DNA的重组.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第,35,章,DNA,的重组,一、引 言,1.,概念：,DNA,分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为,遗传重组,(,genetic recombination),或者,基因重排,(,gene rearrangement),。重组产物为,重组体,DNA,(recombinant DNA),。,2.,意义：,DNA,重组对生物进化起着关键的作用,它为,DNA,损伤或复制障碍提供修复机制,某些生物的基因表达受,DNA,重组的调节,3.,类型：,同源重组（,homologous recombination,）,位点专一性重组（,site-specific recombination,）,转座重组（,transposition recombination,）,二、同源重组,同源重组又称一般性重组。同源重组发生在,DNA,的同源序列之间，通过配对、链的断裂和再连接，而产生片断交换的过程。真核生物非姊妹染色单体的交换，细菌及某些低等真核生物的转化，细菌的转导、接合等都属于这一类型。,（一）,Holliday,模型,Robin Holliday,于1964年提出,四个关键步骤有：,两个同源染色体,DNA,排列整齐；,一个,DNA,的一条链裂断并与另一个,DNA,对应的,链连接，形成的连接分子(,joint molecule,)，,称,为,Holliday,中间体(,intermediate,);,通过分支移动(,branch migration,),产生异源双,链(,heteroduplex,)DNA,;,Holliday,中间体切开并修复，形成两个双链,重组体,DNA。,片段重组体,patch recombinant,拼接重组体,(,splice recombinant),Holliday,模型存在的问题：很难设想两个分子何以能在,同一位置,发生断裂。,Meselson,和,Radding,对此提出了修正意见，他们认为同源,DNA,分子中只有一个分子发生单链断裂。,现在认为，同源重组是减数分裂的原因，而不是减数分裂的结果。,DNA,分子双链断裂才能与同源分子发生链的交换,，藉以将同源染色体分配到,子代细胞中去。因此，,双链断裂启动重组，也启动了减数分裂。,(二)细菌的基因转移与重组,细菌可以通过多种途径进行细胞间基因转移，并通过基因重组以适应随时改变的环境。这种遗传信息的流动不仅发生在种内，也发生在种间，甚至与高等动植物细胞之间也存在横向遗传传递(,horizontal genetic transmission,)。,细菌的基因转移主要有四种机制：,接合(,conjugation),转化(,transformation),转导(,transduction),细胞融合(,cell fusion),1.,细菌的接合作用,细菌的细胞相互接触时遗传信息可以由一个细胞转移到另一个细胞，,称为接合作用,。,供体细胞被定义为,雄性,，受体细胞为,雌性,。,通过接合而转移,DNA,的能力是由接合质粒,(,conjugative plasmid),提供的，与接合功能有关的蛋白质均由接合质粒所编码。能够促使染色体基因转移的接合质粒称为,致育因子,(,fertility factor)，,简称为,性因子或,F,因子,。,F,质粒性质：,双链闭环的大质粒，总长约100,kb，,复制起点为,ori,V。,可以在细胞内游离存在，也可以整合到宿主染色体内，因此属于,附加体。,与转移有关的基因(,tra,),占据质粒的三分之一(33,kb)，,称为,转移区,，包括编码,F,性菌毛(,F,pilus,)、,稳定接合配对、转移的起始和调节等，总共约,40个,基因,。,细菌的结合作用,tra,S,和,tra,T,基因编码表面排斥蛋白，阻止,F,+,细胞之间的转移，,F,+,细胞的性菌毛与,F,-,细胞结合后收缩，使二者靠近，,Tra,D,蛋白构成转移的通道,，,Tra,I,在,Tra,Y,的帮助下结合到转移起点,ori,T,上，切开一条链，使其,5,端进入受体细胞，并合成其互补链，使,F,-,细胞转化为,F,+,细胞，给体细胞中的单链也可以合成互补链。