GB 23748-2016 食品安全国家标准 辐照食品鉴定 筛选法.pdf

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B2 3 7 4 82 0 1 6食品安全国家标准辐照食品鉴定 筛选法2 0 1 6 - 1 2 - 2 3发布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局发 布G B2 3 7 4 82 0 1 6 前 言 本标准代替G B/T2 3 7 4 82 0 0 9 辐照食品的鉴定 D NA彗星试验法 筛选法 、NY/T2 2 1 42 0 1 2 辐照食品鉴定 光释光法 和S N/T2 9 1 0.22 0 1 1 出口辐照食品的鉴别方法 第2部分: 单细胞凝胶电泳法 。本标准与G B/T2 3 7 4 82 0 0 9相比, 主要变化如下: 标准名称修改为“ 食品安全国家标准 辐照食品鉴定 筛选法” ; 增加了两种筛选方法: 光释光法和微生物学筛选法; 增加了D NA彗星试验法的限制性说明。G B2 3 7 4 82 0 1 61 食品安全国家标准辐照食品鉴定 筛选法1 范围本标准规定了三种快速筛选食品是否接受过辐照的鉴定方法: 光释光法、D NA彗星试验法和微生物学筛选法。本标准中的光释光法适用于甲壳类、 香辛料和调味品类产品的辐照鉴定;D NA彗星试验法适用于动物产品、 谷物、 坚果、 果蔬的辐照鉴定; 微生物学筛选法适用于冷冻畜禽肉和水产品等各类生鲜食品的辐照鉴定。第一法 光释光法2 术语和定义2.1 光释光(p h o t o s t i m u l a t e d l u m i n e s c e n c e,P S L)富含硅酸盐类样品俘获的辐射能量经一定波长的光激发后, 以光的形式释放出来的现象。2.2 P S L强度(P S Li n t e n s i t y)样品经光激发后检测到的发光量, 以光子计数率表示。2.3 筛查P S L(s c r e e n i n gP S L)样品初次测量的P S L强度。2.4 校正P S L(c a l i b r a t e dP S L)筛查P S L测量之后, 同一样品用已知剂量辐照后测量的P S L强度。2.5 阈值(t h r e s h o l d s)在筛查模式下, 用于判定样品辐照与否的P S L强度, 包括一个低阈值(T1) 和一个高阈值(T2) 。2.6 阴性P S L(n e g a t i v eP S Lr e s u l t)P S L测量强度低于低阈值。2.7 可疑P S L(i n t e r m e d i a t eP S Lr e s u l t)P S L测量强度在低阈值和高阈值之间。2.8 阳性P S L(p o s i t i v eP S Lr e s u l t)P S L测量强度高于高阈值。G B2 3 7 4 82 0 1 62 2.9 空白对照(d a r kc o u n t)无光刺激时, 对空样品容器获得的光子计数率。2.1 0 阳性对照(l i g h t c o u n t)将参考光源( 比如装有1 4C的闪烁体或者等效物) 置于样品容器中得到的光子计数率。3 原理富含硅酸盐类物质的样品能够储存射线能量。通过一定波长的光再次激发照射, 样品中储存的能量可以释放, 产生光释放光信号。利用光释放光检测仪测试光信号的强度, 比较不同光信号强度的大小, 判定样品是否经过辐照。4 仪器和设备4.1 光释光测量系统: 包括样品容器、 光激发源、 脉冲刺激仪和同步光子计数系统。4.2 测量盘: 直径5c m。4.3 电离辐射源: 对电离辐射源的使用和管理按G B1 7 5 6 8和G B/T2 5 3 0 6的规定。5 分析步骤注:样品在测量前避光放置。测量时使用一次性测量盘。