第九章 基因工程和基因组学.ppt

单击以编辑,母版标题样式,单击以编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第九章 基因工程和基因组学,第一节 基因工程,遗传工程广义：细胞工程、染色体工程,细胞器工程、基因工程,狭义：基因工程,一、基因工程概述,基因工程是20世纪70年代初随着,DNA,重组技术的发展应运而生的一门新技术。,1982年经美国食品及药物管理局批准,，采用基因工程方法在细菌中表达生,产的人的胰岛素进入市场，成为基因,工程产品直接造福于人类的首例,1985年转基因植物获得成功,1996年克隆羊诞生。,现在，人类已利用这一技术改造和创,建新的生命形态、生产药品、疫苗、,牛奶和食品，诊断和治疗遗传疾病。,1.从细胞和组织中分离,DNA。,2.,利用限制性内切核酸酶酶切,DNA,分子，制备,DNA,片段。,3.将酶切的,DNA,片段与载体,DNA,连接，构建重组,DNA,分子。,4.将重组,DNA,分子导入宿主细胞后，在细胞内,复制，产生克隆(,clones)。,5.,重组,DNA,能随宿主细胞的分裂而分配到子细,胞，使子代群体细胞均具有重组,DNA,分子。,6.能从宿主细胞中回收、纯化和分析克隆的重,组,DNA,分子。,7.克隆的,DNA,能转录成,mRNA,、,翻译成蛋白质。,能分离、鉴定基因产物。,二、限制性内切核酸酶,限制酶,：作用于特定（异）核苷,酸序列的磷酸二脂酶，,是遗传工程的工具酶,目前已分离和鉴定出200多种不同的限制酶,限制性酶据其作用特点可分为两类:,第类:,每隔一段,DNA,序列随机切割双链,DNA,分子，没有序列特异性。很少在基因工程中应用。,第类:,能识别一段特异的,DNA,序列，准确地酶切双链,DNA,的特异序列。基因工程中广泛应用。,图 91 限制性内切酶,EcoRI,的酶切位点及酶切产物连接,回纹,序列,图 92 限制性内切酶,SmaI,的识别及酶切位点,平齐末端,三、载体,经限制性酶酶切的,DNA,片段或基因，必需与适合的载体,DNA,连接构成重组,DNA,后，才可以高效率地进入宿主细胞,，,并在其中复制、扩增、克隆,可作为,DNA,载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体,BAC、YAC,等,作为载体，需具备4个条件：,1.具复制原点,，,在宿主细胞中能独立复制,，能带动携带的外源,DNA,片段复制。,2.具有多克隆位点，即具有多种限制酶切,点，每一种酶的切点只有一个，用于克,隆外源,DNA,片段。,3.至少具有一个选择标记基因，这个基因,是抗菌素的抗性基因或某种酶的基因，,而宿主细胞则没有这种基因，使有或无,载体的宿主细胞具有易鉴别的表型。,4.易从宿主细胞中回收。,1、细菌质粒：广泛应用于基因工程,2、,噬菌体载体,1,、,噬菌体；,2,、,噬菌体,DNA,；,3,、,噬菌体,DNA,中间,基因簇；,4,、将连接物体外包装后感染细菌，制备基因库,（用于基因库构建）,3、柯斯质粒,：,是利用部分,噬菌体,DNA,与部分细菌质粒,DNA,序列组建而成的，它可接受长达50,kb,的外源,DNA,片段，,在克隆真核生物基因中十分有用,4、穿梭质粒,：,能在两种不同的生物中复制的载体。例如既能在原核生物(如大肠杆菌)中复制，又能在真核细胞,(如酵母)中复制的载,体。,很多酵母菌的,穿梭载体，用于功,能互补法分离、鉴,定真,核生物基因的,研究,5、细菌人工染色体,：,上述的几种载体都不能携带大于50,kb,的外源,DNA,片段，而很多真核生物基因长度在50,kb,以上。,细菌人工染色体(,BAC),载体就是为克隆更大的外源,DNA,片段而设计构建的,6、酵母菌人工染色体：,YAC,可接受100-1000,kb,的外源,DNA,片段，,这一特点使,YAC,成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的重要工具,7、,Ti,质粒及其衍生载体,Ti,质粒包括五个区域，1.,LB,与,RB,之间的,T-DNA，,这段序列整合到植物基因组中；2.