常见病原微生物的检测讲义.pptx

1 第六章食物传播的病原微生物及其检验第六章食物传播的病原微生物及其检验n第一节第一节 细菌性病原微生物及其检验细菌性病原微生物及其检验n主要内容主要内容n1.炭疽杆菌炭疽杆菌n2.布氏杆菌病布氏杆菌病n3.结核分枝杆菌结核分枝杆菌n4.伤寒和副伤寒沙门氏菌伤寒和副伤寒沙门氏菌n5.痢疾志贺氏菌痢疾志贺氏菌n（生物学特性、致病机制、检测方法生物学特性、致病机制、检测方法）2n兔血浆制备兔血浆制备:无菌采取兔心脏血无菌采取兔心脏血,以以1份灭菌的份灭菌的3.8%枸枸橼酸钠液抗凝剂橼酸钠液抗凝剂加加4份兔血的比例充分混匀份兔血的比例充分混匀,离心离心,吸取吸取上清液即为原兔血浆上清液即为原兔血浆,分装分装成成1ml/支或支或0.5ml/支支;n另用另用灭菌生理盐水灭菌生理盐水稀释兔血浆稀释兔血浆,制成制成4倍稀释血浆倍稀释血浆(以下以下简称为稀释兔血浆简称为稀释兔血浆),分装同上分装同上,于于-18以下冰冻保存以下冰冻保存,供试验供试验 遗留问题遗留问题3第一节第一节 炭疽杆菌（一）炭疽杆菌（一）n炭疽杆菌炭疽杆菌（Bacillus anthraci）属于需氧芽胞杆菌属，属于需氧芽胞杆菌属，能引起羊、牛、马等动物及人类的炭疽病。炭疽杆菌曾被帝国主能引起羊、牛、马等动物及人类的炭疽病。炭疽杆菌曾被帝国主义作为致死战剂之一。义作为致死战剂之一。n（一）生物学性状（一）生物学性状n1.菌体粗大，排列似竹节状，无鞭毛，无动力，菌体粗大，排列似竹节状，无鞭毛，无动力，革兰氏染色阳性革兰氏染色阳性，本菌在氧气充足，温度适宜本菌在氧气充足，温度适宜（2530）的条件下易形成芽胞的条件下易形成芽胞。42.在在活体活体或未经解剖的尸体内，则不能形成芽胞。芽胞呈椭或未经解剖的尸体内，则不能形成芽胞。芽胞呈椭圆形，位于菌体中央，其宽度小于菌体的宽度。圆形，位于菌体中央，其宽度小于菌体的宽度。3.形成荚膜形成荚膜是毒性特征。是毒性特征。4.炭疽杆菌受低浓度青霉素作用，菌体可肿大形成园珠，称炭疽杆菌受低浓度青霉素作用，菌体可肿大形成园珠，称为为“串珠反应串珠反应”。这也是炭疽杆菌特有的反应。这也是炭疽杆菌特有的反应。5n1.本菌专性需氧或兼性厌氧，在普通培养基中易繁殖。本菌专性需氧或兼性厌氧，在普通培养基中易繁殖。n2.最适温度为最适温度为37，最适，最适pH为为7.27.4n3.在琼脂平板培养在琼脂平板培养24小时，粗糙菌落。菌落呈毛玻璃状，边缘小时，粗糙菌落。菌落呈毛玻璃状，边缘不整齐，呈卷发状，有一个或数个小尾突起，这是本菌向外伸不整齐，呈卷发状，有一个或数个小尾突起，这是本菌向外伸延繁殖所致延繁殖所致。（二）培养特性（二）培养特性6n4.在在510%绵羊血液琼脂平板上，菌落周围无明显的绵羊血液琼脂平板上，菌落周围无明显的溶血环，但培养较久后可出现轻度溶血。菌落有粘性，溶血环，但培养较久后可出现轻度溶血。菌落有粘性，用接种针钩取可拉成丝，用接种针钩取可拉成丝，称为称为“拉丝拉丝”现象现象。n5.在普通肉汤培养在普通肉汤培养1824小时，管底有絮状沉淀生长，小时，管底有絮状沉淀生长，无菌膜，菌液清亮。无菌膜，菌液清亮。有毒株在碳酸氢钠平板，有毒株在碳酸氢钠平板，20%CO2培养下，形成粘液状菌落（有荚膜），而无培养下，形成粘液状菌落（有荚膜），而无毒株则为粗糙状。毒株则为粗糙状。7n（三）抵抗力（三）抵抗力n繁殖体抵抗力不强，易被一般消毒剂杀灭，而芽胞抵抗力繁殖体抵抗力不强，易被一般消毒剂杀灭，而芽胞抵抗力强，在干燥的室温环境中可存活数十年，在皮毛中可存活强，在干燥的室温环境中可存活数十年，在皮毛中可存活数年。牧场一旦被污染，芽胞可存活数年至数十年。煮沸数年。牧场一旦被污染，芽胞可存活数年至数十年。煮沸1010分钟或干热分钟或干热14031403小时可将芽胞杀死。炭疽芽胞对碘特小时可将芽胞杀死。炭疽芽胞对碘特别敏感，对青霉素、链霉素、卡那霉素等高度敏感。