第十章吸光光度法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十章 吸光光度法,10-1,吸光光度法,10-2,吸光光度法仪器,制作者：施忠斌 杨敏岚,教学内容,：,物质对光的选择性吸收、光吸收定律及其应用条件、摩尔吸光系数与灵敏度；显色反应及其影响因素；吸光光度法的特点与应用、吸光光度法仪器,教学重点,：吸收光谱、工作波长的确定、线性范围、检出限、准确度与精密度、回收率,教学难点,：参比溶液的选择、共存离子干扰、络合物组成的确定,化学分析,：常量组分,(1%),E,r,:0.1%,0.2%,依据化学反应,使用玻璃仪器,化学分析与仪器分析方法比较,仪器分析,：微量组分,(1%),E,r,:1%,5%,依据物理或物理化学性质,需要特殊的仪器,例,:,含,Fe,约,0.05%,的样品,称,0.2 g,则,m,(Fe)0.1 mg,重量法,m,(Fe,2,O,3,)0.14 mg,称不准,容量法,V,(K,2,Cr,2,O,7,)0.02,mL,测不准,光度法,结果,0.048%,0.052%,满足要求,准确度高,灵敏度高,第十章 吸光光度法,10-1,吸光光度法,特点,灵敏度高：测定下限可达,10-5,10-6molL-1,10-4%,10-5%,准确度能够满足微量组分的测定要求：,相对误差,2,5,（,1,2,）,操作简便快速,应用广泛,吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。,I,0,I,t,光强的,测量,分光光度计,分光光度法的应用：,定量测定与定性分析,物质对光有选择性吸收,光强的减弱与物质浓度的关系？,朗伯,-,比尔定律,测量光强度的减弱,光的性质及物质对光的选择性吸收,光的性质 光具有二象性,即波动性和粒子性,可用普朗克方程表示,:,c,真空中光速,2.99792458108m/s,3.0 108m/s,波长，单位：,m,cm,mm,m,nm,1,m=10-6m,1,n,m=10-9m,1=10-10m,频率，单位：赫芝,(,周,)Hz,次,/,秒,n,折射率，真空中为,1,光的传播速度,:,波动性,X,磁场向量,传播方向,Y,Z,x,电场向量,h,普朗克,(,Planck,),常数,6.62610,-34,Js,频率,E,光量子具有的能量,单位：,J(,焦耳,),，,eV,(,电子伏特,),1eV=1.60210,19,J,微粒性,光量子，具有能量,。,结论,:,一定波长的光具有一定的能量，波长越,长,(,频率越低,),，光量子的能量越低,.,.,波粒二象性,真空中,:,(,单色光,),橙,白光,青兰,互补光,(,即复合光,:,由,2 or,多种单色光混合而成的混合光,),黄,绿,青,红 紫 兰,(,单色光,),只有一种波长的光,例,:I,0,KMnO,4,紫光,(,紫红色,),颜色,(i),物质,通过 透过,青色 互补,选择性吸收绿光,*全吸收 呈黑色 *不吸收 呈无色,单色光,：具有相同能量,(,相同波长,),的光,.,混合光,：具有不同能量,(,不同波长,),的光复合在一起,.,例如白光,/nm,颜色,互补光,400,450,紫,黄绿,450,480,蓝,黄,480,490,绿蓝,橙,490,500,蓝绿,红,500,560,绿,红紫,560,580,黄绿,紫,580,610,黄,蓝,610,650,橙,绿蓝,650,760,红,分子对光的吸收与吸收光谱,不同颜色的可见光波长及其互补光,蓝绿,为什么,KMnO,4,吸收绿光呢？,光吸收曲线（吸收光谱）,I,0,1,KMnO,4,I,0,2,2,I,0,3,3,A,A,C,KMnO,4,（定量）,浓度,max,绿青色光 紫红色,如稀释时,i,logI,0,/I=const,：令为,A,（吸光度）,如何定量呢？,光吸收曲线,：主要用于选定工作波长,无关,3,1,(,定性,),max,不变,光吸收定律（,LambertBeer,定律）,表达式,log,I,0,/,I,=A,=,k,1,b,（,、,C,、,T=const,时）,Lambert,定律,=,k,2,C,（,、,b,、,T=const,时）,Beer,定律,kbc,（,Lamber,-Beer,定律）,常数？,即：当一束平行单色光,通过均匀溶液时，,Sol,的,A,与,Sol,的浓度、,液层的厚度成正比。,吸光度与光程的关系,A,=,a,b,c,0.10,b,0.20,2b,0.00,光源,检测器,显示器,参,比,吸光度与浓度的关系,A,=,ab,c,0.10,c,0.20,2,c,0.00,光源,检测器,显示器,参,比,吸光度与波长的关系,A,=,a,bc,0.00,红,0.10,红,0.00,光源,检测器,显示器,参,比,蓝绿光,红光,c b k A=,kbc,g/L cm,a(Lg,cm )=,abc,mol/L cm,k(Lmol,cm )=,kbc,()(),-1,-1,-1,-1,灵敏度,正,灵敏度表示法：,灵敏度,10,4,高,10,6,超高,负,L.D.