质粒转移区(,PT)；,3.,冠瘿碱代谢区；,4.复制原点；,5.毒性区。,T-DNA,区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲(,disarmed),后，将细菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到这个区域，形成的,T-DNA,仍可将,RB,至,LB,内的序列转移并整合到植物基因组。,Vir,区的毒性基因是,T-DNA,转移所必需的，毒性基因可以顺式及反式两种方式控制,T-DNA,转移。,Ti,质粒是约200-500,kb,的环状,DNA,分子，很难直接使用，故需对其加以改造，构建出,Ti,质粒的衍生载体系统，广泛用作植物基因工程中的载体：,（1）双元载体(,binary vectors）,如,pBin19,载体，具有原核生物的卡那霉素抗性基因(,Aph,),作为细菌选择标记，真核生物的卡那霉素抗性基因(,nos,-,Npt,),作为植物的选择标记，,pUC19,的多克隆位点及,-,互补显色标记,（2）共整合载体(,integrated vectors),四、基因的分离与鉴定,一个基因就是编码一条多肽链的一个,DNA,片段，包括启动子、终止子及内含子。,利用,DNA,重组技术，可从一个含有10万个基因的大基因组中，准确地分离出特异的单个目的基因。分离与鉴定基因是,DNA,重组中的关键步骤之一。,1、从基因库中分离基因,基因库(,library),是一组,DNA,和,cDNA,序列克隆的集合体。从基因库中分离基因，首先要构建基因库。,（1）构建基因库,根据克隆的核酸序列、来源，基因库可分为,核基因库,、,染色体库,、,cDNA,库,、,线粒体库,等,核基因库：,将某一生物的全部基因组,DNA,酶切后与载体连接构建而成的。,方法是：尽量提取大分子量的核,DNA，,用限制性酶酶切后，分离选择具有一定长度(大于15,kb),的,DNA,片段，,与适宜的载体连接构成重组,DNA,分子,根据所用的载体，选择相应的宿主细胞用于克隆。,染色体基因库：,将基因组的一部分（如一根染色体）用来构建基因库，对于选择特异基因及分析染色体结构和组织十分有价值。,例如果蝇,X,染色体上的一个片段，具有50多个多线染色体带,，,利用微切割技术将这一段染色体切割，抽提,DNA,用限制性酶酶切后，克隆到噬菌体上构建成染色体片段基因库。,cDNA,库,cDNA,库是以,mRNA,为,模板，经反转,录酶合成互补,DNA（,cDNA,),构建,的基因库。,图 910,cDNA,合成示意图,1.,poly-T,引物和,poly-A,mRNA,分子复性；,2.在,poly-T,引导下开始形成互补,DNA(,cDNA,)；,3.,完整第一链,cDNA,合成，形成,RNA-,cDNA,杂合双链；,4.,cDNA,链在3,端形成发夹结构；,5.发夹结构引导合成第二链(或用,RNase,H,处理)；,6.用,S,1,酶将单链降解得到双链,cDNA,得到的双链,DNA,分子经两端补齐后，与带有限制性酶切点的人工接头连接，酶切后与载体,(,通常是,噬菌体,),连接，再用类似核基因库中介绍的方法，制备,cDNA,库。,cDNA,库与核,DNA,库不同，,cDNA,库仅具有用于分离,mRNA,的细胞或组织内表达的基因的,mRNA,序列，所以它仅包括基因组的部分基因序列。,cDNA,库对于研究基因的表达模式、分离某一特定基因是十分有用的。,（2）筛选基因库,大多数方法是利用一段核苷酸序列(,DNA，,cDNA,或寡核苷酸)作探针(,probe)，,用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库。,如：筛选,噬菌体构建的库常利用,菌斑杂交法,：,将经重组噬菌体(来自基因库)感染的宿主细菌细胞与培养基混合后，倒在培养皿中，培养过夜，形成噬菌斑(图911)。