第五章目的基因的获取.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章 目的基因的获取,化学合成法,PCR,技术,筛选基因文库,转座子标签法,mRNA,差别显示技术,生物信息技术分离和鉴定,酵母双杂交系统分离,目的基因的获取：,（一）化学合成法的单元操作,从反应机理上分为：,磷酸二酯法、磷酸,三酯法、,亚磷酸三酯法,、,自动化合成法,操作过程：,液相合成 固相合成,一、化学合成法,将所要合成的,寡核苷酸链的,3,末端先以,3,-,OH,与一个不溶性载体,，如多孔玻璃珠、二氧化硅等连接，然后依次从,3,-5,的方向,将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的,活性官能团都是经过保护的,，其中,5,-,OH,用,二甲氧基三苯甲基,（,DMT）,保护，,3,-,端的二丙基亚磷酸酰上的磷酸的,OH,，,用,甲基或氰乙基,保护。,固相亚磷酸三酯法原理：,亚磷酸三酯法合成过程,DMT:,二甲氧基三苯甲基,酸（三氯乙酸）洗柱子,1,核苷酸连柱子,1,核苷酸的保护,磷氧原子保护基团：,氰乙基,激活：,氨基亚磷酸化合物,亚磷酸三酯,2,核苷酸活化,缩合反应,氰乙基,二异丙基亚磷酸酰,二异丙胺,四氮唑活化剂,氧化,:,碘,氧化反应,35磷酸二酯键,引物、接头、探针等,1,、小片段粘接法：,根据,目的基因,全序列，分别合成,12-15,碱基长的,单链,DNA,小片段,（二）基因组装战略：,预先设计合成的,片段之间都有互补区域,，不同片段之,间的互补区域能形成有断点的完整双链。,粘性末端,2,、补丁延长法：,根据,目的基因,两条互补链全序列，分别合成,12-15,碱基长的单链,DNA,小片段,以及,20-30,碱基长的,单链,DNA,中片段,预先设计合成的,短片段与长片段的某段序列互补。,3,、大片段酶促法：,根据,目的基因,的全序列，分别合成,40-50,碱,基长的,单链,DNA,片段,预先设计的,片段之间,有,局部互补区,，可以相互作,为另一个片段延长的引物。,（三）,DNA,化学合成的用途,合成天然基因,:,胰岛素基因、干扰素等；,有些基因比较短，化学合成费用较低。,修饰改造基因，设计新型基因,。“人造儿”,2010,，5.20，,美国64岁科学家 10年耗资4000万美元 用电脑进行基因设计改造后，用化学方法合成基因后导入到支原体细菌，,DNA,象正常细菌的基因一样进行复制人造生命诞生。,制备探针、引物、接头,定点突变合成,：,合成带有,定点突变,的基因片断。,二、,PCR,技术获得目的基因,反转录,PCR,：,RT-PCR,，以,mRNA,逆转录合成的,cDNA,第一条链为模板的,PCR,。,引物：基因边码区引物，,oligo,（,dT,）,12-18，,氨基酸序列设计特异引物：简并引物,反向,PCR,：,根据已知,DNA,区的序列设计引物，以包含,已知区和未知区,的环化,DNA,分子为模板来扩增未知,DNA,区序列的,PCR,技术。,template,template,3,5,3,5,三、筛选基因文库,(,gene library,),基因库（gene pool）：,特定生物体全基因组的,集合,（天然存在）,。每个种群都具有其独特的基因库。,基因文库（gene library or gene bank,）,通过克隆的方法将某一,基因组DNA,或,mRNA,保存于适当,宿主菌,中形成的,转化子群,。所有,重,组,DNA,组合,代表该,基因组的全序列。,基因组文库和,cDNA,文库,根据构建方法的不同，基因文库分为：,（一）基因文库的容量和完备性,在构建的基因文库中任一,基,因存在的概率,，它与基因文库,最低所含克隆数,N,之间的关系可用下式表示：,N=,ln,（,1-P,）,/,ln,（,1-f,）,P=,任一基因被克隆（存在于基因文库中）的概率,f=,克隆片段的平均大小,/,生物基因组的大小,影响因素：,基因组大小、目的基因在基因组中的拷贝数、克隆载体的容量及目的基因的大小。,例：人的单倍体,DNA,总长为,2.9,10,9,bp,，基因文,库中克隆片段的平均大小为,15kb,，则构建一个完备性为,0.9,的基因文库至少需要,45,万个,克隆；而当完备性提高到,0.9999,时，基因文库至少需要,180,万,个克隆。,基因文库的完备性,:,在构建的基因文库中任一基因存在的概率,。,完备性越高，文库容量越大。