5.1 香辛料和调味品的样品制备准备双份样品, 均匀铺在测量盘底部, 分别检测。如果两次检测结果与判定阈值相比不一致, 则将样品4等分后重新进行检测, 取其中最高的两个检测值作为结果进行判定, 依此类推。5.2 甲壳类动物的样品制备将带壳或去壳样品放入测量盘中, 样品中带有动物肠子时有利于光释光信号的检测。如个体较大,可对样品切割; 也可取肠子( 不少于6根) 放入测量盘中进行测量。5.3 仪器设置设定辐照食品筛查系统的个体测量参数。检查空白对照和阳性对照。注:应当定期或者当测量出现阳性结果后, 对容器进行空样品检测, 检查仪器是否受到污染。5.4 样品测定5.4.1 筛查测量进行样品检测并记录结果。5.4.2 校正测量筛查测量后的样品加盖保存, 防止样品损失或污染。对这些样品再辐照特定剂量( 香辛料和贝类食物辐照1k G y) , 辐照后室温( 甲壳类动物和其他易腐烂样品应冷藏) 避光保存1 2h, 进行校正测量。G B2 3 7 4 82 0 1 63 6 分析结果表述6.1 阈值设定香料和调味品的阈值设定为:T1=7 0 0c o u n t s/m i n,T2=50 0 0c o u n t s/m i n。甲壳类动物的阈值设定为:T1=10 0 0c o u n t s/m i n,T2=40 0 0c o u n t s/m i n。6.2 结果判断根据与阈值的比较, 样品测量结果可分为阴性、 可疑、 阳性三种情况, 分别进行判定。6.2.1 阴性结果6.2.1.1 筛查P S L筛查P S L为阴性结果时, 可判定样品未经辐照。6.2.1.2 校正P S L校正P S L和筛查P S L同为阴性时, 该样品不能被判定为辐照食品。若要进一步确认样品是否接受过辐照, 应采用辐照食品鉴定的其他确证方法。校正P S L为阴性, 但筛查P S L为阳性时, 表明测量系统有错误, 应当取新鲜的原始样品重新测量。6.2.2 可疑结果6.2.2.1 筛查P S L筛查P S L为可疑结果时, 不能直接判定样品是否接受过辐照。6.2.2.2 校正P S L校正P S L和筛查P S L同为可疑结果时, 判定样品接受过辐照。校正P S L为可疑结果, 筛查P S L为阴性结果时, 表明样品可能是低敏感性未辐照食品。若要进一步确认样品是否接受过辐照, 应采用辐照食品鉴定的其他确证方法。校正P S L为可疑结果, 筛查P S L为高数值阳性结果时, 表明测量有误。校正P S L为可疑结果, 筛查P S L为接近T2的阳性结果时, 表明样品可能接受过高于校正剂量的辐照。应当重新测量样品进行判定。6.2.3 阳性结果6.2.3.1 筛查P S L筛查P S L为阳性结果时, 可判定样品接受过辐照。6.2.3.2 校正P S L校正P S L和筛查P S L为同级别的阳性结果时, 判定样品接受过辐照。校正P S L为阳性结果, 且远高于阴性或可疑结果的筛查P S L时, 表明样品可能未经辐照。校正P S L和筛查P S L为阳性结果, 但校正P S L小于筛查P S L时( 相差1到2个数量级) , 表明测量有误, 需要重新进行测量。G B2 3 7 4 82 0 1 64 第二法 D N A彗星试验法7 原理D NA分子经过辐照后会发生断裂。将细胞包埋在琼脂中, 用裂解试剂溶解细胞膜, 然后在一定的电压下进行电泳。受损的D NA片段在电场中向阳极方向快速移动, 形成尾状分布。染色后,D NA受损的细胞就会出现彗星状电泳图谱, 未受辐射的细胞图谱接近圆形或者轻微拖尾。8 试剂除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为G B/T6 6 8 2规定的三级水。8.1 二甲基亚砜(DM S O,C2H6O S) 。8.2 氯化钠(N a C l) 。8.3 氯化钾(K C l) 。8.4 磷酸氢二钠(N a2H P O41 2 H2O) 。