,Tra,A,基因编码,的亚基蛋白聚合成中空管,（2-3/cell）,在细菌基因转移的不同时间将配对细胞分开，可以确定基因在染色体上的位置,。,F,质粒,DNA,可以通过重组整合到受体的染色体中，使受体菌成为,高频重组（,Hfr,),菌株,，若,F,质粒的,DNA,未能完整地进入受体菌，则受体菌不能转化为,F,+,F,质粒的,DNA,可以被切割出来，有时可携带宿主菌的染色体,DNA,，称作,F,因子，,F,因子携带的基因可在受体菌表达。,2,.,细菌的遗传转化,遗传转化(,genetic transformation),是指细菌品系由于吸收了外源,DNA(,转化因子)而发生遗传性状的改变现象。,具有摄取周围环境中游离,DNA,分子能力的细菌细胞称为,感受态细胞,(,competent cell)。,很多细菌在自然条件下就有吸收外源,DNA,的能力。,有些细菌在自然条件下不发生转化或转化效率很低，但在实验室中可以人工促使转化。例如大肠杆菌，用高浓度,Ca,2+,处理，可诱导细胞成为感受态，重组质粒得以高效转化。,转化过程涉及细菌染色体上,10多个基因编码,的功能。如：,感受态因子、与膜结合的,DNA,结合蛋白、自溶素、多种核酸酶,等。感受态因子诱导与感受态有关的蛋白质表达，自溶素使与膜结合的,DNA,结合蛋白和使核酸酶裸露出来，当游离,DNA,与膜结合的,DNA,结合蛋白结合后，核酸酶使其中一条链降解，另一条链被吸收，与染色体,DNA,重组。,3,.,细菌的转导,转导(,transduction),是通过噬菌体将细菌基因从供体转移到受体细胞的过程。,转导有两种类型,普遍性转导(,generalized transduction):,是指宿主基因组任意位置的,DNA,成为成熟噬菌体颗粒,DNA,的一部分而被带入受体菌。,局限性转导(,specialized transduction),：某些温和噬菌体在装配病毒颗粒时将宿主,染色体整合部位的,DNA,切割下来取代病毒,DNA。,4,.,细菌的细胞融合,在有些细菌的种属中可发生由细胞质膜融合导致的基因转移和重组。在实验室中，用溶菌酶除去细菌细胞壁的肽聚糖，使之成为原生质体，可人工促进原生质体的融合，由此使两菌株,的,DNA,发生广泛的重组。,(三)重组有关的酶,大肠杆菌重组有关的酶,:,RecA,：,诱发,SOS,反应，促进,DNA,单链的同化,RecF,、,O,、,R,：,调节,RecA,纤丝的装配与拆卸,RecB,、,C,、,D,：,产生参与重组的,DNA,单链,RuvA,、,B,、,C,：,产生促进异源双链的形成和切开,Holliday,联结体,其中,RecA,蛋白参与重组是最关键步骤。,DNA,单链的同化(,assimilation,）,是指单链与同源双链分子发生链的交换，从而使重组过程中,DNA,配对、,Holliday,中间体的形成，分支移动等步骤得以产生。,RecA,蛋白的丝状聚合体与,DNA,的相互作用,RecA,蛋白的带状图，,MW,：,38kD,RecA,蛋白的丝状聚合体，每一圈螺旋由6个,RecA,蛋白单体构成，其中一个单体由红色标出。,RecBCD,酶是产生参与重组的,DNA,单链主要途径。,RecBCD,酶具有,三种酶活性,：,依赖于,ATP,的核酸,外切酶,活性,可被,ATP,增强的核酸,内切酶,活性,ATP,依赖的,解螺旋酶,活性。,当,DNA,断裂时，它结合在其游离端，使其解旋并降解，直至酶移动到,chi,位点：,GCTGGTGG,，在其,3,侧,4-6,核苷酸处将链切断，产生,3,游离单链，随后单链与,RecA,结合，开始,同源区重组。,在大肠杆菌中由,RuvA,RuvB,和,RuvC,蛋白参与的同源重组,。,（左）,RuvA,四聚体蛋白能够识别,Holliday,联结体(,junction),的交叉点结合到,Holliday,位点；,（中）,RuvB,六聚体结合到杂合双螺旋的两对面，,DNA,穿过其中心，,RuvB,是一种解螺,旋酶，通过水解,ATP,而推动分支移动。