(,检出限,),s=M,（,g/mol,）,/k,（,g,/cm,）,k ,s,（桑德尔灵敏度）,即 指当仪器所能测出的,Amin,=0.001,时,单位面积光程内能检出的吸光物质的最低含量,a(,吸光系数,)k,（摩尔吸光系数）,k,值因,c,、,b,的单位而异，如,AT,（透光度）,I/I,0,=T T1 T%=T100,A=,I,0,/,I,=,I,/,I,0,=,T=1/T=1/T100%,=2,T%,=,kbc,AC,AC,正,负,定量分析,相关性还可用曲线表示：,A=a+,kc,LD=3S,b,/k(,斜率,),试剂空白,11,次平行测定值的标准偏差,S=,（,X,i,-,x,）,/,（,n-1,）,2,斜率,=,tg,截,距,吸光度,A,、,透射比,T,与浓度,c,的关系,A,T,(%),c,A,=,kbc,1.0,0.8,0.6,0.4,0.2,100,80,60,40,20,定律应用的前提条件,入射光不平行，,散射,前提条件：,sol,均匀、透明、非散射性,入一定的单色光,C=10,10,（,mol/L,）线性,否则 偏离,物理因素,化学因素,单色光不纯,（最主要因素）,导致,-,3,10,负偏离,10,正偏离,-,4,-,3,-,4,1.,入一定的单色光即应选用,max,处或肩峰处测定,.,2.,sol,均匀、透明、非散射性即,吸光质点形式不变,离解、络合、缔合会破坏线性关系,应控制条件,(,酸度、浓度、介质等,).,3.,C=10,10,（,mol/L,）,浓度增大，分子之间作用增强,.,-,3,-,4,平衡效应 如：,Cr,2,O,7,+H,2,O HCrO,4,2CrO,4,+2H,橙色 黄色,2,350nm 375nm,入,=25nm,偏离,酸效应 如,HB H +B,A,总,=A,HB,+A,B,=K,HB,C,HB,+K,B,C,B,K,B,=K,HB,（偏离可忽略）,K,HB,C,正偏离,C,负偏离,溶剂效应 极性,I,2,颜色 入,max,+C,2,H,5,OH,（,+,）红棕 小,+CCl,4,（,）紫 大,如,I,2,+,+,2,化学因素,必须指出，偏离是由仪器或分析实践所造成的，并非光吸收定律的缺陷。,Vis,光度分析是利用有色溶液进行，这就需要理想的星色反应体系及合适的分析条件。,影响显色反应的因素,设：,M +R MR,（显色反应）,O-H,反应,络合反应,待测组分 显色剂 有色物质,关键：,显色剂或显色反应的选择标准,1,选择性好 即,2.,灵敏度高 即,K(,),MR,大,3.,入（入,max-,入,max,）,60nm;,4.v,、,k,大，,MR,组成恒定,反应速率常数,5.,显色反应条件易控,标准,R+MMR,R+N(,干扰离子,)NR,MR,R,影响显色反应的因素,1.C,R,：应适宜，否则会引起副反应。,C,R,由,AC,R,曲线确定,2,pH:,如,M+R=MR,1,MR,2,OH,H,+,M(OH)HR,M R K,MR,A,MR,导致,pH=5,适宜,pH,3,t(min,):MR,形成,T(),颜色稳定,Amax,t,T,t,1,t,2,T,1,T,2,4,.,有机溶剂，表面活性剂,CTMAB PAM CPB(,溴化十六烷基吡啶,),SLS DBS,Triton-100 Tween-80,作用：,增敏，增溶，,增稳,5,共存离子,Er(5),产生,清除：调空,pH,，加掩蔽剂，沉淀剂等分离共存离子,除了上述因素将影响光度分析结果外，仪器测量误差也会影响测定的准确度。,仪器测量误差,来源：光源不稳，,A,T,标尺不准等,表示法：,一般控制：,T=15,70,Er,较小,A=0.15,0.80,即较准确,为获得准确的分析结果，必须选择测量条件。,测量条件：,（,1,）入：干扰,无 选用,max,有 按,A,最大，干扰最小的原则 入,（,2,）,A=0.15,0.80,如控制,W,s,.,试液的稀释或浓缩。,（,3,）校准,b,入，,A,，,T,标尺刻度等,（,4,）选择参比溶液：,试液 显色剂（,R,）其它试剂 参比溶液,蒸馏水或纯溶剂,+,试剂空白,(,即不加试液外其它溶液,),+,不加,R,的试液,有吸收 无吸收,例：在入测量处,选择,催化、抑制反应体系，均可选用水作为参比溶液。