医学G试验GM试验课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,G试验GM试验,真菌,(fungus),是一类具有典型细胞核，有核膜和核仁，胞浆内有完整的细胞器，无根、茎、叶，不含叶绿素，无光合色素，细胞壁含几丁质和,-,葡聚糖,的单细胞或多细胞,异养,真核细胞型微生物。,概 念,对人类致病真菌,皮肤或软组织感染真菌（浅部真菌）,侵袭性感染真菌,皮肤,毛发,指（趾）甲,寄生或腐生与表皮、毛发和甲板的角质组织中,表面感染真菌,皮肤癣真菌,皮下组织感染真菌,毛癣菌属,表皮癣属,小孢子菌属,念珠菌属,隐球菌属,曲霉属,毛霉属,双相型真菌,侵袭深部组织内脏，引起全身感染的病原菌或条件致病菌,根霉属,形态特性,一、侵袭性真菌病诊断治疗现状,二、,G,实验原理以及临床应用,三、侵袭性曲霉菌病感染现状,四、侵袭性曲霉菌病的临床诊断治疗现状,五、,GM,试验,原理以及临床应用,六、,G,试验,GM,试验联合检测优势,目 录,LOGO,一、侵袭性真菌病诊断治疗现状,侵袭性真菌病,（,invasive fungal disease,，,IFD,）,即以往所说的深部真菌病,，,是指致病性真菌侵犯皮下组织、黏膜、肌肉和内脏器官等所引起的真菌感染性疾病。,据,WHO,统计，能引起人类疾病的真菌约有,270,余种，尤其是深部真菌，可侵袭心、肺、血液、胃肠等人体各个器官和系统。真菌感染已成为临床感染学中不可忽略的一部分。,侵袭性真菌病,真菌感染率在逐年增加,19792000,年血流感染发生率统计分析：数据来源,-,美国医院流量统计,n=750,000,000,住院患者,Martin GS et al.,N Engl J Med.2003Apr 17;348(16):1546-54.,患者数,年 份,革兰阴性菌,革兰阳性菌,真菌,少见真菌尸检检出率也有所上升,足放线菌,镰刀菌,0.2,0.9,0.4,0.7,0.7,1.4,尸检检出率,(%),1989-1993,年,1994-1998,年,1999-2003,年,Chamilos G,et al.Haematological.2006;91:986-989,一项对三级肿瘤监护中心血液肿瘤患者的尸检结果显示,院内真菌感染的病原体以念珠菌居多，各临床科室发病率有所不同,Pfaller MA et al.Crit Rev Microbiol.2010;36(1):1-53.,普通病房,血液恶性肿瘤,骨髓移植,HIV,新生儿监护病房,实体器官移植,实体肿瘤,外科,(,非移植,),合计,(n=3,640),(n=1,010),(n=377),(n=263),(n=54),(n=886),(n=863),(n=1,906),(n=6031),念珠菌属,81.7,42.6,31.6,32.7,96.3,57.2,89.2,91.2,75,隐球菌属,4.0,2.1,0.0,48.7,0.0,6.4,1.6,1.0,4.5,其它酵母菌,*,1.2,3.3,2.7,3.4,0.0,1.0,1.2,0.8,1.4,曲霉菌属,8.3,33.8,50.7,4.9,1.9,26.0,4.9,3.4,12.3,接合菌,1.1,5.2,6.4,1.1,1.9,1.7,0.0,0.6,1.4,其它霉菌,*,1.6,7.6,6.4,1.5,0.0,4.7,1.3,1.5,2.7,地方性真菌,1.9,1.2,0.5,1.6,0.0,2.6,0.8,0.7,1.6,2004-2008,年间美国,IFD,病原体在各临床科室的分布,(%),*其它酵母包括,6,例马拉色菌属，,26,例肺孢子菌，,12,例红酵母，,21,例啤酒酵母和,6,例毛孢子菌,*,其它霉菌包括,2,例支顶孢菌,9,例交链孢霉,3,例双极孢菌，,53,例镰刀霉，,10,