实时荧光定量PCR.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实时荧光定量,PCR,技术的原理及应用,(Real time Quantitative PCR),肖晓秋,重庆医科大学生命科学研究院,讲 座 提 纲,实时荧光定量,PCR,原理,实时荧光定量,PCR,的几种方法介绍,实时荧光定量,PCR,原理,实时荧光定量,PCR,的几种方法介绍,实时荧光定量技术的应用,实时荧光定量,PCR,定义,在,PCR,反应体系中加入,荧光基团,，利用荧光信号累积,实时监测,整个,PCR,进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,实时荧光定量,PCR,原理：实时原理,常规,PCR,技术：,对,PCR,扩增反应的,终点产物,进行定量和定性分析，,无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测,实时定量,PCR,技术：,利用,荧光信号的变化实时检测,PCR,扩增反应中,每一个循环扩增产物量的变化,，通过,Ct,值,和标准曲线的分析对,起始模板,进行,定量分析,实时荧光定量,PCR,原理：实时原理,实时荧光定量,PCR,原理：定量原理,介绍三个概念：,扩增曲线、荧光阈值、,Ct,值,如何对起始模板定量？,通过,Ct,值和标准曲线对,起始模板,进行定量分析,实时荧光定量,PCR,原理,-,扩增曲线,扩增曲线图：,横坐标：,扩增循环数（,Cycle,）；,纵坐标：,荧光强度,每个循环进行一次荧光信号的收集,荧光基团,荧光检测元件,实时荧光定量,PCR,原理,-,荧光,阈,值,荧光信号,阈,值（,threshold,）,：,前,15,个循环信号作为荧光本底信号（,baseline,），,即,样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值,荧光域值的缺省设置是,3,15,个循环的荧光信号的标准偏差的,10,倍,手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入,指数,期的最初阶段，并且保证回归系数大于,0.99,真正的信号,:,荧光信号超过域值,实时荧光定量,PCR,原理,-,Ct,值,Ct,值的,定义,：,PCR,扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增,循环次数,C(t)value,实时荧光定量,PCR,原理,-,Ct,值的,重现性,横轴：,PCR,反映循环数,纵轴：荧光信号量,Ct,值的特点,：,相同模板进行,96,次扩增，终点处产物量不恒定；,Ct,值则极具重现性,实时荧光定量,PCR,原理,-,定量原理,实时荧光定量,PCR,原理,-,定量原理,实时荧光定量,PCR,原理,-,标准曲线,模板,DNA,量越多，荧光达到域值的循环数越少，即,Ct,值越小,Log,浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品,Ct,值，就可以计算出样品中所含的模板量,确定未知样品的,C(t),值,通过标准曲线由未知样品的,C(t),值推算出其初始量,Sample,实时荧光定量,PCR,原理 绝对定量,25,讲 座 提 纲,实时荧光定量,PCR,原理,实时荧光定量,PCR,的几种方法介绍,实时荧光定量,PCR,实验设计及应用,实时荧光定量,PCR,原理,实时荧光定量,PCR,的几种方法介绍,实时荧光定量,PCR,实验设计及应用,非,特异性荧光标记：,1,、,SYBR Green,特异性荧光标记：,2,、,TaqMan,3,、,Molecular Beacon,实时荧光定量,PCR,原理,-DNA,产物的荧光标记,实时荧光定量,PCR,方法,1-,SYBR Green,法,SYBR Green,SYBR Green,法 工作机理,SYBR Green,能,结合到双链,DNA,的小沟部位,SYBR Green,只有和双链,DNA,结合后才发荧光,变性时，,DNA,双链分开，无荧光,复性和延伸时，形成双链,DNA,，,SYBR Green,发荧光，在此阶段采集荧光信号。,SYBR Green,实时荧光定量,PCR,原理,SYBR Green I,工作原理,5,3,5,3,SG,No Emission,SG,SG,SG,Excitation,SG,SG,SG,SG,SG,SG,SG,5,3,5,3,Emission,Excitation,实时荧光定量,PCR,原理,SYBR Green I,熔解曲线分析,温度,荧光强度,Tm,Tm,值：,DNA,解链一半时的温度,实时荧光定量,PCR,原理,SYBR Green I,融解曲线分析,将温度与荧光强度的变化求导。