,吸光光度法的应用,单组分的测定,(1),工作曲线法,：,配制标准溶液系列：令,C,1,，,C,2,，,C,3,Er%:5%,以入,max,测其,A,A,1,，,A,2,，,A,3,减小,AC,曲线 工作曲线,测,A,x,由曲线平坦部分求,C,x,0.5%,可用差示光度法,*工作曲线不经过原点的原因,空白溶液选择和配制不当即用空白液不能使干扰物质的光吸收恰好抵消,显色反应和显色条件选择不当,b,与光学性能不一致,仪器波长刻度不准,T,的影响等等。,*工作曲线不直的原因,单色光不纯，导致,A,产生负误差,有色吸光质点，组成不恒定，因而引起颜色强度的变化，工作曲线弯曲,溶液有胶体形成，对光产生散射,溶液存在各种平衡效应（如缔合、离解、酸碱等）使,A,不正比于,C,(2),差示光度法（浓溶液差示光度法）,方法原理：参比溶液 标液,普通光度法：,C,0,C,2,差示光度法,C,1,C,2,代,替,C,2,C,1,C,1,C,2,调,T%=100%T%:T70 10100,A,1,=KbC,1,Ex:5 0.5 50.5,A,2,=KbC,2,即,Ex%,准确度,A,2,-A,1,=Kb(C,2,-C,1,),b,相同,(,同一种物质，同一比色皿,),A,K C (,方法原理,),应用：（,1,）工作曲线法：,A,C,（,2,）公式法：,C,X,=KA,X,+C,1,K=(C,1,-C,2,)/A,2,例：丁二酮肟,Ni,2+,且,A,2,=0.47,A,X,=0.52,求,Ni%,C,1,=6.12%,C,2,=11.49%,Ni%=,（,C,1,-C,2,）,/A,2,A,X,+C,1,Ni%=(11.49-6.12)/0.470.52+6.12=12.06%,多组分的测定,分析：入,1,M,1,A,M,入,1,(M+N),A,M+N,入,1,N,1,A,N,入,1,(M+N),A,N,(1).,联立方程法：入,1,入,2,M+N,(,待测,),入,1,入,2,M+N(,标液,),同 上,A,入,1,=A,M,入,1,+A,N,入,1,A,入,2,=A,M,入,2,+A,N,入,2,(2).,作图法：由,AC,曲线斜率求,C,M,，,C,N,络合物组成的测定：,(1),摩尔比法（适用于,小，,n,高的络合物）,:,离解度,n,；络合比,(2),等摩尔连续变化法（适用于,a,低，稳定性高的络合物）,A,1,A,2,C,R,/C,M,A,1,A,2,const,即,A,为,pH,相对应的,溶液,的吸光度,pKa,=,pH+,lg(A,A,B,-,)/(A,HB,A),测定中的干扰以及消除方法,Co,2+,Fe,3+,Co,2+,FeF,6,3-,Co(SCN),2,(,蓝,),NaF,SCN,Co,2+,Fe,2+,Sn,4+,(2)Sn,2+,Co(SCN),2,SCN,测,Co,2,:,(,掩蔽法,),1.,化学法,Co,2+,Zn,2+,Ni,2+,Fe,2+,CoR,ZnR,NiR,FeR,CoR,Zn,2+,Ni,2+,Fe,2+,钴试剂,R,H,+,测,Co,2,:,(,生成络合物性质不同,),消除干扰，也可采取分离法。,Fe,3+,Cu,2+,FeSSal,（,紫红）,Cu,2+,pH=2.5,SSal,测,Fe,3,:,(,控制,pH),2.,物理法,选择适当的测定波长,515,655,415,500,钍,-,偶氮砷,III,钴,-,亚硝基红盐,A,A,络合物,络合物,试剂,试剂,/nm,/nm,1.,仅络合物有吸收，,溶剂,作参比。,如,phen,Fe,2+,标准曲线,2.,待测液也有吸收,，,被测液,作参比。,如 测汽水中的,Fe,3.,显色剂或其他试剂也有吸收，,空白溶液,作参比,例,:,邻二氮菲光度法测,Li,2,CO,3,中的,Fe,，,参比溶液为不含,Li,2,CO,3,样品的所有试剂,。,4.,干扰组分与显色剂有反应,又无法掩蔽消除时：,1,）,掩蔽被测组分,，再加入显色剂，作参比,.,2,）,加入等量干扰组分,到空白溶液中,作参比,.,3.,选择适当的参比溶液,10 2,光度分析的方法和仪器,方便、灵敏，准确度差,.,常用于限界分析,.,10.2.1,光度分析的几种方法,1.,目视比色法,观察方向,空白,c,1,c,2,c,3,c,4,2.,光电比色法,光电比色计结构示意图,通过滤光片得一窄范围的光,(,几十,nm),滤光片,吸收滤光片,：只允许指定的窄范围波长光通过，其他波长的光均被吸收,.,选择滤光片的原则：,滤光片透光率最大的光是溶液吸收最大的光,即滤光片的颜色与有色溶液的颜色互补,.,3.,吸光光度法和分光光度计,光源,单色器,吸收池,检测系统,分光光度计的基本组成,通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光,.,波长可调,故选择性好,准确度高,.,分光光度计的主要部件,光源：,发出所需波长范围内的连续光谱，有足够 的光强度,稳定。