别敏感，对青霉素、链霉素、卡那霉素等高度敏感。8一）致病性一）致病性n人类主要通过工农业生产而感染。机体抵抗力降低时，接人类主要通过工农业生产而感染。机体抵抗力降低时，接触污染物品可发生下列疾病：触污染物品可发生下列疾病：n1皮肤炭疽，最常见，多发生于屠宰或毛刷工人及饲养皮肤炭疽，最常见，多发生于屠宰或毛刷工人及饲养员。员。n2纵隔障炭疽，纵隔障炭疽，少见。由吸入病菌芽胞所致，多发生于少见。由吸入病菌芽胞所致，多发生于皮毛工人，病死率高。病初似感冒，进而出现严重的支气皮毛工人，病死率高。病初似感冒，进而出现严重的支气管肺炎，可在管肺炎，可在23天内死于中毒性休克。天内死于中毒性休克。二、致病性与免疫性二、致病性与免疫性9n3肠炭疽，肠炭疽，由食入病兽肉制品所致，以全身中毒症状由食入病兽肉制品所致，以全身中毒症状为主，并有胃肠道溃疡、出血及毒血症，发病后为主，并有胃肠道溃疡、出血及毒血症，发病后23日内死亡。日内死亡。n上述疾病若引起上述疾病若引起败血症时败血症时，可继发，可继发“炭疽性脑膜炎炭疽性脑膜炎”。炭疽杆菌的致病性取决于荚膜和毒素的协同作用。炭疽杆菌的致病性取决于荚膜和毒素的协同作用。10n（二）免疫性n注射炭疽外毒素中保护性抗原于机体，能形成抗毒素免疫，注射炭疽外毒素中保护性抗原于机体，能形成抗毒素免疫，对受染炭疽有保护作用。但单纯的荚膜抗体对机体没有保护对受染炭疽有保护作用。但单纯的荚膜抗体对机体没有保护作用。病后可获较强的免疫力。作用。病后可获较强的免疫力。11三、微生物学检查三、微生物学检查n1.采集皮肤炭疽的脓液、渗出物，肠炭疽的粪便以及病人的采集皮肤炭疽的脓液、渗出物，肠炭疽的粪便以及病人的的血液等送检，的血液等送检，兽尸禁止解剖，兽尸禁止解剖，可割取耳朵或舌尖一片送检。可割取耳朵或舌尖一片送检。n2.将标本直接涂片，沙黄荚膜染色镜检，观察形态及荚膜特将标本直接涂片，沙黄荚膜染色镜检，观察形态及荚膜特征，可以初步帮助诊断。征，可以初步帮助诊断。12n3.确诊应进行确诊应进行血平板分离培养血平板分离培养，37孵育孵育1215小时，小时，钩取可疑菌落，钩取可疑菌落，进行进行青霉素串珠试验青霉素串珠试验，噬菌体裂解试，噬菌体裂解试验，碳酸氢钠平板二氧化碳培养。荚膜肿胀试验和小验，碳酸氢钠平板二氧化碳培养。荚膜肿胀试验和小白鼠致病力试验等与其他需氧芽胞杆菌进行鉴别确定。白鼠致病力试验等与其他需氧芽胞杆菌进行鉴别确定。13四、特异防治四、特异防治n1.预防人类炭疽首先应防止家畜炭疽的发生。家畜炭疽预防人类炭疽首先应防止家畜炭疽的发生。家畜炭疽感染消灭后，人类的传染源也随之消灭。感染消灭后，人类的传染源也随之消灭。n2.目前我国使用的炭疽活疫菌，作目前我国使用的炭疽活疫菌，作皮上划痕皮上划痕接种，免疫接种，免疫力可维护半年至一年。青霉素是治疗炭疽的首选药物，力可维护半年至一年。青霉素是治疗炭疽的首选药物，对肠道及吸入性炭疽治疗困难，有条件的可用抗血清对肠道及吸入性炭疽治疗困难，有条件的可用抗血清。14五、检测方法五、检测方法n1.环状沉淀反应环状沉淀反应n2.噬菌体裂解实验噬菌体裂解实验n3.荚膜荧光抗体检测荚膜荧光抗体检测n4.质谱分析法质谱分析法15第一节第一节 布鲁氏杆菌布鲁氏杆菌（二）n本菌属初次分离培养时多呈小球杆状，本菌属初次分离培养时多呈小球杆状，毒力菌株有荚膜毒力菌株有荚膜，经，经传代培养渐呈杆状，传代培养渐呈杆状，革兰氏染色阴性革兰氏染色阴性。n我国流行的是我国流行的是羊、羊、牛、猪布氏杆菌牛、猪布氏杆菌一、生物学性状一、生物学性状1.形态染色形态染色16n本菌为本菌为严格需氧菌严格需氧菌；n牛布氏杆菌在初次分离时，需在牛布氏杆菌在初次分离时，需在510%CO2环境中才能生环境中才能生长，最长，最适温度适温度37，最适的，最适的pH6.67.1，营养要求高，生，营养要求高，生长时需长时需硫胺素，烟草酸和生物素，泛酸钙硫胺素，烟草酸和生物素，泛酸钙等，实验室常用等，实验室常用肝浸液培养基或改良厚氏培养基肝浸液培养基或改良厚氏培养基。