,(-,dI/dT,),-,dI,dT,T,m,SYBR Green,法 融解曲线分析,融解曲线分析，单一峰,无非特异性荧光,定量准确,融解曲线分析，出现杂峰,其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确,非,特异性产物,Cycle number,Flourescenc,Ck 10,2,Ck 10,4,Sample,Cycle number,Log of DNA concentration,SYBR Green,法 定量原理,模板,DNA,量越多，荧光达到域值的循环数越少,Log,浓度与循环数呈线性关系，根据样品,Ct,值，就可以计算出样品中所含的模板量,SYBR Green,法,-PCR,反应的建立,反应体系的建立及优化,:,SYBR Green,使用浓度,:,太高抑制,Taq,酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测,Primer,：,引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准,MgCl,2,的浓度,:,可以降低到,1.5mM,以减少非特异性产物,反应,Buffer,体系的优化,反应温度和时间参数,:,由酶和引物决定,其他与常规,PCR,相同,SYBR Green,法 应用范围,起始模板的测定,基因型的分析,融解曲线分析：可以优化,PCR,反应的条件，对常规,PCR,有指导意义，如对,primer,的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。,SYBR Green,法 优缺点,对,DNA,模板没有选择性,-,适用于任何,DNA,使用方便,-,不必设计复杂探针,非常灵敏,便宜,优 点,容易与非特异性双链,DNA,结合，产生假阳性,但可以通过,融解曲线的分析,，优化反应条件,对引物特异性要求较高,缺 点,与,目标序列互补,实时荧光定量,PCR,方法,2-,TaqMan,法,TaqMan,-,水解型杂交探针,5,端标记有报告基团,(Reporter,R),，如,FAM,、,VIC,等,3,端标记有荧光淬灭基团,(Quencher,Q),探针完整，,R,所发射的荧光能量被,Q,基团吸收，无荧光，,R,与,Q,分开，发荧光,Taq,酶有,53,外切核酸酶活性，可水解探针,TaqMan,法 工作原理,每,扩增一条,DNA,分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光,TaqMan,法,PCR,反应的建立,1,、引物、探针的设计：,探针,Tm,为,68-70,，,30,bp,5,不能有,G,，,G,可能会淬灭荧光素，,引物尽量靠近探针，扩增片段,400,bp,，,引物,Tm,为,59-60,2,、反应参数的确定：,一般为：,94,，,10-20S,60,，,30-60S,（,Taq,酶,53,外切核酸酶活性在,60,最高）,也可通过温度梯度优化退火温度,72,，,45 S,，,3,、,优化引物和探针浓度：获得最小,Ct,值，信号,/,背景比值的最大值,引物浓度：,50-900nM,探针浓度：,50-250nM,4,、,其他与常规,PCR,相同,TaqMan,法 优缺点,对目标序列的高特异性,-,阴性结果确定,设计相对简单,-,与目标序列某一区域互补,重复性比较好,优 点,只适合一个特定的目标,委托公司标记，价格较高,不易找到本底低的探针,缺 点,讲 座 提 纲,实时荧光定量,PCR,原理,实时荧光定量,PCR,的几种方法介绍,实时荧光定量,PCR,实验设计及应用,实时荧光定量,PCR,原理,实时荧光定量,PCR,的几种方法介绍,实时荧光定量,PCR,实验设计及应用,绝对定量,(Absolute Quantification,，,AQ),病原体检测,转基因食品检测,基因表达研究,相对定量,(Relative Quantification,，,RQ),基因在不同组织中的表达差异,药物疗效考核,耐药性研究,实时荧光定量,PCR,法：绝对定量与相对定量,绝对定量与相对定量的定义,绝对定量通过标准品定量,绝对定量的标准样品：,已知拷贝数的质粒,DNA,，做系列稀释。