分子克隆工具酶及其应用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,分子克隆工具酶及其应用,分子克隆工具酶及其应用,限制性内切酶,主,要用于,DNA,分子的特异切割,DNA,甲基化酶,用,于,DNA,分子的甲基化,核酸酶,用,于,DNA,和,RNA,的非特异性切割,核酸聚合酶,用,于,DNA,和,RNA,的合成,核酸连接酶,用,于,DNA,和,RNA,的连接,核酸末端修饰酶,用,于,DNA,和,RNA,的末端修饰,其它酶类,-,用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。,第一节,限制性内切核酸酶,一,.,限制性内切酶的发现,1.,细菌限制修饰系统的发现,Werner,Arber,于,1962-1968,年发现，,1968,年分离到,I,型限制酶。,2.,限制酶,Hin,dII,的发现,H,O,Smith,和,Wilox,于,1970,年首次从流感嗜血杆菌（,H.,influenzae,）,中发现并分离到,Hin,dII,限制酶。,3.,SV40,限制图谱和转录图谱的绘制,D.,Nathans,（,1971,年）用,Hin,dII,绘制,SV40,的限制酶谱。,二,.,限制修饰系统的种类,1.,I,型,：,由三个基因构成，,hsd,R,；,hsd,M,；,hsd,S,（,h,ost,s,pecificity for,D,NA,r,estriction,m,odification and,s,pecificity,）,位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要,ATP,、,Mg,2+,、,SAM,（,腺苷甲硫氨酸）。,2.,II,型,：,限制与修饰基因产物独立起作用，在,.,coli,中这两种基因位于质粒上。,3.,III,型,：,修饰酶与型酶相同，,hsd,与,hsd,基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。,上述三个系统中，只有,II,型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。,三,.,限制性内切酶的定义、命名,1.,定义,：,广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指,II,型限制酶。,2.,命名,：,限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。,例如：,Hin,d,前三个字母来自于菌种名称,H.,in,fluenzae,，“,”表示菌系为型血清型；“,”,表示分离到的第三个限制酶。,Eco,RI,E,scherichia,co,li,RI,Hin,d,H,aemophilus,in,fluensae,d,Sac,I,(II),S,treptomyces,ac,hromagenes,I,(,),四,限制酶的特点,1.,识别顺序和酶切位点,）识别,-8,个相连的核苷酸,Mbo,I,N,GATC,N,；,Ava,II,G,G(A/T)C,C,Bam,HI,G,GATC,C,：,Ppu,MI Pu,GG,(A/T),CC,Py,Not,I GC,GGCC,GC,；,Sfi,I,GGCC N N N N N GGCC,CCGGNNNNNCCGG,Fok,I 5-,(,),9,-3,3-,(,),13,-5,外侧，产生,-,端突起,）富含,）对称性,双,对称,Eco,RI,5-,G A A T T C,-3,3-C T T A A G-5,）,切点大多数在识别顺序之内，也有例外,）限制酶切后产生两个末端，末端结构是,-,和,-,2.,末端种类,）,-,端突起,，个数为或个核苷酸,Pst,I,5-CTGCAG-3,5-CTGCA,G-3,3-GACGTC-5,3-G ACGTC-5,）,-,端突起,，个数为或个核苷酸,Eco,RI,5-GAATTC-3,5-G,OH,P,AATTC-3,3-CTTAAG-5,3-CTTAA,P,HO,G-5,）,平齐末端,Sma,I,5-CCCGGG-3,5-CCC GGG-3,3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5,）,非互补的粘性末端,）切点在识别顺序之外的，如：,Fok,I,Fok,I,5-,GGATG(,),9,-3 5-,GGATG(N),9,3-CCTAC(,),13,-5,3-CCTAC(N),13,）能识别简并顺序的，如：,Ava,I,Ava,I,5-,C,Py,CG,Pu,G,-3,C,C,CG,G,G,;C,T,CG,G,G;C,C,CG,A,G;,C,T,CG,A,G,）,相容性末端,如：,Bam,HI,G,GATC,C,Bgl,II,A,GATC,T,Mbo,I,Sau,3AI N,GATC,N,上述几种限制酶产生的,DNA,片段仍可相连，由此形成的重组分子能被,Mbo,I,和,Sau,3AI,识别和酶切，但,Bam,HI,和,Bgl,II,的识别机率只有,1/16,。