为柱子劣化,32,延长柱寿命方法：,倒冲柱,换过滤片,修补柱头,液相色谱容易出问题的部件,33,液相色谱容易出问题的部件,柱的补修,34,填料的取出,液相色谱容易出问题的部件,35,恢复例,液相色谱容易出问题的部件,36,分 析 柱 的 维 护,1、在使用新柱之前，最好用强溶剂在低流量下(0.2-0.3 ml/min)冲洗 30 mins，长时间未用的分析柱也要同样 处理,2、定期使用强溶剂冲洗柱子,3、使用缓冲盐时，要先用水冲洗，再用有机溶剂冲洗,4、净化样品,5、分离条件,6、不使用时，要盖上盖子，避免固定相干枯,7、使用预柱,8、避免流动相组成及极性的剧烈变化,9、避免压力脉冲的剧烈变化,液相色谱容易出问题的部件,37,更换氘灯,（紫外检测器）,判断氘灯能量：,设定220nm波长，检查参比池能量，如 能量低于800，需更换氘灯。,操作注意点：,不要用手直接接触氘灯表面,液相色谱容易出问题的部件,38,液相色谱容易出问题的部件,故障：样品池受污,表现：样品池和参比池能量相差较大,检查方法：设定250nm波长，通甲醇或水，查看SMPL EN和 REF EN，如两者相差较大，则样品池受污。,措施：用针筒注入异丙醇，清洗样品池；如污染严重，拆开样品池，将透镜等放入异丙醇中超声波清洗。,紫外检测器,39,其他问题,溶剂的过滤,滤膜类型：,聚四氟乙烯滤膜,：,适用于所有溶剂，酸和盐。,醋酸纤维滤膜：,不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。,尼龙,66,滤膜：,适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适,用于二甲基甲酰胺。,再生纤维素滤膜：,蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂,40,脱气：,除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡,气泡对测定的影响：,1,）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积,2,）柱中气泡使流动相绕流，峰变形,3,）检测器中的气泡产生基线波动,其他问题,41,脱气的目的,1.防止由气泡的产生引起的故障,2.防止由溶解（在液体中的）气体量,的变动引起的检测不稳定程度,1）示差折射率检测器,*使折射率变化,2）UV检测器（200,nm,以下）,*溶解氧气有吸收,3）荧光检测器,*溶解氧气有消光作用,其他问题,42,其他问题,脱气的方法,1.,超声波脱气法,2.He清除法,3.使用氟树脂膜的减压脱气法,43,其他问题,He清除法,调压阀,排气阀,往送液泵,流动相,过滤器,44,其他问题,氟树脂膜,真空室,往送液泵,真空泵,控制器,流动相,使用氟树脂膜的减压脱气法,45,其他问题,梯度洗脱法的注意点,1.,流动相使用,HPLC,级有机溶剂。,2.,查看空白实验的数据。,3.,遵守分析周期。,（最初的分析数据不采用）,46,其他问题,缓冲液,选择缓冲液的步骤,1.确定最佳分离状态时的流动相pH,2.选择具有与流动相的pH相近的pKa 的缓冲液,（,即使浓度稀也具有较强能力的缓冲液）,3.确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收,（在波长210nm附近进行检测时，不能用醋酸和,柠檬酸的缓冲液）,47,流动相,缓冲液,/,溶剂选择,梯度优化,流速选择,脱气，流速稳定,流动相制备,柱,高柱效,二级作用力,lot variation,温度控制,检测,灵敏度,选择性,温度波动影响,样品,提取方法选择,样品溶剂选择,氧气影响,仪器,性能,稳定性,耐用性,易操作性,综合评估,分析技术的稳定性,可靠性,定量准确性,HPLC,如何得到好的结果,48,谢谢观看,谢谢观看,