例拟青霉菌,13,例赛多孢子菌，,6,例足分枝霉菌和,1,例白色簇孢霉,不同科室的,IFD,情况不尽相同,真菌感染流行病学变迁,中国,2010,念珠菌病诊断与治疗：专家共识,全球,ARTEMIS,研究,:,白念珠菌在念珠菌属中所占比率自,70.9,降至,62.965.0,，而非白念珠菌略有上升,中国,5,所医院,ARTEMIS,研究,:,白念珠菌占念珠菌属分离菌的,61.5%,在,ICU,念珠菌血症患者中，白念珠菌仅占,40%,，近平滑念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌各占,23%,、,15%,和,9%,另一来自免疫缺陷者念珠菌血流感染的报道中非白念珠菌占,54%,仍以白念珠菌为主,非白念珠菌、曲霉等,其它真菌的检出率逐年增加,新型致病真菌或是耐药菌的出现,念珠菌属,-,美国院内血流感染第,1,位致死菌群,对美国,49,所医院从,1995,年至,2002,年的,24179,例院内血流感染病原体进行流行病学分析,SCOPE,：,The Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiologic Importance,凝固酶阴性,葡萄球菌,金黄色,葡萄球菌,肠球菌,念珠菌属,死亡率,(%),Wisplinghoff H et al.,Clin Infect Dis.2004 Aug 1;39(3):309-17.,侵袭性真菌病（,IFD,）宿主因素,免疫抑制性治疗,免疫抑制剂、糖皮质激素、恶性肿瘤、器官移植，放疗化疗,长时间使用抗生素,已证实,80-90%,的真菌血症主要,因素是大量使用抗生素,长期入住,ICU,免疫功能低下的患者,糖尿病、新生儿、肾功能衰退、,血液透析、营养不良,创伤、烧伤、腹腔手术,体内留置试管,真菌寄殖,免疫抑制性疾病,中性粒细胞减少，艾滋病,不同部位真菌感染流行病学存在差别,呼吸系统,其它部位,骨关节、心血管系统等,以念珠菌最为常见,腹腔感染,以念珠菌最为常见,真菌血流感染,泌尿系统,中枢神经系统,以隐球菌多见,念珠菌，曲霉菌少见,常见病原体为,念珠菌和曲霉菌,以念珠菌最为常见,以念珠菌尿最为多见,侵袭性,真菌感染,重点科室：血液科，呼吸科，,ICU,科，肿瘤科，移植科室等,深部真菌感染防治策略,预防,用药,经验性,治疗,抢先,治疗,目标,治疗,感染病程,高危患者,拟诊,临床诊断,确诊,早期诊断和治疗可显著降低患者死亡率,采集血培养后,3,天,*,P=0.0009,延迟,1,天治疗,*,延迟,2,天治疗*,延迟,3,天治疗*,41.4%,死亡率,(%),Kevin W.et al.Clin Infect Dis.2006;43:2531.,延迟,4,天治疗*,传统诊断方法,问题,培养,血培养作用有限，某些播散性感染常常为假阳性,全身使用抗真菌治疗或其它原因易导致假阴性,非无菌部位标本阳性结果，难以判定是真菌定植或感染。,细胞学检查、组织病理学检查,需侵入性手段获取标本,全身使用抗真菌治疗或其它原因易导致假阴性,CT,检查,其它某些真菌或细菌感染也有可能出现相似征象,在免疫正常宿主相关研究较少,PCR,检测,目前方法尚未标准化，尚在研究阶段,非培养技术对侵袭性真菌的的早期诊断和,临床用药具有重要意义！,LOGO,二、,G,实验原理以及临床应用,b,1,3,葡聚糖,磷脂双分子层,几丁质,麦角固醇,b,1,3,葡聚糖,合成酶,甘露糖蛋白,B,1,6,G,试验是指检测人体血液中真菌细胞壁成分,1,3-,-D-,葡聚糖,(Glucan,BG),的试验，故称,G,试验。,1,3-,-D-,葡聚糖占真菌细胞壁成分,50%,，广泛存在于各种真菌。人体吞噬细胞吞噬真菌后能持续释放该物质，使血液中含量加高。因此可以作为侵袭性真菌的早期检测的重要指标。