,Bam,HI,+,Mbo,I,A/C/G/T,GATC,T/C/G/A,Bam,HI,和,Bgl,II,(AGATCT),两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切。,Bam,HI,+,Bgl,II,A/G,GATC,T/C,不同末端的连接特性,:,除第,4,种末端不能进行不同,DNA,分子或同种,DNA,分子不同切点产生的末端相连外，其余,4,种末端可以相互连接。,五,.,异源同序酶,（,isoschizomer,，,同裂酶）,1.,定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制 酶,2.,特点：,1,）识别相同顺序,2,）切割位点的异同,Kpn,I,G,GTAC,C,Asp,718 G,GTAC,C,Sst,I,CC,GC,GG,Sac,I,CC,GC,GG,限制酶的星反应（,star activity,）,1.,特点,:,限制酶识别序列特异性降低,2.,发生星反应的限制酶和条件,（见下页）,3.,星反应的利用和避免,表,1,具有星反应的限制性内切酶与条件,限制酶诱发星活性的条件,a,识别序列,Ava,I,1,2,4,Bam,HI,1-5,8 G GATCN,G,PuATCC,Bst,I,2,4,Bsu,I,2,4,6,Eco,RI,1,2,4-6 N AATTN,Hae,2,4,Hha,I,2,4,7,Hin,d 6,Hpa,I,1,2,4,Pst,I,1,2,4,7,Pvu,2,4,Sal,I,1,2,4,7,Sca,I,4-6,8,Sst,2,4,Xba,I,2,4,7,a.1,：,亚乙二醇,(45%),；,2:,甘油,(12%),；,3,：乙醇,(12%),；,4,：高酶,/,DNA,比,(25,U/g),；,5,：,Mn,+,代替,Mg,+,；,6:pH8.5;7:,二甲基亚砜,(8%);8:,无,NaCl,。,七,.,其它特异性的内切酶及其用途,1.,末端酶（,terminase,）：,5-,GGGCGGCGACCTN,-3,N,-5,，,出现的频率约,4,12,分子量为,117,000=1,A,（,74,000,）,+2,Nul,（,21,000,）,2.Omega,核酸酶（,I-,SceI,）：,由内含子编码，用于,rRNA,的剪切，出现的频率约,4,18,=6.9,X 10,10,bp,，,其,识别顺序为,5-,TAGGGATAACAGGGTAAT,-3,TATT,3.I-,PpoI,：,来自于,Physarum polycephalum,识别序列：,CTCTCTTAA GGTAGC,AATT,4.,用途,遗传标记，构建载体,八,.,限制酶的用途,1.,DNA,重组,2.,限制酶（物理）图谱绘制,3.,突变分析（,RFLP,分析）,4.,限制酶的部分酶切与完全酶切,附：,IIS,型限制酶的特点,1.,具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有对称结构。,2.,酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点的一侧，,1-20,nt,。,3.,酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。,4.,产生粘性末端可以是,1-5,个核苷酸。,5.,均为单体，分子量为,47108,kD,。,第二节,DNA,甲 基 化 酶,一,.,甲基化酶的种类与识别顺序,1.,限制修饰系统,I,、,II,、,III,型中的甲基化酶,三个系统中的甲基化酶可使细菌,DNA,分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成,5-,甲基胞嘧啶和,6-,甲基腺嘌呤：,在,DNA,重组实验中，常用的甲基化酶属于,II,型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。