,（二）理想基因文库条件,1,、完备性高,，筛选任一基因的概率均应为99%,2,、重组克隆的,总数,不宜过大,3,、载体的,装载量,最好大于基因的长度,4,、克隆与克隆之间必须存在足够长度的,重叠,区域,5,、,克隆片段,易于从载体分子上,完整,卸下,6,、重组克隆能稳定保存、扩增、筛选,（三）基因组文库的构建程序,基因组文库：,包含,某种生物,基因,组,全部遗传信息,的,一系列,DNA,片段,，通过,克隆载体,贮存在一种,受体菌,的群体中，这个群体称为这种生物的基因组文库。,文库中所有克隆所携带的,DNA,片段重新组合起来可以覆盖该生物的整个基因组。,（四）基因组文库的构建程序,1,、基因组,DNA,的制备和切割,（,保证,DNA,片段之间存在部分重叠,；,DNA,片段大小均一,）,超声波处理 限制性内切酶,部分,酶切,2、载体和受体的选择,基因组文库：,-DNA或考斯质粒，,大型基因组使用YAC或BAC,cDNA文库构建载体：,质粒,受体：,大肠杆菌或酵母菌,3,、,DNA,片段和载体的相连,直接连接、人工接头或同聚物加尾。,把培养皿上的细菌全部洗下加以保存。,4、重组体转化宿主细胞，构建形成了基因组文库的初库（primary bank）,5、初库扩增形成终库,（五）,cDNA,文库的构建,某,生物,mRNA,反转录产生,cDNA,片段,分别与,合适的,克隆载体,相连，通过转化贮存在一种,受体菌的群体之中，把这种包含某生物基因,组,全部基因,cDNA,的受体菌群体称为该生物,cDNA,文库。,cDNA,文库的特点,（,1,）,不含内含子序列。,（,2,）可以在细菌中直接表达。,（,3,）包含了所有,编码蛋白质的基因,。,（,4,）比,DNA,文库小,的多，容易构建。,cDNA,文库,制备及筛选策略,1,、总,RNA,的提取,方法：,1,）提取总核酸，用,氯化锂,将,RNA,沉淀；,2,）,异硫氰酸胍,一步法,3,）改良的,CTAB,(,十六烷基三甲基溴化胺,),法提取总,RNA,。,4),提取总,RNA,用商业化的试剂盒（,kit,）,Trizol,原理：直接在,酸性条件,下抽提，酸性下,DNA,与蛋白质,进入,有机相,而,RNA,留在,水相,。,2,、,mRNA,的纯化,（,1,）,Oligo,(,dT,),纤维素亲和层析法,总,RNA,高盐缓冲液,上柱，带有,poly,（,A,）,尾巴的,mRNA,与柱子中的,oligo,（,dT,）,结合，然后用,中盐,洗柱，去除,rRNA,和,tRNA,。,蒸馏水或低盐,冲洗柱子获得,mRNA,。,商业化的,Oligo dT,纤维柱。,mRNA,只占总,RNA,的,1%-2%,（,2,）磁珠法纯化,mRNA,利用总,RNA,纯化试剂盒获得,总,RNA,，加入,PolyAT mRNA,分离系统。,生物素标记,的,dT,引物,与,总,RNA,温育,，利用强磁场吸附,抗生物素蛋白微磁球,，从而吸附了通过,AT,配对的杂交体,mRNA,。,PolyAT,tract,mRNA,的分离纯化过程,磁性分离架分离,3,、,cDNA,的合成,cDNA,第一链的合成,Oligo,(,dT,),12-18,cDNA,第二链的合成,自身引导法：获得的,DNA,双链,5,端有碱基缺失,置换合成法：获得的双链,cDNA,5,端也有几,对碱基缺失,但一般不影响编码区的完整,.,大肠杆菌 DNA 聚合酶,引导合成法：获得的双链,cDNA,能保留完整的,5,端序列,但操作比较复杂，,Poly（,dC,）/（,dA,），,对重组子的复制和测序不利。,4,、双链,cDNA,的克隆,平头末端直接与载体连接,平头两端分别接,同聚物尾,：最好是,AT,同聚物,尾，重组子可以通过加热,局部变性,和,S1,核酸酶,处,理回收插入片段,.,加装,人工接头或衔接物,引入酶切口：方便插入片段回收,平头,cDNA,可以使用下列三种方法克隆入载体：,（六）从基因组文库中筛选目的基因,探针杂交 阳性克隆 质粒提取纯化、酶切,探针：目的基因局部片段、由氨基酸序列获得的简并序列、近缘物种的同源序列,四、转座子标签法获得目的基因,（一）转座子的相关知识,转座子（,transposon,Tn,）,:,指,位于染色体上可以,从,基因,组的,一个位置转移,到,另一个位置,的,DNA,片段或基因。（,jumping gene,）,简单转座子,：除,转座所需基因,外不携带任何,标记基因的转座因子。,IS,复合转座子,：除,转座所需基因,外还,携带某种,标记基因,的转座因子。