n此菌生缓慢，培养此菌生缓慢，培养48小时后才出现透明的小菌落，鸡胚培小时后才出现透明的小菌落，鸡胚培养也能生长。养也能生长。2.培养特性培养特性17n在自然界中抵抗力较强，在在自然界中抵抗力较强，在病畜的脏器和分泌物中病畜的脏器和分泌物中，一，一般能存活般能存活4个月左右，在个月左右，在食品中食品中约能生存约能生存2个月。对低温个月。对低温的抵抗力也强，对热和消毒剂抵抗力弱。对的抵抗力也强，对热和消毒剂抵抗力弱。对链霉素、氯链霉素、氯霉素和四环素霉素和四环素等均敏感。等均敏感。3.抵抗力抵抗力18n本菌侵入人体后，被吞噬细胞吞噬，由于本菌侵入人体后，被吞噬细胞吞噬，由于本菌具有荚膜本菌具有荚膜，能抵，能抵抗吞噬细胞的吞噬消毁，并能在该细胞内增殖。反复出现抗吞噬细胞的吞噬消毁，并能在该细胞内增殖。反复出现菌血菌血症症。由于内毒素的作用，病人出现。由于内毒素的作用，病人出现发热、无力等中毒症状发热、无力等中毒症状，血，血流中细菌逐步消失，体温也逐渐消退。细菌在细胞内繁殖至一流中细菌逐步消失，体温也逐渐消退。细菌在细胞内繁殖至一定程度时，再次进入血流又出现菌血症，体温再次上升，反复定程度时，再次进入血流又出现菌血症，体温再次上升，反复呈波浪热型。呈波浪热型。二、致病性和免疫性二、致病性和免疫性19 人感染布氏杆菌表现乏力，全身软弱，食欲不振，失眠，咳人感染布氏杆菌表现乏力，全身软弱，食欲不振，失眠，咳嗽，有白色痰，可听到肺部干鸣，多呈波浪热，也有稽留热、嗽，有白色痰，可听到肺部干鸣，多呈波浪热，也有稽留热、不规则热或不发热。不规则热或不发热。盗汗或大汗，一个或多个关节发生无红肿热的疼痛，肌肉酸盗汗或大汗，一个或多个关节发生无红肿热的疼痛，肌肉酸痛，痛，由于关节和肌肉疼痛难忍，即使不发烧也不能劳动，成为由于关节和肌肉疼痛难忍，即使不发烧也不能劳动，成为能吃不能活懒汉，故该病又被称作能吃不能活懒汉，故该病又被称作懒汉病懒汉病。病灶发生在生殖器官，影响生育，严重者可引起死亡。病灶发生在生殖器官，影响生育，严重者可引起死亡。三、主要症状三、主要症状20本菌传染性大，要注意防止实验室污染。本菌传染性大，要注意防止实验室污染。（一）分离培养（一）分离培养急性期急性期采集血液，采集血液，慢性期慢性期采取骨髓，接种于采取骨髓，接种于双相肝浸液培养基双相肝浸液培养基（一半斜面，一半液体）置（一半斜面，一半液体）置3710%CO2环境中培养，每隔环境中培养，每隔2天检查一次，如无细菌生长则摇荡培养基，使液体浸过斜面天检查一次，如无细菌生长则摇荡培养基，使液体浸过斜面上，有细菌生长，可依鉴定项目确定是否为布氏杆菌。经一上，有细菌生长，可依鉴定项目确定是否为布氏杆菌。经一月培养无细菌生长，可报告阴性。月培养无细菌生长，可报告阴性。四、微生物学检验四、微生物学检验21（二）血清学检查二）血清学检查通常作凝集试验，判定通常作凝集试验，判定凝集效价凝集效价1：50可疑，可疑，1：100以上为阳性。效价增高以上为阳性。效价增高4倍以上时，更有诊断价值。倍以上时，更有诊断价值。（三）酶联免疫吸附检测（三）酶联免疫吸附检测22（四）（四）PCR检测检测此法敏感、特异、快速，实时荧光定量此法敏感、特异、快速，实时荧光定量PCR已用于布氏已用于布氏杆菌特异性基因的检测，即在杆菌特异性基因的检测，即在PCR反应体系中加荧光反应体系中加荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个过程。通过基团，利用荧光信号积累，实时监测整个过程。通过标准曲线可进行定量。标准曲线可进行定量。23第一节第一节 结核分枝杆菌（三）结核分枝杆菌（三）简介简介24（1 1）形态与染色）形态与染色一、生物学性状一、生物学性状25（2 2）培养特性）培养特性2627（3 3）生化反应）生化反应28（4 4）抵抗力）抵抗力29（5 5）变异性）变异性30二、致病性二、致病性31（一）致病物质（一）致病物质32 1.1.