,（右）,RuvC,是一种核酸内切酶，结合到,Holliday,位点，切断核酸链，它识别不对称,的,四核苷酸,ATTG,，,此序列因而成为切开,Holliday,联结体的热点，并决定结果,是片段重组还是拼接重组，即异源双链区两侧来自同一分子还是不同分子。,二、特异位点重组,特异位点重组,广泛存在于各类细胞中,。起着十分特殊的作用。,包括：,某些基因表达的调节,发育过程中程序性,DNA,重排,病毒和质粒,DNA,复制循环过程中发生的整合,与切除等。,此过程往往发生在一个特定的短的(20200,bp,)DNA,序列内,(重组位点),，并且有特异的酶,(重组酶),和辅助因子对其识别和,作用。,特异位点重组的结果依赖于重组位点的位置和方向,.,重组位点以白箭头表示。,A,：重组位点反方向位于同一,DNA,分子，重组结果发生,倒位,。,B,：重组位点同方向位于同一,DNA,分子，重组发生,切除,，位于不同分子，重组发生,整合,1.,噬菌体的整合与切除,噬菌体侵入大肠杆菌细胞后，面临着,裂解生长,还是,溶源生长,两种生活型的选择，其,DNA,在不同生活型之间的转换。包括,两种状态,：,进入溶源状态需要,DNA,整合,（,integrate）,进宿主,DNA，,噬菌体,DNA,是细菌染色体的整合部分,由溶源状态进入裂解状态需要,DNA,从宿主,DNA,上切除,（,excise）,下来，,DNA,在宿主细菌中以环状分子独立存在。,两种周期取决于,CI,和,Cro,两种蛋白质的拮抗结果,噬菌体的位点专一性重组,2.,细菌的特异位点重组,IgG,的分子结构,3.,免疫球蛋白的基因重排,Kappa,链基因族（小鼠,6,号染色体。人,2,号染色体）,Lambda,链基因族（小鼠,16,号染色体。人,22,号染色体）,小鼠重链基因族（,12,号染色体）,人重链基因族（,14,号染色体）,小鼠：,V,k,250 J,k,4,人：,V,k,76 J,k,5,小鼠：,V,l,2 J,l,C,l,3,人：,V,l,300 J,l,C,l,6,250,1000,300,种系免疫球蛋白基因族片断的排列,免疫球蛋白基因族片断的重排有严格的顺序性,第一次重排在前,B,细胞中，首先是重链重排，称,V-D-J,连接。,D-J V-D-J （,随机的）,接下来是轻链重排，形成,V-J,复合体（先,k,),重链和轻链重排均发生在特异位点：,V,的下游,J,的上游,D,的两侧,重组信号,SSR：,7和9,nt,的信号序列,中间间隔12或23,bp,富含,A,回文结构,免疫球蛋白基因重组的模型,1.,重组酶（,RAG1/RAG2),复合体与重组信号序列结合,2.,复合体使编码序列与重组信号序列之间的双连断裂，编码序列先成3,OH,和5,PO,4,，末端再形成发夹结构。,3,重组信号序列结合形成环状结构。,编码序列连接前经过加工(增加或减少,nt,)，,连接位点不十分确定，增加了免疫球蛋白的多样性。,DNA,依赖性蛋白激酶,(DNA-PK),和,DNA,连接酶参与了加工和连接过程。,9,碱基序列,7,碱基序列,三、转 座 重 组,转座因子,(,transposable element,),：是一种可以由染色体的一个位置转移到另外位置的遗传因子，也就是一段可以发生,转座,(,transposition),的,DNA，,又称为,转座子,(,transposon,)。,转座的结果：,宿主序列,删除、倒位或易位,位于不同位点的两个拷贝转座子之间可以发生交互重组，从而造成基因组不同形式的,重排,。,因此转座子被称为是自私的,DNA(selfish DNA)。,(一)细菌的转座因子,细菌的转座因子有两类：,一类为,插入序列(,IS)，,是简单的转座子，除转座所需基因外不携带任何标记基因，它的存在只能借助插入位点有关基因的失活来判断，或者通过分子杂交和测序来检测。,另一类是,复杂转座子(,Tn,),，,除转座酶,(,transposase,),基因外还携带各种标记基因，因而易于检测其存在。,1,插入序列,插入序列是最小的转座因子。所有插入序列的两端都有反向重复(,inverted repeats)，,为转座酶识别所需，通常重复序列长度为,1525,bp,。,重复序列有时只是,类似,，并非,完全相同,。