,如：,M.,EcoRI,GA,m,ATTCC,Eco,RI,G AATTC,不同,M,HpaI,C,m,CGG,Hpa,I,C CGG,相同,2.,E,coli,的,dam,、,dcm,甲基化酶,这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统。,dam,G,m,ATC,，,dcm,C,m,CA,/TGG,3.,哺乳动物的甲基化酶,该酶可使,CG,中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与,DNA,复制、基因转录等过程有关。,4.,E,coli,中依赖于甲基化的限制修饰系统,mrr,（,m,A,/A,）、,mcr,(A,m5,CG),、,merB,（,Pu,m5,C,）,二,.,甲基化酶活性对限制酶活性的影响,1.,dcm,和,dam,甲基化酶对限制酶的影响,1,）抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序是完全重叠还是边界重叠,如：完全重叠,Bcl,I,dam(,GATC,),；,Scr,FI,dcm,(,CCA/TGG,),边界重叠,Cla,I,-dam,；,Sau,96I-,dcm,2,）,不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重叠,如：,dam-,Bam,HI,，,Sau,3AI,，,Bgl,II,，,Pvu,I,；,dcm,-,Bst,NI,表,2,对甲基化敏感的限制性内切酶,限制酶 识别序列,*,甲基化酶,Ava,GG(A/T),CC,(A/T)GG,dcm,Bcl,T,GATC,A,dam,Cla,G,ATC,GAT,dam,Eco,R,CC(A/T)GG,dcm,Hph,GGT,GA,TC,dam,Mbo,GATC,dam,Nru,GA,TC,GCGA,dam,Sau,96,GGN,CC,(A/T)GG,dcm,Sau,F,CC(A/T)GG,dcm,Stu,AGG,CCT,GG,dcm,Tag,GATC,GA dam,Xba,TCTA,GA,TC,dam,*,下横线字母表示限制酶识别序列,绿色字母表示,dam,甲基化酶识别序列,红色字母表示,dcm,甲基化酶识别序列,2.,II,型甲基化酶,对限制酶活性的影响,）,抑制同种限制酶的活性,M.,BamHI,GGAT,m,CC,Bam,HI,(G,GATCC),M.,EcoRI,GA,m,ATTC,Eco,RI,(G,AATTC),）,抑制不同种限制酶的活性,a.,顺序完全重叠 如：,M.,ClaI,（,A,TCG,m,A,T,）,-,Taq,I,（,TCG,m,A,）,b.,顺序边界重叠 如：,M.,BamHI,（,GGAT,m,CC,）,-,Mep,I,（,m,CCGG,）,）,抑制不同种限制酶的部分活性,M,TaqI,（,TCG,m,A,）,-,Hin,dII,（,GTPyPuAC,）：,GTCAAC,，,GTTAAC,，,G,TCG,m,A,C,，,GTTGAC,3.,甲基化酶的用途,）,改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成,）,在建立基因文库时，可先使,DNA,分子部分甲基化，然后再用限制酶切,表,3,甲基化酶与识别序列,甲基化酶 识别序列,a,受甲基化影响的限制酶,b,M.,Alu,AG,m,CT,Alu,Bam,H,Bsp,1286,Dde,Hgi,A,Nhe,Pst,M.,BamH,GGAT,m,CC,Bam,H,Msp,M.,Cla,ATCG,m,AT,Cla,Mbo,Taq,dam,G,m,ATC,c,dcm,CCA/TGG,c,M.,EcoR,GA,m,ATTC,Eco,R,M.,HI,d,GCNGC,GG,m,CC,Mst,Pst,Pvu,M.,Hae,GG,m,CC,Ban,Bgl,Bsp,1286,Bst,X,Hae,Msp,Nae,Nco,Sac,Sau,96,M.,Hha,G,m,CGC,Aha,Fnu,D,Hha,M.,Hpa,C,m,CGG,Aha,Ava,Ava,Hpa,Scr,F,M.,Hph,T,m,CACC,Hin,f,Hph,Sau,3A,M.,Msp,m,CCGG,Bam,H,Msp,M.,Pst,CTGC,m,AG,Alu,Pst,M.,Taq,TCG,m,A,Alu,I,Ava,Eco,RV,Hin,C,Hin,f,Mbo,Taq,Xmn,a.,标在碱基的左上角的,m,表示该碱基被甲基化,;,b.,所列出的限制酶均已商品化,;,c.,参见表,2;,d.M.HI,分离自噬菌体污染的细菌细胞，它可识别两个序列，,GCNGC,的甲基化位点尚未确定。