,图 911 筛选基因库,1、培养基因库，将噬菌斑,转移到硝酸纤维素膜上,2、将膜上的,DNA,变性成,单链,3、用标记的探针与膜一起,保温，进行分子杂交,4、将膜洗后，用,X-,光片,放射自显影，箭头处表,示有,杂交信号的斑点,5、挑出阳性克隆，用于进,一步分析,（3）阳性克隆的分析与鉴定,从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能得到目的基因。,限制性酶图谱,采用类似的方法，将不同,DNA,用限制酶消化，根据其产生,的多型性即,RFLP，,来分析,DNA,水平的变异程度，以,RFLP,作为,分子标记进行基因组图谱分析,此外，上述经,Not,或,Sal,消,化的片段，可以亚克隆到,pUC18,等质粒上，用于限制性,图谱分析或序列测定。,核酸分子杂交,Southern,杂交,:,a.,将,DNA,用限制性酶酶切；,b.,将酶切的,DNA,进行琼脂糖凝胶电泳；,c.,经过变性处理后，将凝胶上的,DNA,转移到膜上；,d.,用经过放射性同位素或非放射性同位素标记的,DNA,探针与膜上的,DNA,片段杂交；,e.,洗去膜上非特异性结合的探针后，用,X-,光片放射自显影检测杂交信号；,f.,如果转移的膜,上具有与杂交探针,相同或部分同源的,序列，放射自显影,后就会检测到杂交,带信号,Northern,杂交:,采用与,Southern,杂交相同的原理及程序，不同的是用,RNA,进行琼脂糖凝胶电泳。,基本程序,:,a.,提取总,RNA，,经过琼脂糖凝胶电泳;,b.,转移并进行分子杂交,杂交的探针来自克隆的基因;,c.,如果膜上有与探针互补的,RNA,分子，则在,X-,光片上可见到杂交信号带。,Northern,杂交广泛用于研究基因在不同细胞、组织或器官的表达模式，检测,mRNA,分子量大小以及,mRNA,加工过程中可能存在的不同方式，定量分析,mRNA,等。,Western,杂交:,用蛋白质电泳后转移到膜上进行分析,核酸序列测定,Sanger(1977),发明双脱氧核糖核酸链终止法:将序列反应分为,A，C，G,和,T,四管，每管中含有变性的,DNA,模板、,DNA,聚合酶、标记的引物、四种脱氧核苷酸，再掺入一种一定比例的双脱氧核苷酸(如,A,管中，即是腺嘌呤,A,双脱氧核苷酸，以此类推)。在,DNA,合成过程中，双脱氧核苷酸与互补序列配对被整合到正在延长的,DNA,链中，在不同,DNA,链上随机地整合在不同位置。由于双脱氧核苷酸在第三位,没有游离的羟基(-,OH)，,无法再连接另一个核苷酸，导致,DNA,链合成在这里终止。结果每一个反应管中都合成一系列不同大小的,DNA,分子。将四个反应产物并排点在聚丙烯酰胺凝胶上的四个孔中，电泳后每个孔中形成一条梯状,DNA,带，,从底部往上阅读，即是5到3端的序列:,CGCTCAGCTGGTGATTGTGT,核酸序列分析,测定的核酸序列是不是所需要的基因，或具有,什么功能，还要用计算机软件或生物学实验进,一步分析，才能最后得出结论。,同源性比较是常用的方法之一。,可从核酸及蛋,白质两种水平比较基因间的同源性。,首先可将,测出的核酸序列同杂交的探针序列进行比较，,或将得到的序列发到,BLAST,等,DNA Data,库的网址,上比较，很快就可知道测得的序列与所有的已,知序列之间的同源程度。,另一种方法是分析核酸序列的阅读框架。,一个,ORF,就是一段能编码一条多肽链，并通常具有翻,译起始信号以及一种终止信号的核苷酸序列。,2、聚合酶链式反应(,PCR),扩增基因,PCR,是体外快速扩增,DNA,的方法,由美国的,Mullis(1986),发明,可在几小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝。,方法:,首先根据待扩增基因序列合成两个引物，分别与待扩增基因二条链的两端互补，从5到3的方向向待扩增基因的中间延伸。在,DNA,模板变性成单链后，两个引物分别与单链,DNA,复性，在耐热,DNA,聚合酶(,Taq,酶)及四种脱氧核苷酸存在下，由引物引导合成,DNA,新链。,PCR,反应包括三个步骤：,(1)变性：,94-,95，,使模板,DNA,的双链变性成单链,(2)复性：,50-70,，,两个引,物分别与单链,DNA,互补复,性,(3),延伸：,72,，引物引导、,Taq,酶、,4,dNTPs,，,合成,模板,DNA,的互补,链,这三个步骤称为一个循环，,PCR,反应常有,25-35个循环。