,G,试验介绍,检测样本：血清,试验方法：动态显色法,装量：,96,人份,数据计算方式：速率法,定量检测：通过标准曲线方程精确计算含量,检测范围：,37.5-600pg/mL,检测时间：,60min,(1,-,3)-D,葡聚糖检测（,G,试验）产品,试验检测（1-3）,-D-,葡聚糖基于鲎试验的基本原理，即（1-3）-D-葡聚糖激活鲎变形细胞中的G因子亚基，产生丝氨酸蛋白酶，后者可将试剂中带有寡核苷酸的发色底物（Boc-Leu-Gly-PNA）中的发色基团对硝基苯胺（PNA）游离出来，并产生颜色，在405nm进行比色，待测样本溶液吸光度与溶液中（1-3）-D-葡聚糖浓度成正比。,实验原理,G,试验被列入真菌诊断和治疗的指南,欧洲癌症治疗研究组织,(EORTC),美国国家过敏症与传染病研究所霉菌病研究组,(MSG),批准用于真菌诊断,(J Antimicrobial Chemotherapy 2008,61:S1,i3),。,中国血液病,/,恶性肿瘤患者侵袭性真菌感染的诊断标准与治疗原则,(,第,3,次修改版本,),血清,G,试验连续,2,次阳性是侵袭性真菌感染临床诊断的指标,G,试验,检测的特点,1.高 蕾,，,周 新,.(1,3)-D,葡聚糖检测在侵袭性真菌感染中的诊断意义,J.,中国感染与化疗杂志,2008,3,(2),123-125.,2.J.Clin.Microbiol.2008.4(6):10091013.,可检测,除隐球菌和接合菌,外的多种真菌感染,在浅部真菌感染中，,1,3-D-,葡聚糖未被释放出来，,故其在体液中的量不增高。因此可,区分定植和感染,。,G,试验检测一般先于临床症状,3-10,天，是,早期检测,的重要手段,1,。,对于念珠菌血症,G,试验检测是,首选,检,查,方法,2,。,检测快速,，可在,1,小时得出检测结果。,应用纤维素膜进行血液透析患者,标本接触纱布或其他含有葡聚糖的材料,操作者处理标本存在污染,静脉输注白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白或血液制品,某些细菌败血病患者（尤其是链球菌败血症）,使用多糖类（香菇多糖、裂殖菌多糖）抗肿瘤类药物,食用蘑菇类食物,服用磺胺类药物、阿莫西林,/,克拉维酸、头孢类药物、多粘菌素、厄他培南也会引起不同程度的假阳性,G,试验假阳性影响因素,检测隐球菌和接合菌（犁头霉、毛霉、根霉）感染,抗原,-,抗体免疫复合物形成,抗真菌药的使用，如卡泊芬净，能非竞争抑制,BG,合成,标本放置时间过长（一般不,超过,6,小时）,G,试验假阴性影响因素,G,试验适用标本类型和采集、保存注意事项,1,、标本是血清，对于细胞培养液应使用专用试剂盒。,2,、细胞培养液标本必须离心，取上清液送检。,3,、标本采集应避免溶血，黄疸和脂血标本会影响检测结果，干扰程度与黄疸及脂血程度而定。,4,、标本最好在,6,小时内检测，如不能及时检测，应保存于,2-8,C,，不超过,24,小时，如长期保存,应保存于,-20,C,，但避免反复冻融（在保存期间可能会使,1,，,3-D-,葡聚糖降解或由于标本基质效应变化影响检测结果）。,三、,侵袭性曲霉菌病感染现状,曲 霉 菌,(,Aspergillus,),广泛存在于自然界，土壤、腐败有机物、粮食和饲料中较为常见；可在人体体表和粘膜定植。孢子较小，直径,23um,，可在空气中漂浮，可通过呼吸道进入人体。,具有致病性的主要是烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉、杂色曲霉、灰绿曲霉和棒曲霉。其中烟曲霉菌是引起免疫抑制患者严重深部曲霉菌感染的最常见病原菌。,侵袭性曲霉病,(,Invasive Aspergillosis,IA,),侵袭性曲霉病是一种严重的机会性感染性疾病。