荚膜荚膜33梭状因子蜡质D硫酸脑苷脂磷脂 2.2.脂质脂质3435 3.3.蛋白质蛋白质36 4.4.多糖质多糖质37 5.5.核酸核酸38（二）所致疾病（二）所致疾病39n三、检测方法三、检测方法n检测方法：免疫学和细菌学检测n根据感染部位选择样品制作标本根据感染部位选择样品制作标本n分离培养分离培养n动物试验动物试验n快速诊断快速诊断40n是是人类霍乱人类霍乱的病原体。的病原体。引起肠道传引起肠道传染病。染病。n霍乱是一种古老且流行广泛的霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传烈性传染病。染病。n曾在世界上曾在世界上引起多次大流行引起多次大流行，主要表，主要表现为剧烈的呕吐，腹泻，失水，死亡现为剧烈的呕吐，腹泻，失水，死亡率甚高。率甚高。n属于属于国际检疫甲类传染病国际检疫甲类传染病。第一节第一节霍乱弧菌（霍乱弧菌（V.cholerae）（四）（四）41n两个生物型两个生物型：古典生物型古典生物型（霍乱的病原体）和埃尔托（霍乱的病原体）和埃尔托生物型（副霍乱的病原体）生物型（副霍乱的病原体）42流行情况流行情况43一、生物学性状一、生物学性状形态与染色形态与染色1.呈呈弧形或逗点状弧形或逗点状；排列成鱼群状排列成鱼群状2.革兰阴性；无芽孢，革兰阴性；无芽孢，无荚膜无荚膜3.有单鞭毛，运动活泼，有单鞭毛，运动活泼，呈穿梭样或流星样呈穿梭样或流星样4.有菌毛有菌毛44培养特性培养特性1.营养要求不高；营养要求不高；2.兼性厌氧菌；兼性厌氧菌；3.生长繁殖温度范围广（生长繁殖温度范围广（18-37）；）；4.嗜碱嗜碱-碱性蛋白胨碱性蛋白胨(pH8.8-9.0):初次分离培养初次分离培养TCBS平板：黄色菌落平板：黄色菌落5.可在无盐环境中生长可在无盐环境中生长 45 抵抗力抵抗力1.对热、干燥、日光，化学消毒剂和酸均很敏感对热、干燥、日光，化学消毒剂和酸均很敏感2.耐低温，耐碱。耐低温，耐碱。四怕四怕：怕醋、怕煮、怕晒、怕药。：怕醋、怕煮、怕晒、怕药。怕热不怕冷怕热不怕冷 怕干不怕湿怕干不怕湿 怕酸不怕碱怕酸不怕碱怕咸不怕淡怕咸不怕淡46毒毒素素霍乱肠毒素霍乱肠毒素(CT)：前噬菌体基因编码前噬菌体基因编码小带联结毒素小带联结毒素Zot增加肠黏膜通透性增加肠黏膜通透性副霍乱肠毒素副霍乱肠毒素Ace肠段积液肠段积液侵袭力侵袭力鞭鞭毛毛菌毛菌毛致病物质致病物质47CTCT的结构的结构B亚单位：亚单位：与小肠粘膜上皮细胞与小肠粘膜上皮细胞GM1神经节苷脂受体结神经节苷脂受体结合；合；由由1个个A亚单位和亚单位和5个个B亚单位亚单位构成的多聚体，不耐热。构成的多聚体，不耐热。（前噬菌体基因编码）（前噬菌体基因编码）1A+5B48 霍乱典型临床特征霍乱典型临床特征患者出现上吐下泻，泻出物呈患者出现上吐下泻，泻出物呈“米泔水样米泔水样”。并发症有血容量减少，并发症有血容量减少，循环衰竭循环衰竭及肾功能衰竭，导致尿闭、电解及肾功能衰竭，导致尿闭、电解质、酸碱平衡失调导致肌肉痉挛。质、酸碱平衡失调导致肌肉痉挛。49免疫性感染后可获感染后可获牢固免疫力牢固免疫力；再感染少见；再感染少见局部黏膜免疫；抗菌抗体（局部黏膜免疫；抗菌抗体（O）；抗毒素抗体（）；抗毒素抗体（B）O1群与群与O139群不存在交叉免疫保护作用群不存在交叉免疫保护作用。50 微生物学检查微生物学检查a.采集样品采集样品b.镜检镜检c.分离培养并生化反应和凝集反应分离培养并生化反应和凝集反应 PCR PCR检查检查 Southern blot Southern blot检测检测 检验方法检验方法51第二节第二节 食物传播的病毒及其检验食物传播的病毒及其检验1.1.朊病毒朊病毒2.2.禽流感病毒禽流感病毒3.3.