感受态的制备质粒的转化和筛选.ppt

,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,实验安排,感受态的制备,质粒的转化,第二天，观察结果,质粒酶切,-,电泳检测,上次实验产物（质粒）,酶切电泳点样安排,电泳上样：,1,、所有同学各自的酶切产物（,10-20 l,）,2,、每排点样孔需有两种质粒：,pUC119,、,pUC119-U6,3,、同一人的“酶切前”与“酶切后”相邻点样,实验步骤,加,1.5ml,培养物于,EP,管，,4000rpm10min,加入,冰冷,CaCl,2,溶液,300,l,，重悬菌体,沉淀中加入,冰冷,CaCl,2,溶液,120,l,，重悬菌体,感受态制备,冰浴,15-30min,，,4000rpm10min,收集沉淀，去上清,收集沉淀，去上清,（去掉培养基）,实验步骤,每管感受态中加质粒,5,l,，混匀,42,，热激,90,秒,，勿摇动,每管加,LB 500,l,，,37,摇床，复苏,30-40min,铺,200,l,菌液到,LB,琼脂平板，涂匀,转化,冰上静置,20-30min,如何设计实验的参照体系（对照组）？,筛选,实验步骤,LB,培养基（,X-gal,IPTG,Amp,）,LB,培养基,感受态,+,质粒（,pUC119-U6 or pUC119,）,感受态（无质粒）,pUC119-U6,pUC119,对照组,B,？,？,？,对照组,A,？,基因克隆,应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的,DNA,）与载体,DNA,接合成一具有自我复制能力的,DNA,分子,复制子,(replicon),，继而,通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，,再进行扩增提取获得大量同一,DNA,分子，也称,DNA,克隆或重组,DNA(recombinant DNA),。,基因克隆示意图,基因克隆,操作过程：,分,分离目的基因,切,限制酶切目的基因与载体,接,拼接重组体,转,转入受体菌,筛,筛选重组体,受体菌条件,安全宿主菌,限制酶和重组酶缺陷,处于感受态,(competent),导入方式,转化,(transformation),转染,(transfection),感染,(infection),重组,DNA,导入受体菌,LB 0.18M,0.1M CaCl,2,0.1M CaCl,2,H,2,O,细胞膨胀：低渗环境,胞膜收缩：低温环境,离子扩散：,DNA-Ca,2,热休克：,42,1L LB,培养基,:,10g,胰蛋白胨,5g,酵母提取物,10g NaCl,重组体的筛选,重组,DNA,导入受体菌后，经过培养使其大量繁殖，再设法将含有目的基因的菌落区分鉴定出来，这一过程即为筛选（,screening,）或选择（,selection,）。,重组体的筛选,1.,直接选择法,(1),抗药性标记选择,(2),标志补救,(marker rescue),互补（蓝白斑筛选）,(3),分子杂交法,原位杂交,Southern,印迹,2.,免疫学方法,如免疫化学方法及酶免检测分析等,互补的检测,蓝白斑筛选,感受态细胞转化效率的检验,1g,的完整质粒转化到感受态细胞中，得到的转化细菌的数量,。,例如，取,1l,（,0.1 ng/l,）完整的质粒转化,100l,的感受态细胞,.,向转化反应液中加入,900l,培养液，让细菌恢复一小段时间，取,100l,铺板,.,培养过夜，产生,1000,个菌落。转化,0.1 ng DNA,，用,SOC,稀释到,1000l,后，取,1/10,涂平板，则涂平板共用,0.01 ng DNA,质粒。,转化率,1000,克隆,/0.01 ng DNA=10,5,cfu/ng=10,8,cfu/g,转化效率,110,6,cfu/g DNA,可满足普通的亚克隆实验；,110,7,cfu/g DNA,用于作更复杂的亚克隆，有限量的,DNA,的转化，,T-,克隆实验；构建文库和突变要求用的转化的效率为,110,8,cfu/g DNA,