是指致病性曲霉菌侵犯皮下组织、黏膜、肌肉和内脏器官等所引起的真菌感染性疾病，危害性较大。,曲霉是条件致病菌，当机体免疫力下降时，如：粒细胞缺乏或,HIV,感染，可侵犯肺、甚至全身各系统；呼吸系统曲霉病主要有,三,种，即过敏性、曲霉球（即继发性非侵袭性肺曲霉病）和肺炎型；曲霉引起的败血症在粒细胞缺乏患者中较常见。,1991,年,1,月,-2009,年,10,月报道曲霉病,1457,例，其中肺曲霉病,1047,例,中国大陆地区曲霉病流行现状分析结果,曲霉感染部位最常见于肺部,曲霉菌感染的宿主因素,-,免疫缺陷,侵袭性曲霉菌感染的产生有两个先决条件，即患者有免疫缺陷和接触曲霉菌,机体免疫因素在侵袭性曲霉病感染的发生过程中起着至关重要的作用,酵母菌,主要菌种,流行病学,主要危险因素,曲霉菌,烟曲霉,黄曲霉,土曲霉,黑曲霉,引起感染，导致白血病、造血干细胞移植患者死亡的主要原因,通常吸入孢子引发感染,对抗真菌药物的耐药性增加,持续粒缺,移植,(,尤其是肺及造血干细胞移植,),HIV,类固醇,曲瑾,.,中国实用内科杂志,.2008;28,增刊,2,Pasqualotto AC and Denning DW.Business briefing:European oncology review 2005,多属于免疫缺陷类,免疫缺陷患者逐年增多导致,曲霉菌病增长,器官移植患者,肿瘤化疗患者,血液系统恶性肿瘤、实体瘤接受强化疗方案者增多,实体器官移植术及骨髓移植等患者的增多,免疫抑制,/,缺陷患者数量大幅增加,侵袭性曲霉病,发病呈增长趋势,李立青,医 学 研究生学报,.2006;29(12):165-167,血液病患者,免疫抑制,血液恶性肿瘤患者曲霉菌感染发生率在逐年升高,血液恶性肿瘤患者中侵袭性曲霉感染比例逐渐增加,Donhuijsen K,et al.Dtsch Arztebl Int.2008;105(28-29):501-506.,曲霉始终是血液科患者最主要的致病真菌,MD Anderson,癌症中心,20,年白血病患者尸检报告显示：曲霉及氟康唑耐药的非白色念珠菌的检出率呈上升趋势,曲霉菌,55%,烟曲霉,1%,黄曲霉,5%,土曲霉,5%,未分类,43.6%,曲霉菌,58%,烟曲霉,12%,黄曲霉,9%,土曲霉,9%,未分类,32%,伊氏肺孢子菌,4%,地方性真菌,1%,镰刀菌属,7%,接合菌,7%,地方性真菌,3.5%,镰刀菌属,5.3%,接合菌,9%,念珠菌,40%,白念,11%,克柔,4%,光滑,7%,热带,6%,其他,/,混合,13%,念珠菌,26%,白念,4%,克柔,5%,光滑,9%,热带,4%,其他,/,混合,13%,Leukemia patients,M.D.Anderson Cancer Center,CID,2010,50:405-15,1990-1999,年,2000-2008,年,曲霉菌临床感染现状,死亡率,不同基础疾患下侵袭性曲霉感染的死亡率,100%,90%,80%,70%,60%,50%,40%,30%,20%,0%,白血病,骨髓移植,肾移植,肺,/,心脏移植,肝移植,AIDS,49%,92%,68%,44%,75%,89%,死亡率,Teutsch,et al.Clin Infect Dis.2001,32:358,不同诊治情况下侵袭性曲霉,感染的死亡率,100%,90%,80%,70%,60%,50%,40%,30%,20%,10%,0%,死亡率,未能诊断，未治疗,病程,10,天以上,经验性早期诊治,有效药物治疗,100%,90%,65%,40%,David W Denning,The Lancet,2000,February 5,Vol 355,美国四大医疗中心做的关于,IFI,的一项回顾性研究,Garey KW et al.Clin Infect Dis 2006,43:2531,.,(n=230),早期诊断的意义,死,亡,率,(%),延迟治疗时间（,d,）,早期诊断和治疗已成为当今医学领域共同关注的重大问题！