,M.RE,CH,3,CH,3,CH,3,RE,RE,RE,RE,RE,RE,RE,RE,RE,RE,RE,CH,3,CH,3,CH,3,与载体相连,甲基,化酶,人工,接头,RE,用于基因组文库的建立,用于,cDNA,的连接,RE,RE,RE,第三节,核 酸 酶,ds,-DNA,结构,:,切口,缺口,断口,缺口,(,gap),切口,(,nick),断口,(,cut),3,HO,P5,3,HO P5,一,.,外切酶,III,（,ExoIII,）,1.,一般特点：,来自于,E.,coli,，,分子量,28,000,kD,2.,催化反应类型,1),外切酶活性,：,3 5,，产生,5-,单磷酸核苷酸和具各种结构的,ds,-DNA,，,pH 7.6-8.5,2),核酸酶,H,活性：除去,DNA-RNA,杂交分子中的,RNA,分子，,pH 7.6-8.5,3)3-,磷酸酶活性：除去,3-,磷酸基后形成,3-,OH,端，有利于,DNA,聚合酶反应，,pH 6.8-7.4,4),内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将,DNA,键切开，,pH 7.6-8.5,3.,外切酶活性特点,1),反应底物：互补,ds,-DNA,2),碱基释放速度：,C,A-T,G,3),反应产物：,5-,单磷酸核苷和具缺口或,5-,端突起的,ds,-DNA,，,过度反应将导致,DNA,降解,4.,用途,1),核酸（,DNA,）,标记,2),基因突变,-,缺失,3),DNA,序列测定时作顺序缺失,5.,使用注意事项,1),正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度,2),在一定条件下，,ExoIII,不能作用,GC,富集区,(,来自于,cDNA,加尾,),5,P,5,P,5,P,5,P,5,P,3,HO,3,HO,3,HO,3,HO,3,HO,3,HO,3,HO,3,HO,OH3,OH3,OH3,OH3,P5,P5,P5,P5,P5,P5,P5,3,HO,P5,OH3,P5,RNaseH,ExoIII,的外切酶和,RNaseH,的作用,1 2 3 4,a b c,1 2 3 4,a b c,1 2 3 4,a b c,1 2 3 4,a b c,1 2 3 4,a b c,2 3 4,a b c,3 4,a b c,4,a b c,a b c,ExoIII,用于顺序缺失,ExoIII,ExoIII,-,32,P,-,32,P,dCTP,dCTP,5,P,P5,5,P,P5,3,HO,OH3,3,HO,OH3,ExoIII,用于,DNA,标记,二,.,外切酶,1.,反应特点,1),作用底物,:,要求,5-,PO,4,基,;,不作用含切口的,DNA,分子,2),作用方向与产物：,5 3;,产生,5-,P,核苷和,3-,突起的,ds,-DNA,2.,用途：,DNA,定序测定,;,除去,5-,端突起，产生,3-,端突起，便于加尾,3,HO,3,HO,3,HO,OH 3,OH 3,OH 3,5,P,5,P,5,P,P 5,P 5,P 5,AAAAAA,AAAAAA,TdT,+,dATP,三,.,核酸酶,Bal31,1.,一般特点：,胞外酶；具,DNase,和,RNase,活性；由“快”和“慢”两种成分构成,2.,催化反应特点,1),底物：,ss,-DNA,，,ds,-DNA,，,RNA(,外切与内切活性,),2),作用方向与产物：,5 3,和,3 5,同时进行，但反应速度不同；产生,5-,单磷酸核苷和缩短的,ds,-DNA,3.,用途：,基因突变,-,缺失,;,绘制限制酶谱,;,DNA,定序,(,与,ExoIII,相同,),，其优点是,Bal31,酶活依赖于,Ca,+,和,Mg,+,，,Ca,+,在反应完毕后可用,EGTA,（,乙二醇四乙酸）灭活而不影响,Mg,+,浓度，后者是限制酶活性必需的,4.,使用注意事项：,1),应作预备实验，因每批酶制品的“快”“慢”酶含量不同,2),DNA,两条链碱基组成不同，终止反应时存在单链突起，需要补平,5,P,P5,3,HO,OH3,核酸酶,Bal31,的活性,四,.,核酸酶,S1,1.,一般特点：,糖蛋白,(,含糖量,8%),，最佳,pH 