甲型肝炎病毒甲型肝炎病毒52一、朊病毒及其检验一、朊病毒及其检验n 朊病毒朊病毒(prion)-传染性蛋白粒子传染性蛋白粒子/朊粒朊粒/朊毒体，是一种不朊毒体，是一种不同于细菌、病毒或类病毒的在分类上同于细菌、病毒或类病毒的在分类上尚未定论的病原因子尚未定论的病原因子，其，其本质为由正常宿主细胞基因编码的、构象异常的蛋白质，称为本质为由正常宿主细胞基因编码的、构象异常的蛋白质，称为朊蛋白朊蛋白(prionprotein,PrP)，目前尚未检出任何核酸成分，是目前尚未检出任何核酸成分，是人和动物的传染性人和动物的传染性海绵状脑病（海绵状脑病（TSEs)的病原体的病原体。53n （一）形态与结构（一）形态与结构nprion是一种不含核酸和脂类的疏水性糖蛋白，分子量是一种不含核酸和脂类的疏水性糖蛋白，分子量为为2730103，因此又称为，因此又称为PrP2730。大小。大小30-50nm，电镜下看不到病毒粒子，负染后看到聚集而成的棒状体，电镜下看不到病毒粒子，负染后看到聚集而成的棒状体，大小大小10-250nm100-200nm。n其能在宿主细胞内复制，无免疫性，不诱发抗体。其能在宿主细胞内复制，无免疫性，不诱发抗体。一、生物学特性一、生物学特性54n1.细胞朊病毒蛋白细胞朊病毒蛋白(cellularPrP,PrPC)：具有：具有42%的的-螺旋，螺旋，3%的的折叠。存在于正常组织及感染动物的组织中，是正常折叠。存在于正常组织及感染动物的组织中，是正常基因的产物，通基因的产物，通常情况下是无害的常情况下是无害的，对蛋白酶，对蛋白酶K敏感。敏感。n2.骚扰型朊病毒蛋白骚扰型朊病毒蛋白(scrapieprionprotein,PrPsc)：-螺旋螺旋占占30%，折叠高达折叠高达43%，仅存在于感染动物的组织中，仅存在于感染动物的组织中，与致与致病和传染有关，对蛋白酶病和传染有关，对蛋白酶K有抗性有抗性。两种不同的分子构型两种不同的分子构型55n 朊病毒颗粒对一些理化因子朊病毒颗粒对一些理化因子 的抵抗力之强，大大高于已的抵抗力之强，大大高于已知各类微生物和寄生虫。知各类微生物和寄生虫。n1.传染源：感染朊毒体的人和动物。传染源：感染朊毒体的人和动物。n2.传染途径：消化道传播。传染途径：消化道传播。n医源性传播：脑外科手术、器官移植等遗传医源性传播：脑外科手术、器官移植等遗传。（二）抵抗力（二）抵抗力（三）致病性（三）致病性56n 疯牛病疯牛病：牛海绵状脑病。病牛临床表现为步态不稳、共济：牛海绵状脑病。病牛临床表现为步态不稳、共济失调、搔痒、烦躁不安等神经症状。失调、搔痒、烦躁不安等神经症状。n绵羊痒病：绵羊痒病：它是羊的一种它是羊的一种慢性致死性疾病慢性致死性疾病，病羊具有中枢神，病羊具有中枢神经系统变性、剧痒、共济失调、高死亡率等特点。经系统变性、剧痒、共济失调、高死亡率等特点。n克克-雅氏病：雅氏病：人的一种人的一种中枢神经系统变性疾病中枢神经系统变性疾病。其临床症状。其临床症状和病理组织学变化与疯牛病、绵羊痒病十分相似。和病理组织学变化与疯牛病、绵羊痒病十分相似。3.3.导致疾病导致疾病57n共同特征：潜伏期长（可达数年至数十年），一旦发共同特征：潜伏期长（可达数年至数十年），一旦发病即呈慢性进行性发展，最终死亡。病即呈慢性进行性发展，最终死亡。n 58nPrPC转变为转变为PrPSC是是疾病发生的基本条件疾病发生的基本条件，PrPSC在中枢神在中枢神经系统细胞内聚集，导致经系统细胞内聚集，导致神经元的破坏神经元的破坏。脑组织病理学特点：脑组织病理学特点：中枢神经细胞空泡化、弥漫性神经细胞中枢神经细胞空泡化、弥漫性神经细胞缺失、胶质细胞增生、淀粉样斑块形成、脑组织海绵状改变；缺失、胶质细胞增生、淀粉样斑块形成、脑组织海绵状改变；PrPSc聚集。聚集。4.发病机理发病机理59n 1.1.