Tn,A,family,复制转座：,在转座期间先,复制一份拷贝,，而,后拷贝转座到,新的位置，,原位置仍保留原转座,因子。,非复制转座：,直接从原来位置上转座插入新,的位置，并留在插入位置上作用。,反转座子（反转录转座子）,：,通过转录合成,mRNA,，再逆转录合成新的,DNA,元件整合到基因组中完成转座。,（）,Ac,自主性因子：,有自主剪接和转座的功能,Ds,非自主性因子：,独立存在稳定，需要同一族,自主性因,子提供,转座酶,才有转座功能。,自主因子、非自主因子,:,玉米转座子,Ac/Ds,体系,（）,Ac-Ds,体系：控制色素基因,C,的表达。,C,基因：,位于第九染色体上，控制紫色。,Ds,插入,C,基因,：,C,基因失活，玉米不呈紫色。,Ac,：,某种程度上激活,Ds,，使,Ds,跳到别的位置，则,C,基因还原，出现紫色玉米。,玉米花斑的控制,在,Ac,存在的情况下，,Ds,不断跳跃，致使它所控制的颜色基因时开时闭，从而表现为玉米籽粒上的斑斑点点。,（二）转座子标签法,（,transposon,tagging,）,将,转座子,插入到欲克隆,基因的内部或附近,，使得,目的基因发生突变,，然后利用转座子,DNA,为探针,筛选突变株的基因组文库，钓出含有转座子的,DNA,片段,。然后再用筛选到的阳性克隆中,目的基因片段,为探针，筛选,野生型生物基因文库,分离目的基因。,转座子标签法获得目的基因流程,目的标签法、非目的标签法,五、图位克隆（,mapbased,cloning,）获 得目的基因,图位克隆：又叫定位克隆，,1986,年首先由剑桥大学的,Alancoulson,提出。,根据,目的基因在染色体上的位置,进行分离基因，无需预先知道基因的,DNA,顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息。,染色体步移（,Chromosome Walking,）,利用与,目的基因紧密连锁的分子标记,DNA,片段为探针筛选基因组文库,，用已获得的阳性克隆,DNA,的末端片段,为探针继续筛选，直到获得含,目的基因两侧序列,为止。,1),用遗传作图将目标基因定位在染色体的特定位置,;,2),找到与目标基因紧密连锁的分子标记,;,3),构建含有大插入片段的基因组文库,(,库或,);,4),以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库,;,5),用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群,;,6),通过染色体步行获得含有目标基因的大片段克隆,;,7),通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆,;,染色体步移,的,基本过程,以一系列,头尾相互重叠探针筛库,，,类似于从,分子标记序列开始通过一系列相互重叠的克,隆向目标基因的“行走”，故称为染色体步移,。,六、,mRNA,差别显示技术（,mRNA,differential display,）获得差异表达的基因,mRNA,差别显示技术：对,组织特异性,或,诱导专一性表达基因,进行分离的有效方,法之一。将,mRNA,逆转录,和,PCR,技术,相,互结合发展起来的一种,RNA,指纹图谱技,术，也称为,DDRT-PCR,，,DDRT-PCR,理论基础,（,1,）,3,端的锚定引物,Oligo,(,dT,),引物的,3,端加两个核苷酸,（倒数第二个不再是,T,）。,AAAAAAAAAAAAAAAA,mRNA,3,TTTTTTTT,5,5,N,M,M,：,A,、,G or C,N:A,、,G,、,T or C,3,12,种锚定引物,（,3,）,5,端的随机引物,20,种,10 mer,AAAAAAAAAAAAAAAA,mRNA,3,5,NM,TTTTTTTT,5,3,扩增,cDNA,第一链。,RT,NM,TTTTTTTT,5,cDNA,3,NNNNNNNNNN,5,3,NNNNNNNNNN,5,3,cDNA,第二链，并,PCR,（,4,）随机引物与锚定引物成对扩增,12,种锚定引物，与,20,种随机引物，可组成,240,组引物。,引物组合：,实验结果：,如果每条带相当于,一种特定,mRNA,，,20000,mRNA,基本上反映了一种特定细胞中全部的,mRNA,。,240,组在能分出,20000,多条带！