,四、侵袭性曲霉菌病的临床诊断治疗现状,2008,年,IDSA,曲霉病治疗指南指出多种方法用于诊断曲霉感染,诊断方法,特点,优势,劣势,培养,可明确区分曲霉和其它丝状真菌,血培养作用有限，某些播散性感染常常为假阳性,全身使用抗真菌治疗或其它原因易导致假阴性,细胞学检查、组织病理学检查,可获取明确的曲霉病诊断证据,需侵入性手段获取标本,全身使用抗真菌治疗或其它原因易导致假阴性,CT,检查,晕轮征、空气,-,新月征等有助于早期诊断,其它某些真菌或细菌感染也有可能出现相似征象,在免疫正常宿主相关研究较少,GM,试验,是诊断侵袭性曲霉病的替代指标,是建立早期诊断的有效辅助检查，尤其适用于存在高危因素患者的筛查时,有一定假阳性,G,试验,可早期检出侵袭性真菌感染,对曲霉不具特异性,有一定假阳性,PCR,检测,有较好的前景,目前方法尚未标准化，尚在研究阶段,联合,GM,检测与,CT,检查,提高侵袭性肺曲霉病的检出率,可提示早期开始抗真菌治疗的时机,Walsh TJ et al.Clin Infect Dis.2008;46:327-60.,曲霉菌的实验室检测方法,涂片,：,敏感性和特异性均较低。,无菌体液培养,：,耗时长，,敏感性差，,阳性率低。,1,3-,D-,葡聚糖检测：,G,试验,不能鉴别菌属,半乳甘露聚糖抗原检测：,GM,试验,曲霉菌抗体检测：,抗半乳甘露聚糖抗体检测试验,一、传统方法,二、针对真菌感染标记物的早期快速检测方法,病理切片：,取材困难，阳性率低。,金标准,检测曲霉菌属,快速报告结果,敏感性提高,取材简便,多以真菌在致病状态产生的物质为检测标志物，结果阳性提示有致病性,定量检测可判断感染严重程度及疗效评估,曲霉菌感染的非培养检测方法优势,欧洲癌症治疗研究组织,(EORTC),美国国家过敏症与传染病研究所霉菌病研究组,(MSG),批准用于真菌诊断,中国血液病,/,恶性肿瘤患者侵袭性真菌感染的诊断标准与治疗原则,(,第,3,次修订,),GM,试验被列入真菌诊断,和治疗的指南,GM,试验的临床意义,GM,试验阳性是侵袭性曲霉菌感染诊断标准中重要的,微生物学依据,可实现侵袭性曲霉菌感染的,早期诊断,可实现对高危人群曲霉菌感染的,动态监测,可对抗真菌治疗,提供用药依据,和进行,药效学评价,早期诊断,GM,试验检测的是,半乳甘露聚糖,，主要适于侵袭性曲霉菌感染的早期诊断，是曲霉菌特有的细胞壁成分，当菌丝生长时，半乳甘露聚糖从薄弱的菌丝顶端释放，是,最早释放的抗原,。,GM,试验检测,早于临床症状和影像学判断,【1】,：,可比侵袭性曲霉病,(IA),临床症状平均早,5-8,天；,比高分辨,CT,扫描平均早,7.2,天；,比开始经验性抗真菌治疗平均早,12.5,天,。,【1】,Pazos C et al.J Clin Microbiol,2005,43:299-305,曲霉菌,:,伏立康唑,伊曲康唑,卡泊芬净,两性霉素,-B,等,念珠菌,:,白色念珠菌,:,氟康唑,;,非白念,:,伏立康唑或卡泊芬净,;,卡氏肺囊虫,:,复方新诺明、卡泊芬净,毛霉菌,:,目前只有两性霉素,-B,不同病原,感染在临床用药方面的差异,GM,释放量与菌量成正比，可以反映感染程度，动态监测血清,GM,水平的变化有助于判断抗真菌治疗的效果。,在治疗期间,如果病人,GM,持续阳性或保持较高水平则预后差。,GM,抗原清除早的病人预后好，提示连续的血清,GM,检测能够监测病情变化。,评价疗效和病情监测,五、,GM,试验原理以及临床应用,GM,试验,半乳甘露聚糖,(Galactomannan,GM),是曲霉菌细胞壁上的一种多聚抗原，从薄弱的菌丝顶端释放，曲霉菌感染的患者血液内存在该物质，而且常于临床症状和影像学出现异常之前数日出现。