DNA测序分析常见问.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA测序分析常见问题,测序结果峰图,四色图谱：每一种颜色对应一种碱基,A,T,C,G,引物,DNA模板,纯化,困难模板,机器影响,影响测序质量的主要因素,一、引物对测序结果的影响,引物合成时多（少）一个碱基,引物不纯,模板上没有引物结合位点,引物二聚体,双引物结合,合成时部分引物,多,一个碱基,合成时部分引物,少,一个碱基,现象：每个峰后面有个同样荧光信,号的小“尾巴”。,原因：合成时引物多一个碱基。,对策：重新合成引物,现象：每个峰前面有个同样荧光信,号的小“尾巴”。,原因：合成时引物多一个碱基。,对策：重新合成引物,引物（模板）不纯,现象：整个峰图噪音都比较高。（区别与小片段的干扰）,原因：引物（模板）纯度太低，含有较多杂质,对策：,建议使用HPLC（柱子纯化）或PAGE 纯化的测序引物。,脱盐纯化的引物纯度较低，适合做普通PCR，但不建议用来测序。,模板上没有引物结合位点,现象：没有特异性的测序峰图,原因：引物无法结合模板,对策,重新设计引物,引物二聚体,现象：前面100多bp噪音高，后面正常（引物二聚体片段小大在100bp左右）,原因：引物二聚体未去除干净,对策：割胶纯化,双引物结合,现象：从一开始（区别于非单克隆）就出现两套峰,原因：模板有两个引物结合位点，同时和两个引物结合,对策：重新设计单个引物,二、模板对测序结果的影响,模板不纯,点突变（SNP）,移码突变,杂合子,非单克隆,噪音信号高,终止峰,PCR正常终止,后面的噪音峰,PCR正常终止,正常模板与噪音,模板不纯（非特异性PCR产物）,现象：每个峰下面都有其它颜色,原因：PCR主带与杂带混在一起测序,对策：凝胶电泳回收主带，重新测序,割胶纯化,点突变（SNP）,突变点,如果模板有单核苷酸（碱基）突变（SNP），测序图形中其他的位点一般都是单一的,峰形，然后突然在某一个位点出现重叠峰(如图中箭头所示)。,移码突变,在,450bp,处因点突变导致移码，在,528bp,处又因点突变恢复,杂合子,杂合变点,杂合信号处的套峰强度大小相等，都相当于正常峰值的一半。,非单克隆,特征：左边清晰，右边全部像杂合子原因：挑克隆时两个质粒混在一起,对策：新挑克隆，重新制DNA,三、纯化对测序结果的影响,染料峰,酒精峰,荧光物质污染,钉子峰,有机物污染（瀑布效应）,染料峰,特征：染料峰位于序列的前,100bp,左右，是残余的,A,、,T,、,C,、,G,、,4,个,BigDye,峰，其不影响其它序列的可靠性。,酒精峰,特征：酒精峰位于序列的,200bp-300bp,碱基之间，图谱被“透明”,抬高，其同样不影响其它序列的可靠性。,荧光物质污染,现象：红色峰异常高。,原因：未知大分子荧光物质污染，恰好是红色，被软件误认为红色峰。,对策：依次更换水、缓冲液、甲酰胺、测序胶、毛细管；清洗或更换胶引导块、针筒。,“钉子”峰,现象：四色并存突然拔起的尖峰，峰形锐利。,原因：毛细管内有气泡、灰尘、尿素结晶等，对激光全反射。,对策,灌胶时，避免气泡产生；,上样前，样品先离心；,毛细管、检测窗口保持清洁；,胶内有尿素结晶时，注意不要吸进注射器；,样品纯化干净。,有机物污染（瀑布效应）,现象：基线从高处突然下降。,原因：有机物进入毛细管，受激发产生一定波长的荧光，抬高基线。,对策：依次更换水、缓冲液、甲酰胺、测序胶、毛细管；清洗或更换胶引导块、针筒。,四、困难模板对测序结果的影响,特殊结构,Ploy结构,高GC,重复序列,回文结构,特殊结构,Poly结构,Poly在序列的前端对信号影响较小,Poly在序列的后端对信号影响较大,。,Poly-G/poly-C 很容易导致信号中断和信号乱。,高GC,Poly-G/poly-C 是高GC的一种，很容易导致信号衰减。,局部高GC一般会导致信号中断和乱峰。,重复序列,GT 重复导致信号衰减,A/G重复导致信号衰减,或信号乱,回文结构,其他复杂的二级结构也会导致衰减,四、机器因素对测序结果的影响,毛细管寿命,其它,毛细管寿命,突起部分,峰的左右不对称，向后拖，有小突起,