免疫组化技术免疫组化技术 n 取取可疑患者的脑组织或非神经组织切片可疑患者的脑组织或非神经组织切片，经脱水性或水解，经脱水性或水解性高压消毒、甲酸和硫氰酸胍处理，使其性高压消毒、甲酸和硫氰酸胍处理，使其感染性消失并破坏感染性消失并破坏PrPCPrPC后后，再用单克隆抗体检测对上述处理有，再用单克隆抗体检测对上述处理有抗性的抗性的PrPSCPrPSC。朊病毒的检验朊病毒的检验60n 组织印迹法检测组织印迹法检测PrPSCPrPSC是一种简单而敏感的诊断方法。是一种简单而敏感的诊断方法。n方法：方法：首先将待测的样品印迹在首先将待测的样品印迹在固相载体固相载体硝酸纤维素硝酸纤维素膜膜上，用病毒的上，用病毒的家兔特异性抗体（家兔特异性抗体（IgGIgG）与吸附在固相载体与吸附在固相载体上的病毒进行特异性反应，再与酶标记的羊抗兔第二抗体进上的病毒进行特异性反应，再与酶标记的羊抗兔第二抗体进行反应，最后用酶的反应底物进行显色反应，根据颜色的变行反应，最后用酶的反应底物进行显色反应，根据颜色的变化，确定病毒的感染程度。化，确定病毒的感染程度。2.2.免疫印迹技术免疫印迹技术61n 从病人从病人外周血白细胞中提取外周血白细胞中提取DNA，对，对20号染色体号染色体prion基因进行分子遗传学分析基因进行分子遗传学分析。3.3.基因分析基因分析62 第一节第一节 禽流感病毒（二）禽流感病毒（二）n禽流感是禽流行性感冒（禽流感是禽流行性感冒（AvianInfluenza，AI）的简称，）的简称，这是一种由这是一种由甲型流感病毒甲型流感病毒的一种亚型引起的传染性疾病综合的一种亚型引起的传染性疾病综合征，被国际兽疫局定为征，被国际兽疫局定为类传染病类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。瘟。63 1.形态学特点形态学特点n禽流感病毒是禽流感病毒是正粘病毒，正粘病毒，流感病毒属的一流感病毒属的一个成员。个成员。n禽流感病毒禽流感病毒具有具有A型抗原型抗原，属于，属于A型流感病型流感病毒，列为禽流感病毒类。毒，列为禽流感病毒类。一、生物学特性一、生物学特性64n流感病毒流感病毒分为三个不同的抗原型分为三个不同的抗原型，即，即A A、B B、C C三型。其中三型。其中B B、C C两型仅能对人致病两型仅能对人致病，A A型可对人、猪、马和禽致病。型可对人、猪、马和禽致病。n依据病毒表面的依据病毒表面的两种糖蛋白血凝素两种糖蛋白血凝素HA和神经氨酸酶和神经氨酸酶NA可将可将A型流感病毒分成若干亚型。目前已有型流感病毒分成若干亚型。目前已有15种种HA（H1-H15)和和9种种NA(N1-N9)。2.禽流感病毒的分型禽流感病毒的分型65n对热的抵抗力较低，对热的抵抗力较低，6530分钟，分钟，1002分钟即灭活，分钟即灭活，普通消毒剂能很快将它杀死。普通消毒剂能很快将它杀死。n低温冻干或甘油保存可使病毒存活多年。低温冻干或甘油保存可使病毒存活多年。3.抵抗力抵抗力66n禽流感在家禽中以禽流感在家禽中以鸡和火鸡鸡和火鸡及某些野禽的易感性最高，及某些野禽的易感性最高，并呈急性致死性传染病。并呈急性致死性传染病。n鸭、鹅及其它水禽类的易感性较差，多为隐性感染或鸭、鹅及其它水禽类的易感性较差，多为隐性感染或带毒，有时也能大批死亡。鸽子可带毒，但很少自然带毒，有时也能大批死亡。鸽子可带毒，但很少自然发病。发病。4.4.流行病学流行病学67n禽流感的症状极为复杂，有禽流感的症状极为复杂，有最急性、急性、亚急性及隐性感最急性、急性、亚急性及隐性感染等。染等。n潜伏期一般较短，通常为潜伏期一般较短，通常为4-5天，体温急剧上升至天，体温急剧上升至43.3-44.4，精神沉郁、拒食、病鸡很快陷于昏睡状态，有些颈部出现，精神沉郁、拒食、病鸡很快陷于昏睡状态，有些颈部出现向后扭转的神经症状。病鸡多呈急性死亡，有的也可能向后扭转的神经症状。病鸡多呈急性死亡，有的也可能出现出现呼吸道症状，咳嗽、打喷嚏，气管出现咯音，流泪呼吸道症状，咳嗽、打喷嚏，气管出现咯音，流泪等症状，等症状，羽毛蓬松，产蛋率下降，死亡率高低不等。