4.5,，,对热稳定，抗变性剂,2.,催化反应类型,:,ss,-DNA;,ss,-RNA;,双螺旋变性区,3.,用途,1),基因突变,-,缺失，常与外切酶，如,ExoIII,、,外切酶、,Bal31,连用,2),DNA,定序分析,3),S1,作图法,4),基因结构分析,5),tRNA,结构分析,4.,使用注意事项,1),避免长时间反应，因最适酸性,pH,将导致,DNA,断裂或降解,2),避免使用高浓度酶量，以免,DNA,被降解,(,因产生切口,),ExoIII,S1,S1,S1,S1,S1,S1,Poly(A),Poly(A),5,5,5,5,5,5,核酸酶,S1,活性,五,.,绿豆核酸酶,1.,与,S1,酶相同点：,作用于,ss,-DNA,和,RNA,，,对,5-,端的突起核苷酸作用速度为,GCAT,2.,与,S1,酶的不同点,最适,pH,接近中性，不会产生切口,;,不使具切口的,ds,-DNA,断裂,3.,用途：,与,S1,酶相同,六,.,外切酶,作用于,ss,-DNA,的,3-,与,5-,端，产物为低聚核苷酸,除去单链,DNA,形成平整末端,七,.,牛脾磷酸二酯酶,作用含,5-,羟基端的,ss,-DNA,和,RNA,，,产生,3-,单磷酸核苷,用于短链,RNA,和,DNA,的定序分析,八,.,蛇毒磷酸二酯酶,作用,3-,羟基单、双链,DNA,和,RNA,，,产生,5-,单磷酸核苷,用于,RNA,和,DNA,的定序分析,表,4,几种常用外切酶的特点,外切酶 作用方向 作用底物 反应产物,ExoIII,35,dsDNA,单核苷酸,外切酶,5,3,ss,和,dsDNA,同上,Bal31,35,和,5,3,ss,和,dsDNA,RNA,同上,S1 35,和,5,3,ssRNA,和,ss,DNA,低、核苷酸,绿豆核酸酶,35,和,53,ssRNA,和,ss,DNA,同上,Exo,VII 35,和,53,ssDNA,低聚核苷酸,牛脾磷酸二酯酶,53,ssRNA,，,ss,DNA,同上,蛇毒磷酸二酯酶,35,ss,，,ds,RNA,和,DNA,同上,九,.,RNase,大部分用于,RNA,的核苷酸序列分析或除去,DNA,样品或蛋白质合成系统中的,RNA,分子。,RNase,的识别序列和特点见,表,5,。,1.,RNase,A,分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（,100,加热,15,min,仍具活性）,用于除去,DNA,样品中的,RNA,分子,2.,核酸酶,S7,，,亦称微球菌核酸酶，对,RNA,敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源,mRNA,十,.,RNase,H,作用于,DNA-RNA,杂交分子中的,RNA,链，用于,cDNA,文库建立时除去,DNA,链以便第二条链,cDNA,链的合成。,表,5,核糖核酸酶反应特点,核酸酶 特异性反应 核酸酶 特异性反应,A,Pyp,/N,PhyM Ap,/N,或,Up/N,CL3 Cp/N,Ap,/N,和,Cp/N,B,.,cereus,Cp/N,Up/N,T1,Gp,/N P1,无特异性反应,T2,无特异性反应,S7,Np,/A,和,Np,/U,U2 Pup/N,或,Ap,/N,Phy1,Ap,/N,Gp,/N,和,Up/N,十一,.,DNase,I,1.,特点：,具内切酶活性，作用于,ds,-DNA,，,但无核苷酸序列特异型，产生,5-,P,低聚核苷酸,;,Ca,2+,Mg,2+,或,Ca,2+,Mn,2+,可使酶活达最大值,当酶浓度很低时，,ds,-DNA,分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：,Mg,2+,存在时，两条链上的切口独立无关,Mn,2+,存在时，两条链上的切口几乎在同一位置,2.,用途,1),切口移位,，制备,DNA,探针,2),制备,RNA,样品时除去,DNA,分子,3),基因突变时产生切口,Mn,+,存在时,Mg,+,存在时,DNaseI,作用特点,DNaseI,HO P,5,3,5 3,5 3,DNaseI,与,Pol,I,的,切口移位,Pol,I,第四节,DNA,聚 合 酶,一,.,E,.,coli,DNA,聚合酶,I,（,polI,）,1.,E.,coli,的,DNA,聚合酶系统,Pol,I,参与,DNA,修复,具,35,和,5,3,外切酶活性,pol,II,同上 具,35,外切酶活性,pol,III,参与,DNA,复制,具,35,和,5,3,外切酶活性,2.,E.,coli,polI,的特点,1,）具两种外切酶活性和,DNA,聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具,5,3,外切酶活性，大片段具,35,外切酶活性,(,大片段亦称为,Klenow,片段,polIK,),2,）,聚合酶活性，,5,3,要求,3,-,OH,引物和模板,DNA,，,其延续性受反应条件的影响（,表,6,）,3,）外切酶活性,3.,用途,1,）除去,3-,端突起的单链,DNA,（,在无,dNTP,时）,2,）补齐,5-,突起端,3,）合成第二条,cDNA,4,）,切口移位制备探针 