,一个循环完成后，待扩增,的基因扩增了一倍，新增加的基因又可作,为模板用于下一步的扩增，所以，,PCR,反应,中扩增的基因是成指数级增长的。因此仅,用少量的模板,DNA,分子，经,PCR,后可以得到,大量扩增基因产物。,PCR,扩增的基因经过核酸序列测定分析后，,可作为基因工程的目的基因。,根据,PCR,方法及原理，现已发展衍生出很多,新方法，如,RAPD,AFLP,等，广泛用于基因,分子标记等研究中。,3、人工合成基因,（1）化学合成多个含有80-100个核苷酸的寡核苷酸，每个寡核苷酸之间具有19-24个核苷酸的重叠序列,（2）将各个寡核苷酸等量混合，在,DNA,聚合酶(或,Taq,酶)作用下，各寡核苷酸又作为引物合成新链，使单链部分补齐成为双链，再用两个,PCR,引物，经,PCR,扩增出,DNA,片段。,（3）若将两个,DNA,片段放在一起，经,SOE-PCR,扩增出完整,的基因片段，或直,接测序，或克隆到,质粒上再测序后加,以利用。,五、重组,DNA,分子,六、将目的基因导入受体细胞（植物、,动物等），获得表达个,体转基因个体,1、农杆菌介导法,主要用于双子叶植物,2、基因枪法,主要用于单子叶植物,3、电击法、聚乙二醇法、,花粉管通道法、显微,注射法、超声波法、,激光微束法等,七、转基因生物的鉴定,PCR,Southern blotting,Northern blotting,Western blotting,特性（表型）鉴定,图,9,18,抗除草剂转,基因植物产生的方法,1,、将抗除草剂基因与,CaMV,35S,启动子连接,成重组,DNA,分子；,2,、将重组,DNA,分子与载,体连接；,3,、将重组质粒导入土壤,农杆菌；,4,、在土壤农杆菌介导下,，部分质粒及目的基,因整合到植物染色体,上；,5,、在选择培养基上选择,、培养、再生；,6,、抗除草剂转基因植株,八、基因工程的应用,1、,基因工程工业,生产胰岛素等,在,细菌中产生胰岛素的方法,2、转基因植物,抗除草剂、抗虫、抗病、抗逆的优 良品系或品种，很多,已经大面积种植推广。,2002年5000万公顷：,大豆、玉米、棉花、,水稻、马铃薯、番茄、,小麦等,3、转基因动物：羊、牛,4、遗传疾病诊断,（1）,RFLP,法（镰刀性贫血病）,（2）,等位基因特异寡核苷酸法,当已知突变基因,的核苷酸序列时，,就可以用人工合,成的寡核苷酸进,行,PCR,反应，将,PCR,产物用作点,杂交分析，鉴定,基因型,5、基因治疗,利用基因工程技术，将特异基因导入并整合到具有遗传缺陷的患者的基因组中，以治疗遗传疾病,基因治疗的载体和重组,DNA,分子,6、,DNA,芯片,DNA,芯片(,DNA chips),是将核酸分子杂交的原理和方法,与半导体技术结合而发展形成的一门新技术,九、安全问题,1、,转基因植物成为杂草,2、导致新的病虫害，威胁生物,多样性,3、食品安全性,第二节 基因组学,基因组学(,genomics,),是遗传学研究进入分子水平后发展起来的一个分支，主要研究生物体全基因组(,genome),的分子特征。,基因组学强调的是以基因组为单位，而不是以单个基因为单位作为研究对象，因此，基因组学的研究目标是认识基因组的结构、功能及进化，弄清基因组包含的遗传物质的全部信息及相互关系，为最终充分合理地利用各种有效资源，为预防和治疗人类遗传疾病提供科学依据。,基因组学的重要组成部分是基因组计划,，,如人类、水稻基因组计划，,大体可分为,：,1、,构建基因组的遗传图谱,2、构建基因组的物理图谱,3、测定基因组,DNA,的全部序列,4、构建基因组的转录本图谱,5、分析基因组的功能,基因组计划研究开始于,1990,年,，,美国国立卫生研究院,(,NIH),和能源部,(,DOE),联合启动了被誉为,“,人体阿波罗计划,”,的,“,人类基因组计划,”(,human genome project，HGP),。,在美国提出人类基因组计划后，英、法、日、前苏联、中等，也相继启动了类似的研究项目。