,可见光区：,钨灯，碘钨灯,(320,2500nm),紫外区：,氢灯，氘灯,(180,375nm),氙灯,：,紫外、可见光区,均可用作光源,/nm,钨灯（,热辐射光源,）,400,600,800,1000,氙灯,（,气体放电光源,）,氢灯,强度,氙灯,氢灯,钨灯,单色器：,将光源发出的连续光谱分解为单色光的 装置。,棱镜：,依据不同波长光通过棱镜时折射率不同,.,玻璃,350,3200nm,石英,185,4000 nm,入射狭缝,准直透镜,棱镜,聚焦透镜,出射狭缝,白光,红,紫,1,2,800,600,500,400,光栅：,在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的,等宽度等间距,条痕,(600,、,1200,、,2400,条,/mm),。,利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。,波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便,.,平面透射光栅,反射光栅（广泛使用）,光栅衍射示意图,M,1,M,2,出射狭缝,光屏,透镜,平面透射光栅,吸收池,(,比色皿,),：用于盛待测及参比溶液。,可见光区：光学玻璃池,紫外区：石英池,检流计,（指示器）：,低档仪器：刻度显示,中高档仪器：数字显示，自动扫描记录,检测器,：利用光电效应，将光能转换成,电流讯号。,光电池，光电管，光电倍增管,硒光电池（,Barrier-layer photocell,）,适用于,300-800 nm,在,500-600 nm,范围最灵敏。,Se,阴极,Au,，,Ag,半导体,h,阳极,光电管,(,Phototube,),h,（片）,红敏管,625-1000 nm,蓝敏管,200-625 nm,光电倍增管,(,Photomultiplier Tube,PMT,),1,个,光子可产生,10,6,10,7,个电子,160-700 nm,4.,吸光光度法仪器主要差异比较,可见光,（,380,780nm,）,紫外光,（,200,380nm),中红外,（,2.5,50,m,),光源,钨灯,碘钨灯,320,2500,氢灯,氘灯,180,375,硅碳棒,（红外线）,吸收池,材料,玻璃,（,350,3200,）,石英,（,185,4000,）,NaCl,晶体,5.1.,单光束分光光度计,可变波长单光束紫外,-,可见分光光度计示意图,5.,分光光度计的基本类型,5.2.,双光束分光光度计,参比池,检测器,滤光片或,单色器,放大器,样品池,光源,h,v,光子检测器,反光镜,反光镜,透明部分,扇形镜,正面图,扇形镜,反光镜,栅镜,双光束型可以消除光源强度变化的影响,.,Vis.UV,Vis.IR,单,(,双,),光束,双波长光路图,I,1,I,2,A=A,入,2,A,入,1=,lg,I1/I2=,(k,入,2,k,入,1),bc,(,与背景吸收无关,),5.3.HP 8452A,多通道二极管阵列分光光度计,镀铝反射镜,5.4.,纤维光度计示意图,5.5.,纤维光度计,作业,:P301 17 19 24,1.,光学光谱区,远紫外,近紫外,可见,近红外,中红外,远红外,（真空紫外）,10nm,200nm,200nm,380nm,380nm,780nm,780 nm,2.5,m,2.5,m,50,m,50,m,300,m,参考资料,2.,光谱种类,原子光谱：吸收、发射、荧光,线状光谱,黑体辐射：白炽灯、液、固灼热发光,连续光谱,分子光谱：紫外、可见、红外等吸收光谱,带状光谱,I,3.,分子吸光与发光,4.,发光机理,(,Jablonski,Diagram),例,1,蒽的激发光谱（吸收光谱）和,发射光谱（荧光光谱）,5.,镁,-,Oxine,的激发光谱和发射光谱,荧光分析法测定血清中的镁,6.,荧光光谱的特点,Stokes,位移：分子荧光的发射峰相对于吸收峰位移到较长的波长,.,荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关,.,镜像规则：荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系,.,7.,磷光分析法,获得较强磷光应采取的措施：,1.,低温，,禁阻跃迁,几率小,;,系间窜跃,寿命长,.,S,1,T,1,S,0,无辐射,辐射,磷光分析仪器,液槽：,石英液槽放入盛液氮的石英杜瓦瓶,.,斩波片：,在激发光单色器与液槽之间以及在发射光,单色器与液槽之间各装一个斩波片,.,应用,：,主要用于有机分析,与荧光法互补,.,室温,2.,固体磷光，吸附在滤纸或纤维素上,.,3.,加表面活性剂,形成胶束缔合物,增强刚性,.,4.,重原子效应,(Ag,+,Pb,2+,Tl,+,盐类,),利于系间跨越,.,例,1 