,DDRT-PCR,操作步骤,*差异分离目的基因程序,利用,两组细胞,mRNA,经过,DDRT-PCR,后，分析比较,cDNA,种类的差异，分别回收,cDNA,测序分析。用此,DNA,片段为探针筛选,cDNA,文库获得全长的,cDNA,基因。较适用,于分离克隆新基因。,随机,-,锚定引物,PCR,的产物电泳比较,不同组织的,240,组引物组合,PCR,产物在测序胶中电泳。,选择有,差异的带,，,制备探针,，筛选,cDNA,文库，,找到差别基因的全长序列。,减法杂交,(subtractive hybridization,),原理：从表达,目的基因,的组织提取,mRNA,所转录为,cDNA,，然后与,无目的基,因表达,的组织提取的,mRNA,做过量杂交，,在,两组织,中均,表达,的基因产物形成,cDNA,/,mRNA,双链杂交分子,，而,特异,mRNA,反转录的,cDNA,仍保持单链状态，将,这种,单链,cDNA,分离出来即为差异表达的序列。,七、酵母双杂交系统（,two-hybrid system,）分离目的基因,有效地分离能与一种,已知的,诱饵蛋白,相互作用的蛋白质,.,许多真核生物的,转录激活因子,都是由两个在,结构上可以分开,的、,功能上也相互独立,的,结构域,组成。,1.,结构域（,Domain,）合作,（一）、,酵母双杂交系统,的原理,例如：,啤酒酵母的,半乳糖苷酶,基因激活因子,GAL4:,DNA binding domain,Active domain,N,C,1-147aa,768-881aa,上游激活序列（,UAS,）,转录激活,GAL4,效应基因,结合,结合,激活转录,实验发现：,转录表达,只要,DNA binding domain,（,DNA-BD,）,与,Active domain,（,AD,）靠近就能激活转录。,2.,拆开,Domain,DNA binding domain,Active domain,上游激活序列（,UAS,）,转录激活,GAL4,效应基因,结合,用重组,DNA,技术把,GAL4,的两个,Domain,分开，就,丧失,了激活效应基因的能力。,不能转录,3.,重组,Domain,用重组,DNA,技术把这两个,Domain,分别与两个不同的多肽连接。,Active domain,蛋白,A,蛋白,B,DNA binding domain,在体内，蛋白,A,与蛋白,B,是否能结合。,4.,观察报告基因表达,GAL4,的,DB domain,与,AD Domain,也不能靠近，,所以仍然不能启动效应基因的转录。,（,1,）如果蛋白,A,与蛋白,B,不能相互结合,（,2,）如果蛋白,A,与蛋白,B,能相互结合,上游激活序列（,UAS,）,转录激活,GAL4,效应基因,蛋白,A,DNA binding domain,转录激活,domain,蛋白,B,激活转录,转录表达,X,基因,和,Y,基因,产物的相互结合，导致,reporter gene,表达。,Reporter gene,表达就说明,X,基因产物,与,Y,基因产物,能结合。,双杂交原理,重组质粒构建过程,构建好的两质粒载体,Trp,-,Leu,报告基因表达情况,构建的质粒转到酵母均株中，根据筛选标记获得阳性植株,八、生物信息技术分离和鉴定目的基因,1,、利用,EST,数据库发现新基因,EST,：,基因表达的短的,cDNA,序列，包含基,因编码区的部分信息，,称为表达序列标签。,利用,EST,数据库发现新基因也被称为基因,的,电脑克隆,。,GenBank,的,EST,数据库中已收集了,EST,序,列,2,020,608,条,.,2000,年，,夏家辉用,EST,方法发现了神经性耳,聋基因,.,2,、通过蛋白家族的保守性分离目的基因,(1),利用序列,同源性比较,软件,(,如,B1ast,软件,),将待进行延伸的序列,(,以下简称种子序列,),对库检索；,(2),从数据库中,挑选,出全部,相关序列,；,(3),对所有序列进行片段,整合分析,(,即,Contig,分析,),，,形成延伸后的序列,(,简称新生序列,),。随后，此新生序列作为种子序列重复进行上述三步过程，直至新生序列不能够被进一步延伸为止。,作业：,1,、说明获取目的基因方法的选择策略。,2,、酵母双杂交分离获得目的基因的原理与过程？,3,、详细介绍两种获得差异表达基因的方,4.,什么是基因组文库(genomic library)?构建基,因组文库，涉及哪些基本过程?,5,.,什么是cDNA文(complementDNAlibrary)?,