8.5 磷酸二氢钾(KH2P O4) 。8.6 乙二胺四乙酸二钠(N a2E D T A,C1 0H1 4N2O8N a22 H2O) 。8.7 氢氧化钠(N a OH) 。8.8 三羟甲基氨基甲烷(T r i s,C4H1 1NO3) 。8.9 硼酸(H3B O3) 。8.1 0 十二烷基磺酸钠(S D S,C1 2H2 5O4N a S) 。8.1 1 吖啶橙(C1 7H1 9N3HC lZ n C l2) 。8.1 2 溴化乙锭(C2 1H2 0B r N3) 。8.1 3 三氯乙酸(T C A,C2HC l3O2) 。8.1 4 硫酸锌(Z n S O4) 。8.1 5 甘油(C3H8O3) 。8.1 6 碳酸钠(N a2C O3) 。8.1 7 硝酸铵(NH4NO3) 。8.1 8 硝酸银(A g NO3) 。8.1 9 钨硅酸(H4S i(W3O1 0)4 x H2O) 。8.2 0 甲醛(CH2O) 。8.2 1 冰乙酸(CH3C OOH) 。8.2 2 磺化吡啶(C1 0H1 2O4N2S) 。8.2 3 琼脂糖。8.2 4 低熔点琼脂糖。9 试剂配制试验中所用的试剂配制见附录A。G B2 3 7 4 82 0 1 65 1 0 仪器和设备1 0.1 水平电泳槽。1 0.2 电子天平: 感量为0.1g。1 0.3 电加热磁力搅拌器。1 0.4 微波炉。1 0.5 微孔滤膜: 孔径1 0 0m、2 0 0m、5 0 0m。1 0.6 显微镜载玻片:7 6mm2 6mm, 带磨砂边。1 0.7 荧光显微镜:1 0 0倍4 0 0倍; 蓝色激发波长4 6 0n m4 8 5n m, 用于吖啶橙染色观察; 绿色激发波长5 1 5n m5 6 0n m, 用于磺化吡啶或溴化乙锭染色观察。1 1 分析步骤1 1.1 样品制备1 1.1.1 动物组织1 1.1.1.1 骨髓样品制备切开骨头, 称取约5 0m g骨髓置于试管中, 加入3m L冰预冷的P B S缓冲液。用玻璃棒搅拌, 将细胞悬起, 用1 0 0m的微孔滤膜过滤细胞悬液, 收集滤液并将滤液置于冰盒上, 备用( 细胞悬液可置于冰上放置, 时间不超过1 0m i n; 在加入5%1 0%的DM S O作为防冻剂后, 细胞可置于-2 0保存2 6h) 。1 1.1.1.2 肌肉组织样品制备用解剖刀将肌肉组织切成薄片( 不能有可见脂肪) 。称取1g肌肉置于小烧杯中, 加入5m L冰预冷的P B S缓冲液。将该烧杯置于冰盒中, 玻璃棒搅拌5m i n, 依次用5 0 0m和2 0 0m的微孔滤膜过滤,收集滤液并在冰盒上放置5m i n, 备用。1 1.1.2 植物组织1 1.1.2.1 原粮、 坚果和调味料等食品称取样品0.2 5g, 用研钵碾碎, 置于小烧杯中, 加入3m L冰预冷的P B S缓冲液。将该烧杯置于冰盒中, 用玻璃棒搅拌5 m i n, 依次用5 0 0m和2 0 0m的微孔滤膜过滤, 收集滤液并在冰盒上放置1 5m i n 6 0m i n, 备用。1 1.1.2.2 草莓等浆果称取0.2 5g草莓浆果, 用研钵碾碎, 置于小烧杯中, 加入3m L冰预冷的P B S缓冲液。将该烧杯置于冰盒中, 用玻璃棒搅拌5m i n, 依次用5 0 0m和2 0 0m的微孔滤膜过滤, 收集滤液并在冰盒上放置1 5m i n 6 0m i n, 备用。1 1.1.2.3 蔬菜( 不包括食用菌)将蔬菜的可食部分用解剖刀切成薄片, 取4g, 加入5m L冰预冷的P B S缓冲液, 用研钵碾碎, 置于小烧杯中, 加入3m L冰预冷的P B S。将该小烧杯置于冰盒中, 玻璃棒搅拌5m i n, 依次用5 0 0m和2 0 0m的微孔滤膜过滤, 收集滤液并在冰盒上放置1 5m i n 6 0m i n, 备用。G B2 3 7 4 82 0 1 66 1 1.2 预涂载玻片涂布前, 应将载玻片用甲醇浸泡以除去表面油脂。