Solid-substrate room-temperature phosphorescence immunoassay based,on an antibody labeled with,nanoparticles,containing,dibromofluorescein,luminescent molecules and analytical application,D-SiO2(20 nm),Fig.2 SS-RTP spectrum and three-dimensional,spectra of SiO2 and D-SiO2,nanoparticle,1.1:SiO2;2.2:D-SiO2;,Jia,-Ming,Liua,Qiao-mei,Lua,Yan,Wanga,Shan-,shan,Xua,Xiao-,mei,Lina,Long-,Di,Lib,Shao-QinLin,.,Journal of Immunological Methods,2005,307,34-40,Phosphorescence spectrum of immune complex,The SS-RTP spectrum of the immune complex(Ab1-IgG-Ab1-D-SiO2)on the polyamide membrane was scanned and compared with that of,reagent blank(D-SiO2-Ab1)(Fig.3).Results showed that the phosphorescence intensity of Ab1-IgG-Ab1-D-SiO2 was obviously higher than that of D-SiO2-Ab1.Meanwhile,the,exmax/emmax,were 451/622 nm and 460/623 nm,respectively,.So 460/623 nm was chosen as working wavelength.,Fig.3 RTP spectra of Ab1-IgG-,Ab1-D-SiO2,1.1.Polyamide membrane,2.2.Ab1,3.3.Ab1+20.0(pg spot,1),IgG,4.4.D-SiO2,5.5.Ab1-D-SiO2+Ab1,6.6 Ab1+20.0(pg spot,1),IgG,+D-SiO2-Ab1,Working curve,detection limit and precision,Human,IgG,was determined by use of the antibody labeled with D-SiO2,nanoparticle,.The results showed that there was a linear correlation,between Ip and the concentration of,IgG,(Fig.4)within the,concentr,ation,range 0.0624-20.0 pg spot,1(corresponding to a concentration,of 0.156-50.0,ng,l,1,sample volume:0.4l spot,1).The regression,equations of the working curves can be expressed as Ip=94.39+17.00m,IgG,(pg spot,1),n=6,r=0.9996.The detection limit calculated as 3Sb/k,is 0.015 pg spot,1(or 0.038,ng,l,1).If the molecular weight of,IgG,is taken,as 150000 11,the detection limit is 0.10,amol,spot,1.After replicate,measurement 11 times,RSD are 3.2%and 2.4%for samples containing,0.156,ng,l,1 and 50.0,ng,l,1,IgG,respectively.This indicates that,the method is of good repeatability.,The mechanism discussion of SS-RTP-IA based on an antibody labeled with,nanoparticles,containing,dibromofluorescein,luminescent molecules,