其中用途,2),和,3),常用大片段,表,6,E.,coli,DNA,PolI,的延续性,DNA,模板,-,引物类型 反应条件 延续性,(,碱基数,),切口,ColE1,37,C,低盐,8,缺口,ColE1 37,C,低盐,47,切口,/,缺口胸腺,DNA,37,C,低盐,24,poly d(AT),37,C,低盐,188,poly d(AT),5,C,低盐,14,poly d(AT),5,C,高盐,3,二,.,T4 DNA,聚合酶,1.,特点：,5,3,聚合酶活性，,1500,nt,/min,为,pol,I,的两倍,35,外切酶活性，可作用于,ss,-DNA,和,dsDNA,其切除速度分别为,40,和,4000,nt,/min,2.,用途：,制备高比活性探针,(10,10,cpm,/,gDNA,);DNA,末端修饰,-,缺失,5,CAGCAACGT,3,dATP,CAGCAACGT 3 S1 T 3,3GTCGTTGCA,5,T4,聚合酶,A,5,A 5,外切酶活性,聚合酶活性,无,dNTP dNTP,三,.,反转录酶,1.,AMV,反转录酶,1,）结构与酶活性 反转录酶以,，,，,形式存在，其中,（,无活性）,P32,（,内切酶活性）,+,聚合酶,+,P24,（,RNase,H,活性），各步反应由蛋白酶催化,2,）聚合酶活性,a.RNA,，,DNA,引物（大于,8,nt,）,cDNA,链,b,DNA-RNA,引物互补,DNA,链,c,(,rA,),1100,(,dT,),12-18,(,dT,),n,or (,rc,),n.,dG,n,(,dG,),n,反转录酶的结构和活性,P24,190,kD,160,kD,65,kD,24,kD,P32,RNaseH,聚合酶,5,AAAAA3,引物,5,AAAAA 3,TTTTT 5,反转录反应,5 3 5 3,3 5 3 5,全长,cDNA,提前终止反应,2.,M-MLV,反转录酶,1),特点：,不具内切酶活性,;,RNase,H,活性低,;,稳定性差,2),与,AMV,反转录酶比较,a,合成短链,cDNA,(0.6 kb),时，两者相同，但,M-MLV,反转录酶需要量大，可能与其稳定性差有关,b,合成长链,cDNA,(4.5-7.5 kb),时，它比,AMV,反转录酶有效得多，这与它无内切酶活性有关。,3),用途,a.,cDNA,合成用于文库建立,;,b.,制备,cDNA,探针,;,c.DNA,序列分析,;,d.,填补,5-,突起末端以获平端,四,.,Taq,DNA,聚合酶,1.,特点：,分离自水生栖热菌，分子量为,94,000,，最适反应温度,75,，对,95,高温具良好稳定性，该酶不存在,3,5,外切酶活性,2.,用途：,主要用于,DNA,的体外扩增，经,25,次循环后才进入酶的反应稳定期，一个,DNA,分子因而可被扩增,410,6,倍,DNA,扩增技术又称为,聚合酶链式反应,，它包括以下三个步骤：,DNA,模板变性,(95,),与,DNA,引物退火,(45,),引物延伸,(75,),Taq Pol,和,PCR,5 3,变性,3 5,5 3,引物,3 5,复性,5 3 5 3,3 5,引物,3 5,5 3,延伸,5 3,3 5,3 5,五,.,DNA,定序酶,用基因工程方法去除,35,外切酶活性的,Taq,DNA,聚合酶,六,.,Tth,DNA,聚合酶,93,kD,，,75,，,含有二级结构,DNA,分子的定序,七,.,Tli,DNA,聚合酶,100,仍具酶活，,35,外切酶活性，,85,kD,DNA,的切平反应和补平反应,DNA,聚合酶和核酸酶,S1,或绿豆核酸酶连用,可用于,DNA,末端结构的修饰,5,AAGCTT3,Hin,dIII,5A AGCTT3,3TTCGAA5,3TTCGA A5,S1,dNTP,+,klenow frag,5A T3,5AAGCT AGCTT3,3T A5,3TTCGA TCGAA5,T4 DNA,连接酶,T4 DNA,连接酶,5,AT3,5AAGCTAGCTT3,3TA5,3TTCGATCGAA5,切平反应和补平反应,四种不同补平反应,5-,GGATCC-3,Bam,HI,5-G,GATC,C-3,3-CCTAGG-5 3-C,CTAG,G-5,dNTP dGTP dGTP,/,dATP