羽毛蓬松，产蛋率下降，死亡率高低不等。5.5.临床症状和病理变化临床症状和病理变化68n1.病原的分离病原的分离n病原的分离和鉴定可以从病原的分离和鉴定可以从活体或尸体分离病毒。活体或尸体分离病毒。n用棉拭子法常可从活体的气管和泄殖腔中分离到病毒，可用用棉拭子法常可从活体的气管和泄殖腔中分离到病毒，可用不同大小的棉拭子擦取气管或泄殖腔，然后将拭子不同大小的棉拭子擦取气管或泄殖腔，然后将拭子放入灭菌放入灭菌的保存液的保存液2550%甘油盐水、肉汤或甘油盐水、肉汤或1000u/ml青霉素和青霉素和10mg/mL链霉素的细胞维持液中。链霉素的细胞维持液中。n病料的采取时间：一般在病料的采取时间：一般在感染初期或发病急性期采取感染初期或发病急性期采取。如转。如转为后期则因机体已形成足够的抗体而不易分离到病毒为后期则因机体已形成足够的抗体而不易分离到病毒.二、诊断二、诊断69n通常用通常用鸡胚鸡胚来进行。来进行。n接种接种9-10日龄鸡胚尿囊腔，继续孵育日龄鸡胚尿囊腔，继续孵育48-72h。n如材料中含有病毒时，则接种如材料中含有病毒时，则接种48h鸡胚死亡，但在多数情况下鸡胚死亡，但在多数情况下初代分离时鸡胚多不死，为此需将经初代分离时鸡胚多不死，为此需将经72h未死的鸡胚置冰箱内未死的鸡胚置冰箱内冻死后，收集尿囊液作第二代接种。如第二代接种的鸡胚仍冻死后，收集尿囊液作第二代接种。如第二代接种的鸡胚仍不死亡，即可不死亡，即可判定分离病毒为阴性判定分离病毒为阴性。2.病毒分离病毒分离70三、介绍高致病性禽流感的其他知识三、介绍高致病性禽流感的其他知识n鉴定鉴定高致病性禽流感的标准高致病性禽流感的标准:按照国际标准，按照国际标准，能引起接种鸡死亡能引起接种鸡死亡75以上的分离株，是高致以上的分离株，是高致病性毒株。病性毒株。尽管接种鸡是确定致病的尽管接种鸡是确定致病的“黄金标准黄金标准”，但它不能反，但它不能反应致死率小于应致死率小于75%的的H5或或H7亚型病毒的潜在致病力。因此亚型病毒的潜在致病力。因此0IE(国际兽疫局根据科学家的建议，推出新鉴定标准。国际兽疫局根据科学家的建议，推出新鉴定标准。71n1.任何任何分离到分离到A型流感病毒型流感病毒，用，用0.2mL1:10稀释的无菌稀释的无菌尿囊液静脉或肌肉注射尿囊液静脉或肌肉注射8只只48周龄易感鸡，周龄易感鸡，10天内的天内的死亡率不低于死亡率不低于75%。722.对所对所有低致病的有低致病的H5、H7毒株毒株，血凝素切割位点的氨基，血凝素切割位点的氨基酸序列与高致病性禽流感病毒一致。酸序列与高致病性禽流感病毒一致。3.H5、H7以外的以外的A型流感病毒，可以致死型流感病毒，可以致死15只鸡，在只鸡，在缺乏胰蛋白酶的情况下缺乏胰蛋白酶的情况下,能在细胞上生长形成蚀斑。能在细胞上生长形成蚀斑。73禽流感的传播途径是什么？禽流感的传播途径是什么？n禽流感的传播禽流感的传播：有病禽和健康禽直接接触；病毒污染物间接接：有病禽和健康禽直接接触；病毒污染物间接接触。触。n禽流感病毒存在于病禽和感染禽的禽流感病毒存在于病禽和感染禽的消化道、呼吸道和禽体消化道、呼吸道和禽体脏器脏器组织中。健康禽通过呼吸道和消化道感染，引起发病。组织中。健康禽通过呼吸道和消化道感染，引起发病。74如何防范禽流感如何防范禽流感 n禽流感被国际兽疫局定禽流感被国际兽疫局定为类传染病为类传染病，且变异后的病毒能威胁人，且变异后的病毒能威胁人类健康。类健康。n1.避免直接接触病禽及其排泄物、分泌物等能有效防止感染病毒。避免直接接触病禽及其排泄物、分泌物等能有效防止感染病毒。n2.饲养员、屠宰工人等经常与活禽密切接触的人，必须做好保护。饲养员、屠宰工人等经常与活禽密切接触的人，必须做好保护。n3.注重自身健康、保持良好的免疫力也是避免感染禽流感病毒的注重自身健康、保持良好的免疫力也是避免感染禽流感病毒的有效措施。