,2000年6月26日，各国科学家公布了人类基因组工作草图，2001年8月26日，人类基因组计划中国部分测序项目汇报及联合验收会在京召开，标志人类基因组“中国卷”通过验收,1992,年8月，中国根据国情正式宣布实施自己的“水稻基因组研究计划”，已完成水稻基因组物理图谱的构建。,2002年4月5日，,Science,以,14页的篇幅刊登和宣布中国科学家独立绘制完成的水稻基因组草图序列（4.6亿）,一、基因组图谱的构建,在进行大规模序列测定之前，构建基因组图谱是测定大基因组全部核苷酸序列的重要一环。基因组图谱可作为序列测定中制定测序方案的依据，以便先重后轻地分析基因，锚定测知的核酸序列在染色体上的位置。,因此，在人类基因组计划实施过程中，首先用了六年时间构建高密度的基因组图谱，然后才进入测序工作。,1、,遗传图谱,（1）图谱标记,图谱构建中需要可以鉴别的标记(,marker)，,在构建遗传图谱中，可用基因和,DNA,作为标记。,基因标记：,用基因作为标记，分析各基因间的连锁关系及遗传距离，绘制出连锁遗传图谱,DNA,标记：,限制性内切酶多型性(,RFLP)、,简单序列长度多型性(,SSLP)、,单核苷酸多型性(,SNPs,),（2）遗传图谱的构建,人类基因组遗传图谱的构建：,人类的遗传图谱是利用家系分析法，在对8个家系的134个成员的分析中，主要根据5264个,STR,标记绘制而成的。利用这些家系的资料绘制第1至22号染色体图谱。对于,X,染色体图谱，还利用了来自另外12个家系，170个成员的资料绘制而成。,将5264个标记定位在2335个位点，据此构建的人类基因组遗传图谱的密度为每个标记599,Kb。,植物基因组遗传图谱的构建,：,选,择亲本,产生构图群体,遗传标记的染色体定位,标记间的连锁分析,2、,物理图谱,由于遗传图谱的分辨率有限、精确性不高，所以还要构建物理图谱。,基因组物理图谱的构建主要有三种途径：,限制性酶图谱,荧光原位杂交技术(,FISH),序列标签位点(,STS),如表达的序列标签(,EST)，,来自,cDNA,图,9,27,酵母菌第,III,染色体遗传图谱,(,A),与物理图谱,(,B),的比较,二、基因组图谱的应用：,1、基因组序列测定,2、基因定位,3、基因组比较分析,4、分子标记辅助选择,5、基因的克隆与分离,三、后基因组学,后基因组学(,post-,genomics,),是在完成基因组图谱构建以及全部序列测定的基础上，进一步研究全基因组的基因功能、基因之间的相互关系和调控机制为主要内容的学科。,后基因组学主要利用,DNA,微列阵技术、蛋白质组学、酵母菌双杂交系统以及生物信息学等技术相结合，对已知的基因组序列进行研究。,1、,DNA,微列阵,DNA,微列阵(,DNA,microarrays,),就是利用,DNA,芯片技术，同时进行大量分子杂交，以分析比较不同组织或器官的基因表达水平，筛选突变基因，从核酸水平分析基因表达模式。,2、蛋白质组学,蛋白质组学(,proteomics,),是从蛋白质水平来研究基因组的基因表达，分析基因组的蛋白质类型、数量、空间结构变异以及相互作用的机制。,3、酵母菌双杂交系统,酵母菌双杂交系统(,two hybrid-systems),是利用在酵母菌的同一个细胞中共同表达不同蛋白质，以鉴定蛋白质之间互作的一种分析方法。,4、生物信息学,生物信息学(,bioinformatics,),是利用计算机贮存原始资料，分析生物信息，将,DNA,芯片以及蛋白质双向电泳结果转变成为可读的遗传学信息的学科。生物信息学是将现代生物技术与计算机科学结合，收集、加工和处理生物资料。,图 8,29 酵母菌双杂交系统,A,、,双杂交系统组成,B,、,将,A,中的构建体混合，转化酵母菌,自从1996年酵母菌基因组全序列测定以来，在,4,年多时间里，全世界已有,1000,多个实验室，,5000,多名科学家从事酵母菌后基因组学的研究，共发表论文,7000,多篇，鉴定,1060,个新基因的功能，但仍然还有约,1600,个阅读框架的功能不清楚。这些结果充分说明后基因组学研究的复杂性。,酵母,1.5,10,7,拟南芥,1.0,10,7,水稻,4.3,10,8,人类,3.3,10,9,玉米,5.4,10,9,