dGTP,/,dATP,/,dTTP,5-G,GATC,5-G,G,5-G,GA,5-G,GAT,3-C,CTAG,3-C,CTAG,3-C,CTAG,3-C,CTAG,GATC,C-3,GATC,C-3,GATC,C-3,GATC,C-3,CTAG,G-5,G,G-5,AG,G-5,TAG,G-5,I,S1,S1,S1,5-G,G,C,C-3,5-G,GA,TC,C-3,5-G,GAT,ATC,C-3,3-C,C,G,G-5,3-C,CT,AG,G-5,3-C,CTA,TAG,G-5,II,III,第 五 节,RNA,聚 合 酶,一,.,SP6 RNA,聚合酶,1,、特点：,依赖于,DNA,的,RNA,聚合酶，具,SP6,启动子特异型,2,、用途：,主要用于,RNA,分子的体外合成，,RNA,分子可用于：,1,）,RNA,分子的拼接研究,2,）标记的,RNA,常用于杂交，,RNA-DNA,比,DNA-DNA,分子更稳定，两条链均可标记，产生的,RNA,具高放射比活性,3,）,DNA,的定序分析,4,）基因结构的研究，其中包括内含子数目，长度和位置,5,）还可以用于蛋白质的合成研究,RNA,聚,合,酶,活,性,二,.,T7 RNA,聚合酶,特异性识别,T7,噬菌体基因启动子,三,.,T3 RNA,聚合酶,特异性识别,T3,噬菌体基因启动子,基因启动子识别的特异性比较：,SP6T7T3,四,.,E.,coli,RNA,聚合酶,五,.,多聚核苷酸磷酸化酶,第 六 节,连 接 酶,一,.,T4 DNA,连接酶,1.,特点：,只连接,ds,-DNA,分子，要求,3-,羟基和,5-,磷酸基,2.,用途：,1),相同或相容粘性末端的连接,2),平整末端的相连,DNA,平端来源：限制酶作用结果,;,限制酶与其它酶共同作用结果。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多,3,.,抑制剂：,PO,4,3-,5mM,NaCl,25mM,Ca,+,0.1mM,5-,AAGCTT-3,5-A,OH,P,AGCTT-3,P,AGCTT A,OH,3-TTCGAA-5,3-TTCGA,P,HO,A-5,HO,A TTCGA,P,退火,5-,A,HOP,AGCT T A,HOP,AGCT T-3,3-T TCGA,POH,A T TCGA,POH,A-5,或,5-,A,HOP,AGCT T A,HOP,AGCT T-3,3-T TCGA,POH,A T TCGA,POH,A-5,T4 DNA,连接酶,5-,AAGCTT AAGCTT-3,3-TTCGAA TTCGAA-5,或,5-,AAGCTT AAGCTT-3,3-TTCGAA TTCGAA-5,T4 DNA,连接酶的连接反应,(,两种插入方向,),+,二,.,E.,coli,DNA,连接酶,只能连接具粘性末端,DNA,分子，以,NAD,作辅助因子,三,.,T4 RNA,连接酶,参与单链,RNA,分子的连接。,主要用于提高,T4 DNA,连接酶在连接反应中的连接效率（,20,倍）,HO P HO P,HO P,5 3 5 3 5 3,RNA,连接酶活性,第七节,核 酸 末 端 修 饰 酶,一,.,细菌碱性磷酸酶,（,BAP,）,1.,特点,1),除去,ss,-DNA,，,ds,-DNA,和,RNA,分子两端的,3-,和,5-,磷酸基,2),对热稳定,2.,用途,1),载体,DNA,的去磷酸化，防止自我连接，以增加重组频率,2),核酸末端标记,二,.,牛小肠碱性磷酸酶（,CIP,）,与,BAP,相同，只是,CIP,对热敏感,-,32,PATP,ATP,5,P,OH 3,5,32,P,OH 3,3,HO,P 5,3 HO,32,P,5,I,II,5,P,OH3,5HO,OH3,5,P,OH 3,3,HO,P 5,3HO,OH5,3HO,P,5,磷酸酶,(,I),与磷酸激酶,(,II),活性,磷酸激酶的交换反应,三,.,T4,多聚核苷酸激酶,1.,催化反应类型,1),激酶活性（,5-,磷酸化酶）：可将,ATP,中的,位的磷酸基转移到,ss,-DNA,，,ds,-DNA,和,RNA,分子的,5-,羟基端，在这反应过程中可有两种方式进行（,pH7.5-8,）,.,转移反应；,.,交换反应,2)3-,磷酸酶活性（,pH 5-6,）,2.,用途,1)5-,端末端标记,2),分子克隆过程中以获得,5-,磷酸基末端，便于连接酶反应,四,.,末端转移酶,（,TdT,）,1.,反应特点,底物：,dNTP,及衍生物，,3,个核苷酸，要求,3-,OH,端，需要,ss,-DNA,作为引物，以,3-,突起端的,ds,-DNA,为最高，亦可用于,ds,-DNA,加尾,2.,核苷酸掺入速度,二甲基砷酸盐缓冲液和,Mg,2+,可提高嘌呤核苷酸的掺入速度，而,Ca,2+,可提高嘧啶掺入速度,3.,用途,3-,加尾，便于两,DNA,分子重组,;,3-,末端标记,五,.,多聚腺嘌呤聚合酶,该酶是在,RNA,分子的,3-,端（,OH,）,加上一个多聚,A,的尾巴，其用途可标记,RNA,和 