外周血DNA的提取.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,外周血DNA的提取,实验目的,掌握人全血,DNA,提取的原理和操作步骤。,了解,DNA,基本理化性质。,3.,初步了解,DNA,琼脂糖电泳鉴定的方法。,实验原理,1 保证DNA一级结构的完整性；,2 其他生物分子如蛋白质、多糖和脂类等分子的污染应尽量降低到最低；,3 尽量去除对后续分子实验有抑制作用的有机溶剂和重金属离子；,4 其他核酸分子RNA，应根据实际需要处理。,DNA,提取总的原则,实验原理,理论上所有真核细胞、原核细胞、病毒等都可以提取,DNA,。,样本选择取决于实验目的。,全血是基因组提取中最常见的样本之一。,样本来源,理化性质,核酸是由碱基、戊糖及磷酸组成的生物大分子，分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两类。,1.酸碱性,核酸分子中有酸性的磷酸基和碱性的含氮碱基，属于两性化合物，但是磷酸基的,酸性较强,，所以核酸总体上表现为,酸性,，带,负电荷,。,2.溶解度与粘度,核酸是极性化合物，微溶于水，其钠易盐溶于水，而不溶于乙醇、苯酚、氯仿、乙醚等有机溶剂。,核酸是高分子化合物，粘度很大。,3.紫外吸收,核酸有强烈的紫外吸收，其最大吸收峰在,260nm,处，常以A,260,表示。,实验原理,生物的大部分或几乎全部的,DNA,都集中在细胞核或核质体中，人与动物的DNA主要存在于细胞核中，并与,蛋白质结合的构成大小不一的染色体。所以,蛋白质,是DNA提取过程中常见的污染之一，而且蛋白质污染常常影响到以后的DNA操作过程，因此提取过程中要把蛋白质去除。,实验原理,本实验中DNA提取采用的是,苯酚/氯仿抽提,的方法。基本原理就是苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA却没有影响。经苯酚/氯仿抽提后，酚/氯仿相与水相完全分层，蛋白质变性而被离心沉降到酚/氯仿相和水相的界面，DNA则留在水相。标本中的脂类杂质溶解于酚/氯仿相，从而与水相分离得以去除。,实验原理,此方法提取得到的DNA可能会有RNA杂质，但是RNA极易降解。而且少量的RNA对DNA的后续操作没有大的影响，如有必要可以加入不含DNA酶的,RNA酶,去除RNA的污染。,实验步骤,1.首先取EDTA抗凝的人外周血2mL,按照1:51:10,的,比例加入去离子水裂解8min，然后1700rpm/min离心，去掉含有红细胞碎片的上清液，重复裂解一次，留取白细胞沉淀。,实验步骤,DNA细胞裂解液(pH 8.0)：,150mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl、,10 mmol/L EDTA、0.5%SDS,DNA细胞裂解液中SDS的是表面活性剂，主要作用裂解细胞膜、核膜，使核膜里与蛋白质结合的核酸释放到溶液里面。另外，Tris盐的作用是使抽提的出来的DNA容易进入水相，减少在蛋白质层的滞留。,2.加入0.5mL的,DNA细胞裂解液,来悬浮白细胞沉淀。,实验步骤,3.悬浮后的溶液中添加,蛋白酶K,20L，65水浴0.5h，期间轻缓地倒转几次。,4.室温下，添加0.5mL的苯酚/氯仿/,异戊醇,混合抽提液，剧烈地震荡混合10min，然后8000rpm/min离心10分钟，然后将,水相,移至新的离心管中。,细胞膜裂解以后，细胞中含有的蛋白质和DNA酶等释放到溶液中，而蛋白酶K 具有水解蛋白质和DNA酶的作用，并且在EDTA和SDS存在的条件下仍保持较高的活性。,在苯酚/氯仿加入少量的异戊醇，可以减少实验中气泡的产生，而且有利于分层，保持分层的稳定性,。,实验步骤,5.添加1mL的,预冷的无水乙醇,到水相中，混匀，8000rpm/min离心3分钟。,加入无水乙醇可以吸收水相中的水分，使得DNA沉淀析出。,6.沉淀用,70%的预冷乙醇洗涤两次,，然后干燥，最后用50L去离子水悬浮。,70%的冰乙醇可以去除可溶性的多糖、金属离子等杂质以及残留的苯酚/氯仿等。,实验步骤,7.用1%的琼脂糖电泳鉴定所提取的DNA。,8.剩余的DNA贮存在4冰箱中,备用。,注意事项,一.提取染色体DNA最根本的要求就是保持核酸的完整性。所以操作过程中要注意：,1 物理因素 高分子量的DNA长而弯曲，仅有极微的侧向稳定性，机械张力和高温很容易使DNA分子发生断裂。因此，实际操作过程中,尽量轻缓,，尽量,避免过度的溶液吹打转移,，以及,过高的温度。,2 化学因素 在过酸的条件下，由于DNA脱嘌呤而导致DNA的不稳定，容易在碱基脱落的地方发生断裂。因此避免使用过酸的条件。,二.步骤3转移水相时，此时的水相可能比较粘稠，必须非常的小心将水相吸入新离心管并,防止搅动和吸入分层界面的杂质蛋白,。,三.在提取过程中，使用离心管及枪头都应该是干净无菌的，相应试剂配制及保存要规范。,谢谢！,