风干后, 滴一滴( 约5 0L) 涂层琼脂糖溶液于载玻片上, 立即取另一个载玻片盖在琼脂糖上, 使琼脂糖溶液散开, 取下上层载玻片, 风干3 0m i n, 待用。1 1.3 包埋凝胶取1 0 0L细胞悬液与1m L包埋凝胶溶液混匀, 然后取1 0 0L该混合液用微量移液器的吸头轻轻涂布在预涂载玻片上, 立即盖上盖玻片使凝胶铺展均匀, 注意不可产生气泡。将载玻片置于冰盒上5m i n, 然后用解剖刀尖将盖玻片从琼脂糖上剥离。1 1.4 溶解细胞将1 1.3制备的载玻片完全浸入裂解缓冲液中( 动物细胞5m i n, 植物细胞1 5m i n) , 使细胞溶解, 溶解过程不要碰触琼脂糖。1 1.5 回湿将载玻片浸入电泳缓冲液中, 时间5m i n。1 1.6 电泳将载玻片并排放入水平电泳槽, 磨砂边缘朝向阴极。电泳槽中加入电泳缓冲液没过载玻片2mm4mm。室温下电泳2 0m i n, 电压2V/c m。关闭电源后, 将载玻片放入水中5m i n, 室温下风干1h。1 1.7 染色1 1.7.1 吖啶橙、 磺化吡啶或溴化乙锭染色将载玻片浸入染色液( 吖啶橙染色液、 磺化吡啶染色液或溴化乙锭染色液)3m i n 5m i n, 然后浸入水中清洗0.5m i n 1m i n, 擦干载玻片下多余的水分, 荧光显微镜观察。1 1.7.2 硝酸银染色将载玻片置于混合液A1 0m i n, 水洗1m i n,4 05 0恒温干燥箱干燥1h或室温风干。然后将载玻片浸入混合液D1 0m i n 2 0m i n, 重复该步骤1次2次, 染色时间5m i n 1 0m i n, 直至载玻片呈现棕色。水洗1m i n, 用停止液E浸泡5m i n停止染色反应, 再水洗1m i n。最后将载玻片室温放置,自然风干。染色后的载玻片不会褪色, 可长期保存观察。注:荧光染料易淬灭, 染色要迅速; 染色液有毒, 试验结束后, 应对废液进行净化处理再行弃置。1 1.8 观察鉴别1 1.8.1 荧光观察吖啶橙染色的载玻片应用荧光显微镜(4 6 0n m4 8 5n m, 蓝光激发) 观察, 染色D NA发出绿色荧光。磺化吡啶或溴化乙锭染色的载玻片应用荧光显微镜(5 1 5n m5 6 0n m, 绿色激发) 配合5 9 0n m滤光片观察, 染色D NA发出红色荧光。1 1.8.2 白光观察硝酸银染色的载玻片可使用普通显微镜观察。G B2 3 7 4 82 0 1 67 1 2 分析结果的表述1 2.1 结果表述通过显微镜观察, 辐照过的样品几乎没有完整细胞, 全部是彗星图像( 见图B.1和图B.2) ; 未受损的细胞不拖尾或者有轻拖尾( 见图B.3和图B.4) 。1 2.2 判定结果出现彗星图像时, 结果报告为阳性, 样品可能经过辐照。未出现彗星图像时, 结果报告为阴性, 样品未经辐照。1 3 限制性说明实际上不同样品产生的彗星形状会有明显差异, 而且其他处理过程也可能影响D NA形态, 这给辐照食品的判定带来困难。故D NA彗星试验法只能作为辐照食品的筛查办法, 最终确定食品是否接受了辐照, 需要配合其他辐照食品确证方法进行检测。第三法 微生物学筛选法1 4 术语和定义内毒素(e n d o t o x i n)革兰氏阴性菌的菌体中存在的毒性物质的总称, 是细菌细胞壁上的特有成分, 其毒性成分主要为类脂质A。只有在细菌裂解后, 内毒素才会释放出来, 可引起宿主发热和内毒素休克等症状。1 5 原理在适宜条件下, 细菌内毒素可激活鲎试剂中的凝固酶原, 使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。内毒素与革兰氏阴性菌含量呈正相关, 所以可根据内毒素的含量测定革兰氏阴性菌的含量。食品经过一定剂量的辐照后, 食品中的革兰氏阴性细菌基本上被杀死, 但残留的内毒素不会因辐照处理而消失。