,2,转座子,按其结构分为两类：,组合因子,(,composite element,):,由个别模件组合而成，通常包括两个插入序列作为两臂，中间为标记基因。,复合因子,(,complex element,):,含有转座酶基因、解离酶,(,resolvase,),基因以及标记基因，两端为反向重复，无插入序列。,组合转座子的结构,IR,IR,中心区,IR,IR,IR,IR,IR,中心区,IR,IR,IR,两臂正向,两臂反向,Tn3,复合转座子的结构,tnpA,:,转座酶,tnpR,：,解离酶促进转座中间产物拆开，调节,tnp、AtnpR,基因的表达,Res:,解离调控点，,tnpR,结合其上,ampR,:,氨苄霉素抗性基因,3 转座过程与效应,过程：,转座酶能够识别转座子的末端反向重复序列并且在其3,端切开，同时在靶部位交错切开单链，它的5,突出末端与转座子的3,末端连接，,形成,Shapiro,中间体,。,按转座过程,是否发生复制,，可分为：,非复制转座(,nonreplicative,transposition),复制转座(,replicative,transposition),非复制转座与复制,转座的基本过程,所有转座因子都有在基因组中,增加其拷贝数,的能力。此过程可以借助两种方式来完成：一是通过,转座过程的复制,(复制转座)；另一是从,染色体已完成复制的部位转到尚未复制的部位,，然后随着,染色体而复制,。非复制转座的转座因子只能借后一种方式来扩增。共整合体含有两个拷贝的转座子，故可通过同源重组将连接的两部分分开。但是借助,Rec,A,蛋白拆分效率较低。,转座子编码的解离酶可在解离区(,res),进行重组,，可极大提高解离效率,。解离酶是一种重组酶，它所催化,DNA,链的断开和再连接并不需要供给能量。当它在,res,位,点,断开两条链时，解离酶以共价键连在键的5末端。,转座因子首先因其,可导致突变,而被认识。它插入基因后，使基因突变失活，这是转座作用,最直接,的效应。,效应：,引起宿主染色体,DNA,重组,造成染色体断裂,重复,缺失,倒位,易位,通过干扰宿主基因与其,调控元件,之间 的关系或转,座因子本身的作用而影响邻近基因的表达。,(二)真核生物的转座因子,最早发现能转移的遗传因子是玉米转座子，它对染色体基因有不稳定的诱变效应，因而影响某些遗传性状，故称为控制因子。其后发现真核生物广泛存在各种转座因子。,真核生物,/,原核生物转座因子相似点：,转座依赖于转座酶,转座因子的两端反向重复序列,靶位点交错切开，插入转座因子后经修复形,成两侧正向重复序列。,差别点：,真核生物细胞内只要存在,转座酶,，任何序列片段具有该酶识别的反向重复末端均可发生转移，而无需由被转移序列自身编码这些酶。,原核生物的转座酶主要作用于产生它的,转座因,子,，表现出,顺式显性,(,cis,dominance,)，,真核生物则无此特性，这也是二者,最明显,的差别。,1,玉米的控制因子系统,激活,-,解离系统（,activator-dissociation system,Ac-Ds),Ac,编码转座酶,(,自主因子,),，,Ds,（非自主因子）是,Ac,不同程度的缺失中间序列形成的，无转座酶活性，可通过反式作用产生转座。,抑制,-,促进,-,增变系统（,suppressor-,promotor-mutator,Smp,),Smp,和,En,（,enhancer,）（增强子）序列相似，均为自主因子，与其对应的非自主因子,dSmp,为有缺陷的,Smp,因子，转座后，若,En,插入靶基因附近的合适部位，可以促进靶位点基因的表达，若插入外显子，可抑制基因的表达。,斑点系统（,dotted,，,Dt,）,P,品系的果蝇含有,40-50,个,P,因子,（一种转座子），,P,因子的,mRNA,前体含有,3,个内含子，若,P,品系雄性与,M,品系雌性交配，子一代的体细胞,mRNA,前体加工时保留了第,3,个内含子，合成阻遏蛋白，不发生转座。性细胞,mRNA,前体加工时切除了全部,3,个内含子，活跃的转座使性细胞失去功能。,P,雄性或,M,雄性与,P,雌性交配时，由于雌性的卵细胞质中存在抑制,P,因子转座酶活性的蛋白质，子代的生殖功能正常。,