有效措施。n4.不要去疫区旅游。不要去疫区旅游。n5.食用烹熟的家禽肉、蛋不会传染禽流感。食用烹熟的家禽肉、蛋不会传染禽流感。75 禽流感与其他流感有什么关系？禽流感与其他流感有什么关系？n除禽流感以外，常见的流感还有除禽流感以外，常见的流感还有人流感、马流感和猪人流感、马流感和猪流感流感等。禽流感与人流感和人类健康的关系非常密切。等。禽流感与人流感和人类健康的关系非常密切。由于猪与人的种间差异较小，禽流感病毒可以在中间由于猪与人的种间差异较小，禽流感病毒可以在中间宿主宿主(猪猪)体内与人流感病毒杂交，并产生能感染人的体内与人流感病毒杂交，并产生能感染人的新的流感病毒。新的流感病毒。76禽流感病毒为何消灭不了？禽流感病毒为何消灭不了？n流感病毒为了生存而不断发生变异，以逃脱动物产生的特流感病毒为了生存而不断发生变异，以逃脱动物产生的特异性抵抗力。人们为了预防禽流感也研制出了各种疫苗。异性抵抗力。人们为了预防禽流感也研制出了各种疫苗。n但但机体在产生特异性抗体后机体在产生特异性抗体后，病毒为逃脱机体的扑杀而不，病毒为逃脱机体的扑杀而不断地发生着变异断地发生着变异，这样原有的抗体即失去作用，病毒就可，这样原有的抗体即失去作用，病毒就可使动物重新发病。因此就目前的防疫技术和手段而言，禽使动物重新发病。因此就目前的防疫技术和手段而言，禽流感病毒是消灭不了的。流感病毒是消灭不了的。77n属于小属于小RNA病毒科，嗜肝病毒科，嗜肝RNA病毒病毒n601h不被灭活，只有一个血清型不被灭活，只有一个血清型n负染后电镜下可见病毒有实心和空心颗粒两种形态，负染后电镜下可见病毒有实心和空心颗粒两种形态，实心者实心者为为完整病毒，具有传染性；完整病毒，具有传染性；空心者空心者则无传染性，不产生甲肝抗体。则无传染性，不产生甲肝抗体。甲型肝炎病毒（三）甲型肝炎病毒（三）一、生物学特性一、生物学特性甲型肝炎甲型肝炎（hepatitis Ahepatitis A，HAHA，简称甲肝），简称甲肝）是一种由甲型肝炎病毒（是一种由甲型肝炎病毒（HAVHAV）引起的急性肠道传染病。）引起的急性肠道传染病。78 该病主要经该病主要经粪粪-口口途径传播，易发生食物型和水型爆发途径传播，易发生食物型和水型爆发行行,常呈季节性和周期性流行。常呈季节性和周期性流行。传染源传染源：水源、食物、海产品、食具：水源、食物、海产品、食具 经人口进入人体后，最终在经人口进入人体后，最终在肝细胞中增殖肝细胞中增殖 产生的抗体：产生的抗体：IgMIgM和和IgCIgC 二、致病性二、致病性 79n甲肝病毒较一般肠道病毒抵抗力强甲肝病毒较一般肠道病毒抵抗力强n对对酸、碱、乙醚、氯仿酸、碱、乙醚、氯仿等也有较强的耐受性。等也有较强的耐受性。HAV不不能耐受冷冻干燥，对紫外线敏感，对化学消毒剂的抵能耐受冷冻干燥，对紫外线敏感，对化学消毒剂的抵抗力与一般肠道病毒相似抗力与一般肠道病毒相似三、抵抗力三、抵抗力80四、检测方法四、检测方法1.ELISA1.ELISA方法方法（检测病人的检测病人的康康-HAVIgM)2.2.基因芯片法基因芯片法（从粪便或（从粪便或血液中采样）血液中采样）81 作业作业n课后习题P234人有了知识，就会具备各种分析能力，明辨是非的能力。所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋。”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，培养逻辑思维能力；通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培养文学情趣；通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。有许多书籍还能培养我们的道德情操，给我们巨大的精神力量，鼓舞我们前进。