因此可通过内毒素浓度测定, 计算被辐照食品中死亡和存活革兰氏阴性细菌的总数, 同时对食品中存活的革兰氏阴性细菌进行培养计数, 通过两者的差异, 可判断食品是否经过辐照。若两个数值的差异明显, 表明样品可能接受过辐照。1 6 试剂和材料1 6.1 试剂1 6.1.1 鲎试剂: 灵敏度0.5E U/m L。1 6.1.2 注射用无热源生理盐水。1 6.2 材料1 6.2.1 蛋白胨溶液( 见C.1) 。G B2 3 7 4 82 0 1 68 1 6.2.2 营养琼脂培养基( 见C.2) 。1 6.2.3 牛奶琼脂培养基( 见C.3.1) 。1 6.2.4 结晶紫溶液( 见C.3.2) 。1 6.2.5 青霉素溶液( 见C.3.3) 。1 6.2.6 革兰氏阴性细菌选择性培养基( 见C.3.4) 。1 6.3 标准品内毒素标准样品(C A S号1 2 3 5 5 0 3) :5 0E U/管, 纯度9 9%。1 6.4 标准溶液配制内毒素标准液: 取内毒素标准样品, 加入1m L无热源生理盐水, 溶解为5 0E U/m L的标准溶液。1 7 仪器和设备1 7.1 可调温水浴锅。1 7.2 高压灭菌锅。1 7.3 电子天平: 感量0.1g。1 7.4 恒温干燥箱。1 7.5 涡旋振荡器。1 7.6 电热恒温培养箱。1 7.7 均质器:80 0 0r/m i n 1 00 0 0r/m i n。1 8 分析步骤注:样品应在4保存,2 4h内检验。如不能立即检验, 应置于-2 0保存, 最长保存时间不超过3 0d。1 8.1 制样无菌条件下, 在样品的不同部位取样, 共取1 0g。将样品置于无菌塑料容器中, 用一次性针筒加入9 0m L无热源生理盐水。80 0 0r/m i n均质1m i n 2m i n, 制成浓度为1 0-1的样品溶液,4保存备用,最长保存时间不超过2 4h。1 8.2 革兰氏阴性细菌培养计数1 8.2.1 培养基制备制备蛋白胨溶液、 营养琼脂培养基、 革兰氏阴性菌选择性培养基( 见附录C) , 倾注平板前将融化的培养基于4 51水浴保温。1 8.2.2 稀释和培养1 8.2.2.1 根据样品污染情况, 对样品溶液(1 0-1) 作进一步的稀释, 用蛋白胨溶液对样品稀释液按照9m L比1m L的体积比进行1 0倍梯度稀释, 得到浓度为1 0-21 0-5的样品稀释液。1 8.2.2.2 将0.1m L不同稀释度的样品稀释液涂布在琼脂营养板上, 室温下, 正面向上静置9 0m i n。每个稀释度做2个平板。1 8.2.2.3 每个平板覆盖1 0m L革兰氏阴性菌选择性培养基。水平放置, 使琼脂凝固。倒置平板于G B2 3 7 4 82 0 1 69 2 11培养箱中培养2 4h1h。1 8.2.2.4 选择菌落数为1 53 0 0的2个连续稀释度平板计数( 见表D.1的例1) 。每克样品中的革兰氏阴性菌数按式(1) 计算:N=cVn1+ 0.1n2()d(1) 式中:N 每克样品中革兰氏阴性细菌数, 单位为菌落形成单位每克(C F U/g) ;c 长有1 5个3 0 0个菌落的2个连续稀释度平板的菌落之和;V 每个平板接种的菌液体积, 单位为毫升(m L) ;n1 第一个稀释度的计数平板数;n2 第二个稀释度的计数平板数;d 计数有效平板的第一个稀释度。若只有一个稀释度的平板长有1 5个3 0 0个菌落时, 则n2计为0( 见表D.1的例2) 。若所有稀释度的平板菌落数均小于1 5时, 则以菌落数最多的平板的菌落数作为N值的估计值( 见表D.1的例3) 。若所有稀释度的平板菌落均未长菌时, 结果表示为未检测到革兰氏阴性菌,N值计为0( 见表D.1的例4) 。1 8.3 内毒素检测1 8.3.1 鲎试剂检测1 8.3.1.1 鲎试剂溶解与分装按试剂标示量, 加入无热源生理盐水溶解, 混匀, 以每支0.1m L分装于安培瓶内。