加尾的,RNA,，,可用于,cDNA,的合成,六,.,烟草酸性焦磷酸酶,可除去,mRNA,帽子结构中的焦磷酸,:,m,7,Gp-p,-p-,Xp,-,Yp,-,mRNA,p-,Xp,-,Yp,-,mRNA,七,.,鸟苷酸转移酶,1.,催化类型,RNA,三磷酸酶,:,pppN,(,pN,),n,ppN,(,pN,),n,+Pi,鸟苷酸转移酶,:,-,32,PGTP+,ppN,(,pN,),n,G,32,pppN(,pN,),n,+,PPi,RNA,甲基转移酶,:,AdoMet,+G(5),pppN,(,pN,),n,m,7,G(5),pppN,(,pN,)n+,AdoHCy,2.,用途：标记,DNA,第八节,其 它 酶 类,1.,原生质体的制备酶类,制备原生质体目的：外源,DNA,导入；核酸和蛋白质的提取,溶菌酶，,zymolyase,，,glusulase,，,NovoZyme,，,溶壁酶，纤维素酶,2.,蛋白质降解酶类,蛋白酶,K,3.,检测酶类,抗生蛋白链素,-,半乳糖苷酶,碱性磷酸酶,辣根过氧化物酶,练 习 题,1.,一种,DNA,分子经三种限制酶完全酶切后得如下结果：,Eco,RI,5kb,Eco,RI,/,Hin,dIII,1,、,2,、,3,、,4kb,Hin,dIII,3kb,、,7kb,Eco,RI,/,Pst,I,2,、,3,、,5kb,Pst,I,10kb,Hin,dIII,/,Pst,I,1,、,3,、,6kb,将各限制酶位点绘制在,DNA,分子上。,2,.,另一,DNA,分子经相同处理后得如下结果，将各限制酶位点标在,DNA,分子上。,Eco,RI,1,、,3,、,6kb,Eco,RI,/,Hin,dIII,1,、,3kb,Hin,dIII,4,、,6kb,Eco,RI,/,Pst,I,1,、,3,、,5kb,Pst,I,2,、,8kb,Hin,dIII,/,Pst,I,2,、,6kb,3.,下图中的一段,DNA,分子上有两个限制酶,Pst,I,和,Eco,RI,识别位点，两位点相距,10,bp,，,现有一研究生要分析,Eco,RI,右侧,500,bp,区域内的功能，他需要在这一区域内获得各种缺失突变体以确定某功能区，他应如何设计此实验？假定,Eco,RI,Pst,I,间的,10,bp,除去后并不影响任何结果分析，但,Pst,I,位点左侧的,DNA,不能除去,10,bp,500,bp,Pst,I,Eco,RI,4.,假如,Pst,I,位点为另一限制酶,Hin,dIII,，,实验又该如何设计？,5.,现有一研究者打算将一,Eco,RI,DNA,片段克隆到另一个,DNA,分子的,Bam,HI,位点以便,DNA,扩增，但扩增后的,DNA,分子又可用,Bam,HI,限制酶将插入的片段回收，如何设计此实验。,6.,一研究生要将一质粒（,pI,）,上的,Bam,HI,-,Hin,dIII,片段取代另一质粒（,pII,）,上的,Bam,HI,-,Xba,I,片段，所获重组质粒（,pIII,）,上的插入片段要求能用,Bam,HI,-,Hin,dIII,进行回收，问如何设计此实验？,10,bp,500,bp,Hin,dIII,Eco,RI,H,Xb,H,5kb,pI,1kb,6kb,pII,.5kb 6kb,pIII,1kb,B,B,B,7.,现有一重组质粒的限制酶谱和克隆到的基因转录方向入图所示：,已知,Hin,dIII,克隆片段中的,Bam,HI,（,3kb,）,片段含有一完整的基因编码区，现要将此,3,kb,的,Bam,HI,片段克隆到另一表达载体,pB,的,Bam,HI,位点，如何才能使插入片段与表达载体中的基因处于相同的阅读框架？如何证明插入基因的转录方向是相同的？,Hin,dIII,Pst,I,Bam,HI,Pst,I,Bam,HI,Bam,HI,Hin,dIII,pA,8kb,pB,0.5,2.5,8.,为了检测绿豆核酸酶对,5-,端突起的单链,DNA,切割是否准确有效，即该酶只除去单链而不损伤双链区。有一研究者设计了一套非常精巧的实验，其中一个实验是将一,Xba,I,片段插入,pBR322,的,Ap,r,基因内的,Sca,I,位点使该基因失活，然后再经一系列实验证明绿豆核酸酶的作用确实与预期的结果一致，你能否设计出这一套实验？,(,pBR322,除含有,A