,标准样品的种类：,含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒,含有和待测样品相同扩增片段的,cDNA,PCR,的产物,绝对定量：从荧光到拷贝数,实时荧光定量,PCR,法,:,相对定量通过内标定量,内标（,Endogenous Control,）通常是,-actin,、,GAPDH,基因等看家基因,在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小,内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量,实时荧光定量,PCR,法,:,相对定量,-,参照因子,Calibrator,实时荧光定量,PCR,法,-,相对定量分析方法,1:,-Ct,前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近,100,且偏 差在,5,以内,:,1,、用内参基因的,Ct,值归一目标基因的,Ct,值：,Ct,（,test)=Ct,（,target,test,)-Ct,（,ref,test,),Ct,（,calibrator)=Ct,（,target,calibrator)-Ct,（,ref,calibrator),2,、用校准样本的,Ct,值归一试验样本的,Ct,值：,Ct,=,Ct,（,test)-,Ct,（,calibrator),3,、计算表达水平比率：,2,Ct,=,表达量的比值,实时荧光定量,PCR,法,-,相对定量分析方法,2,：,双标准曲线法,目标基因与内参基因扩增效率不同：,待测样品目的基因浓度,待测样品内参基因浓度,F=,对照样品目的基因浓度,对照样品内参基因浓度,实时荧光定量,PCR,法：实验要素,1-,样品,DNA,纯度：,OD260/OD280=1.8,，,1.6 2.0,之间,DNA,用量：,0.05,ng,100,ng,RNA,纯度：,OD260/OD280=2.0,cDNA,用量：,1-100,ng,总,RNA,反转录的,cDNA,取,1,uL,实时荧光定量,PCR,法：实验要素,2-,标准品,实时荧光定量,PCR,法：实验要素,2-,标准品,标准品梯度稀释方法,复管测试,样品和标准品都要重复,重复次数须遵循统计学要求,实时荧光定量,PCR,法：实验要素,3-,重复,实时荧光定量,PCR,法,TaqMan,法举例,TaqMan,法研究,ERBB2,在乳腺肿瘤,组织标本中的表达差异,TaqMan,法举例 标记探针,使用,TaqMan,探针进行双通道荧光定量,Fam,标记目标基因探针,VIC,标记看家基因探针,TaqMan,法举例 材料准备,从正常乳腺组织中提取的,总,RNA,从乳腺癌组织中提取的,总,RNA,含,ERBB2 and GAPDH,的质粒用于生成标准曲线,单双通道同时进行，独立分析,Controls,no RNA,：,阴性对照,RNA+no reverse transcriptase,：,基因组对照,TaqMan,法举例 癌症标记物表达,Color 2,-VIC detection for,GAPDH,Color 1,FAM detection for,ERBB2,TaqMan,法举例 实验结果,定量,Copies,ng,/l Total RNA,Healthy,RNA,Tumor,RNA,Tumor/Healthy,ERBB2,1095,1052,2130,2492,2.16,X,GAPDH,95500,85730,136000,130800,1.45,X,TaqMan,法举例 实验结果,定量分析,ERBB2,copies/,GAPDH,copies,1095/95500=0.011,1052/85730=0.012,2130/136000=0.017,2492/130800=0.019,Healthy RNA,Tumor RNA,0.0115,0.018,0.018/0.011,Graph,Copies,ng,/l Total RNA,TaqMan,法举例 实验结果,表达差异,Healthy,Tissue,Carc,.,Tissue,Relative,Expression,ERBB2,的,表达差异,TaqMan,法举例 实验结果,讨论,通过,RT-,qPCR,成功检测了,ERBB2,基因在不同组织的 表达差异；在乳腺癌组织中，,ERBB2,的表达量是正常水平的,1.8,倍,实时荧光定量PCR技术的原理及应用,Thank You!,期待你们的成功！,