1 8.3.1.2 样品稀释使用9 6孔板稀释样品。每一个样品稀释孔中加入6 5 0L无热源生理盐水。取3 0 0L样品溶液加入到第一个样品稀释孔中, 混合均匀, 得到1 0-0.5样品稀释液。将3 0 0L1 0-0.5样品稀释液加入到第二个样品稀释孔中, 得到1 0-1样品稀释液。再将3 0 0L1 0-1样品稀释液加入到第三个样品稀释孔中,得到1 0-1.5样品稀释液。继续稀释, 直到最后一个稀释倍数的样品内毒素检测为阴性( 见图D.3) 。最终的稀释倍数视样品情况而定。1 8.3.1.3 内毒素标准品溶液稀释将配制好的内毒素标准液按照1 8.3.2.2中的样品稀释法进行不同倍数的稀释。1 8.3.1.4 鲎试剂检测反应在9 6孔板中进行。以内毒素标准品溶液作为阳性对照, 无热源生理盐水作为阴性对照。每个反应孔中加入0.1m L稀释样品和0.1m L鲎试剂, 混匀。盖上9 6孔板盖子, 置于3 70.5水浴中反应1h。1 8.3.2 结果计数当试剂发生完全凝集时记为“+” , 部分凝集时记为“+/-” , 未凝集时记为“-” 。1 8.3.3 内毒素定量根据不同稀释倍数内毒素标准品溶液的检测情况确定检测鲎试剂的灵敏度。以发生凝固的最后一G B2 3 7 4 82 0 1 61 0 个样品稀释溶液的滴度用于计算, 如果完全凝固时, 以实际滴度用于计算( 见表D.2中例1) , 如果为部分凝固“+/-” 时, 则以该倍数的指数减去0.2 5后作为滴度值用于计算( 见表D.2中例2) 。每克样品中内毒素含量按式(2) 计算:L A L=c1 0t1 01 0T(2) 式中:L A L 每克样品中内毒素含量, 单位为内毒素单位每克(E U/g) ;c 标准品中内毒素含量, 单位为内毒素单位每毫升(E U/m L) ;t 样品的滴度值;T 标准品稀释倍数。1 9 分析结果的表述1 9.1 结果分析1 9.1.1 计算l g L A L、l g N和l g L A L- l g N值。1 9.1.2 l g L A L- l g N0时, 表示样品经检测含有较高的内毒素含量, 但经培养的革兰氏阴性菌数目较少或者未检测出有可培养的革兰氏阴性菌。1 9.1.3 l g L A L-l g N值0, 表示样品经检测含有较高的内毒素含量, 且培养的革兰氏阴性菌数目较多。1 9.1.4 l g L A L2表示样品中内毒素含量较低。1 9.1.5 l g N0时, 判定该样品可能经过辐照处理。1 9.2.2 l g L A L- l g N值0, 判定该样品未经过辐照处理。1 9.2.3 l g L A L2且l g N3 0 03 0 03 0 03 0 02 5 62 3 61 61 8N=2 5 6+2 3 6+1 6+1 80.1(2+0.2)1 0- 327 85 3622101N=7 8+5 30.121 0- 1345230000N=5400000000N=0 注:N 每克样品中革兰氏阴性细菌数, 单位为C F U/g。D.2 内毒素滴度计算示例表内毒素滴度计算示例见表D.2。表D.2 内毒素滴度计算示例例次稀释度及内毒素反应情况1 0-0.51 0-1.01 0-1.51 0-2.01 0-2.51 0-3.0滴度1+-2.02+/-1.7 5 注:“+” 代表试剂完全凝集, “-” 代表试剂未凝集“ ,+/-” 代表试剂部分凝集。D.3 9 6孔板稀释样品溶液示意图9 6孔板稀释样品溶液操作步骤见图D.1。G B2 3 7 4 82 0 1 61 8 图D.1 9 6孔板稀释样品溶液示意图注:第1步, 在每一个样品稀释孔中加入6 5 0L无热源生理盐水。第2步, 在第一个稀释孔中加入3 0 0L样品溶液, 混匀。第3步, 将第一个稀释孔中的测试液3 0 0L加入到第二个稀释孔中, 混匀。第4步, 重复第2步、3步, 直到样品稀释到合适的倍数。