,所以，,GM,试验可用于曲霉菌感染的早期诊断的筛查指标。,GM,试验,产品名称：,曲霉菌半乳甘露聚糖检测试剂盒（,ELISA,法）,方法：竞争法,ELISA,规格：,96,人份,/,盒,检测样本：血清,检测物质：,半乳甘露聚糖抗原,检测时间：,3,小时,阴阳性判断：阳性,GM,浓度,0.85g/L,疑似,0.85g/L GM,浓度,0.65g/L,阴性,GM,浓度,0.65g/L,GM,试验原理,酶标板上包被的是,GM,抗原和待检血清中的,GM,抗原都会与试剂中抗,GM,抗体（一抗）竞争结合形成抗原抗体复合物，然后再与带有酶的抗体（二抗）结合，作用于底物，显色。显色程度（,OD,值）与待测,GM,含量成反比。,操作简便：标准,ELISA,操作,早期诊断：早于临床症状和影像学判断，降低死亡率,快速检测：,3h,给出检测结果,结果可靠：敏感性高，特异性好,高灵敏度、快速检测方法,1.,造成,GM,实验假阳性的因素主要有：,（,1,）使用了半合成青霉素，如哌拉西林,/,他唑巴坦、阿莫西,林,/,克拉维酸,（,2,）与其他细菌或真菌成分有交叉反应,（,3,）肠道中定植的曲霉释放,GM,进入血液,（,4,）谷物食物中存在,GM,（如大豆），通过受损肠粘膜进入,血液,（,5,）接受白蛋白、免疫球蛋白和其他营养液治疗,（,营养液中一般都含有葡萄糖酸盐成分，葡萄糖酸盐会导致,GM,检测假阳性,）,（,6,）血液透析,（高球蛋白血症对试验的干扰）,（,7,）接受心肺旁路手术,（与使用大剂量肝素有关，是一种含硫酸基团的黏多糖）,（,8,）自身免疫性肝炎等免疫性疾病,（,9,）新生儿和儿童（,FP 83%,，与双歧杆菌交叉反应）,GM,试验影响因素,（,1,）抗真菌药物使用（如两性霉素,B,、三唑类药物），可抑制菌丝生长，从而减少,GM,分泌。,（,2,）对中性粒细胞不减少或减少不严重的其他,IA,高危人群诊断价值有限。,由于中性粒细胞能吞噬并快速杀伤菌丝，使体内真菌载量降低，从而使释放入血液的,GM,减少而难以检出。,2.,造成,GM,实验假阴性的因素主要有：,GM,试验影响因素,GM,试验,曲霉不同种，,GM,释放量不同，因此在检测结果上也有差异：,烟,曲霉和黄曲霉,GM,释放量偏,低；,土,曲霉、黑曲霉和构巢曲霉,GM,释放量较高。,标本种类及保存注意事项,1,、标本可以是血清，也可以是肺泡灌洗液等其他无菌体液。,2,、除血清外，其他标本必须离心，取上清液送检。,3,、标本采集应避免溶血。,4,、标本如不能及时检测，应保存于,2-8,C,，不超过,48,小时，如长期保存,应保存于,-20,C,，但避免反复冻融。,GM,试验主要适用科室,血液科（白血病等）,呼吸科（肺曲霉菌病）,ICU,科（危重症患者继发曲霉菌感染）,肿瘤科（肿瘤患者继发曲霉菌感染）,移植科室（移植术后继发曲霉菌感染）,感染科（,AIDS,等）,G,试验和,GM,试验联合检测有助于真菌属的鉴别,G,试验和,GM,试验联合检测,-,种属,G,试验,GM,试验,-,念珠菌属,+,-,镰刀菌属,+-,隐球菌属,-,-/,可有假阳性,曲霉菌属,+,青霉素,/,拟青霉,+-/,可有假阳性,接合菌纲,-,-,G,试验和,GM,试验联合检测可提高诊断的阳性预期值和阴性预期值,徐金富,李惠萍,瞿介明,.,两种抗原联合检测对诊断侵袭性肺曲霉病的诊断价值,.,中华结核和呼吸杂志,2009,32(9):709-710,单独检测：,联合检测：,血清,血清,敏感性,特异性,Suhail Ahmad,Ziauddin U.Khan.Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 59(2007)165 171,感谢聆听,