实验二微生物的分离、纯化和接种讲课讲稿.doc

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实验二 微生物的分离、纯化和接种
微生物的分离、纯化
1、目的要求
1.1了解微生物分离和纯化的原理
1.2掌握常用的纯化分离微生物的方法
2、基本原理
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、pH值、温度和溶解氧等要求，或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成。而纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。
本实验将在混合有几种微生物菌液中分离纯化出两种微生物来。
3、实验材料
3.1培养基
肉汤培养基（固体）。
3.2溶液或试剂
盛4.5ml无菌水的试管，其中有一只盛有玻璃珠。
3.3仪器或其他用具
无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，涂布器等。
4流程
倒平板 制备梯度稀释液 涂布（或划线法） 培养 挑单菌落 保存。
5、步骤
5.1平板划线分离法
5.1.1倒平板
倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml,加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后置于桌面上，待凝固后即成平板(教材p367图13-14)。并用记号笔标明培养基名称、菌液编号和试验日期。
5.1.2划线
在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取菌悬液一环在平板上划线(教材p367图13-15)。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。
常用的划线方法有:用接种环以无菌操作挑取菌悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3~4条，再转动培养皿约70度角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。
5.1.3 挑菌落
同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。
5.1.4 结果判定
所做划线法是否较好地得到了单菌落? 如果不是，请分析其原因。

(二)微生物的接种技术
1目的
1.1学习掌握微生物的儿种接种技术
1.2 建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节
2 实验说明
将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项基本操作技术。无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定以及有关微生物形态观察及生理研究都必须进行接种。接种的关键是严格进行无菌操作，如操作不慎引起污染，则实验结果不可靠，影响下一步工作的进行。
3 实验器材
3.1器械和用品
酒精灯，玻璃铅笔，火柴，试管架、接种环、接种针、滴管、移液管、三角型接种棒等接种工具。
3.2 菌种和培养基
菌种: 大肠杆菌(Escherichiacol)，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
培养基: 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
4操作步骤
4.1斜面接种法
斜面接种法主要用于接种纯菌，使其增殖后用以鉴定或保存菌种。
通常先从平板培养基上挑取分离的单个菌落，或挑取斜面，肉汤中的纯培养物接种到斜面培养基上。操作应在无菌室、接种柜或超净工作台上进行，先点燃酒精灯。
将菌种斜面培养基(简称菌种管)与待接种的新鲜斜面培养基(简称接种管)持在左手拇指、食指、中指及无名指之间，菌种管在前，接种管在后，斜面向上管口对齐，应斜持试管呈45度角，并能清楚地看到两个试管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面。以右手在火焰旁转动两管棉塞，使其松动，以便接种时易于取出。
右手持接种环柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧。镍铬丝部分(环和丝)必须烧红，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接镍铬丝的螺口部分，要彻底灼烧以免灭菌不彻底。用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。棉塞应始终夹在手中如掉落应更换无菌棉塞。
将灼烧灭菌的接种环插入菌种管内，先接触无菌落生长的培养基上，待冷却后再从斜面上刮取少许菌苔取出，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管。在试管中由下往上做S形划线。接种完毕，接种环应通过火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔细灼烧接种环后，放回原处，并塞紧棉塞。将按种管贴好标签或用玻璃铅笔划好标记后再放入试管架，即可进行培养。
4.2 液体接种法(了解示范)
多用于增菌液进行增菌培养，也可用纯培养菌接种液体培养基进行生化试验，其操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同，仅将不同点介绍如下:
由斜面培养物接种至液体培养基: 用接种环从斜面上沾取少许菌苔，接至液体培养基时应在管内靠近液面试管壁上将菌苔轻轻研磨并轻轻振荡，或将接种环在液体内振摇几次即可。如接种霉菌菌种时，若用接种环不易挑起培养物时，可用接种钩或接种铲进行。
由液体培养物接种液体培养基时，可用接种环或接种针沾取少许液体移至新液体培养基即可。也可根据需要用吸管、滴管或注射器吸取培养液移至新液体培养基即可。
接种液体培养物时应特别注意勿使
菌液溅在工作台上成其他器皿上，以免造成污染。如有溅污，可用酒精棉球灼烧灭菌后，再用消毒液擦净。凡吸过菌液的吸管或滴管，应立即放入盛有消毒液的容器内。
4.3 固体接种法
普通斜面和平板接种均属于固体接种，斜面接种法已讲了，不再赘述。固体培养基接种的另一种形式是接种固体曲料，进行固体发酵。
按所用菌种或种子菌来源不同可分为：用菌液接种固体料，包括用菌苔刮洗制成的菌悬液和直接培养的种子发酵液。接种时按无菌操作将菌液直接倒入固体料中，搅拌均匀。但要注意接种所用水容量要计算在固体料总加水量之内，否则会使接种后含水量加大，影响培养效果。
用固体种子接种到固体料。包括用孢子粉、菌丝孢子混合种子菌或其他固体培养的种子菌。将种子菌于无菌条件下直接倒入无菌的固体料中即可，但必须充分搅拌使之混合均匀。一般是先把种子菌和少部分固体料混匀后再拌大堆料。
5 结果
（1）记录并描绘斜面接种的微生物生长情况和培养特征
（2）平板划线接种的菌落形态特征描绘
菌名
特征描述
大小
形态
干湿
高度
透明度
颜色
边缘
金黄色葡萄球菌
小
圆形
干扁平

半透明
金黄色
整齐
大肠杆菌
中
圆形
湿润
扁平
半透明
乳白色
不整齐
菌落特征描述方法如下：
1大小：大，中，小，针尖状 2形态：圆形，不规则等
3干湿情况：干燥，湿润，粘稠 4高度：扁平，隆起，凹下
5透明度：透明，半透明，不透明 6边缘：整齐，不整齐
7颜色：黄色，金黄色，灰色，乳白色，红色，粉红色，黑色等
6思考题
6.1培养微生物为什么要把培养皿倒置培养？
6.2为什么从事微生物实验工作的基本要求是无菌操作？

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