蛋白质2-2.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1.,血浆氨基酸及其代谢紊乱,第三章 血浆蛋白质及,非蛋白含氮化合物的代谢紊乱,2.,核酸及核苷酸的代谢紊乱,主要内容,3.,蛋白质、氨基酸的检测方法与评价,1.,概述：氨基酸（,amino acid,，,AA,）,氨基酸的主要功能：,参与构成蛋白质,生成多种活性物质,参与细胞信息传递,氧化分解提供能量,第二节 氨基酸代谢紊乱,氨基酸的正常代谢：,氨基酸代谢库的来源、去路,氨基酸的一般代谢：脱氨基和脱羧基,氨基酸的个别代谢：一碳单位代谢,氨基酸代谢库的来源、去路,氨基酸的代谢紊乱：,原发性：由酶或其他蛋白因子缺乏而引起的遗传性疾病。,继发性：肝脏、肾脏等功能障碍导致的氨基酸代谢紊乱。,氨基酸遗传病：,种类很多，为相关基因突变所致，至今已发现,70,余种，多数是缺乏某种酶引起，也有因缺乏某种载体蛋白而致肾脏或肠道吸收,AA,障碍。,氨基酸遗传病,氨基酸血症与氨基酸尿症：,当,酶,缺陷出现在代谢途径的起点时，其催化的氨基酸将在血循环中增加，成为氨基酸血症（,Aminoacidemia,）。这种氨基酸会从尿中排出，称为氨基酸尿症（,Aminoaciduria,）,当酶的缺陷出现在代谢途径的中间时，则此酶催化反应前的中间代谢产物在体内堆积，使其血浓度增加，也会从尿中排出。,肾小管重吸收,氨基酸代谢障碍示意图,氨基酸,终产物,中间产物,由于正常降解途径受阻，氨基酸通过另外的途径代谢，此时血和尿中可能出现这一途径的产物。,由肾近曲小管上皮细胞氨基酸吸收有关的载体转运蛋白缺乏导致。,常见氨基酸遗传病的发病机制和体液检测结果,疾病名称 缺乏的酶 血中增高的成分 尿液中增高的成分,苯病酮酸尿症,苯丙氨酸羟化酶 苯丙氨酸 苯丙酮酸 苯丙氨酸 苯丙酮酸,I,型酪氨酸血症,乙酰乙酸水解酶 酪氨酸 蛋氨酸 酪氨酸 苯丙酮酸,尿黑酸尿症,尿黑酸氧化酶 尿黑酸（轻度）尿黑酸,同型胱氨酸尿症,胱硫醚合成酶 蛋氨酸 同型胱氨酸 同型胱氨酸,组氨酸血症,组氨酸酶 组、丙、苏、丝 组、丙、苏、丝,甘氨酸血症,甘氨酸氧化酶 甘氨酸 甘氨酸,精氨酸血症,精,氨酸酶 精氨酸 胱氨酸、精氨酸,I,型高脯氨酸血症,脯氨酸氧化酶 脯氨酸 脯氨酸、羟脯氨酸,胱氨酸尿症,肾小管碱性载体,胱、精、赖、鸟,二羧基氨基酸尿症,肾小管酸性载体,谷氨酸、天冬氨酸,亚氨基甘氨酸尿症,亚氨基酸载体,脯、羟脯、甘,苯丙酮酸尿症（,phenyl,ketonuria,，,PKU,）,是主要由,苯丙氨酸羟化酶,缺乏引起的常染色体隐性遗传病。,一、苯丙酮酸尿症,苯丙氨酸,苯丙酮酸,苯乳酸,苯乳酸,苯乙酰谷氨酰酸,转氨酶,还原酶,氧化脱羧酶,谷氨酰胺,NADH+H,+,NADH+H,+,NAD,+,苯丙氨酸的代谢途径,酪氨酸,苯丙氨酸羟化酶,四氢蝶呤,NADPH+H,+,CH NH,2,CH,2,CH,CH,2,CH NH,2,CH,2,COOH,COOH,COOH,=O,OH,酪氨酸,苯丙氨酸,苯丙酮酸,苯丙氨酸的正常代谢,二氢蝶呤,二氢蝶呤还原酶,苯丙氨酸的代谢紊乱,1.,苯丙氨酸羟化酶（,phenylalanine,hydroxylase,PHA,）缺乏或不足,2.,二氢蝶呤还原酶缺乏或不足,PKU,的临床表现,1.,智力缺陷：其严重程度与苯丙氨酸升高的水平和持续时间有关，可能由于,苯丙氨酸与其他氨基酸竞争载体,，干扰了其他氨基酸通过血,-,脑屏障，因氨基酸不平衡而影响了脑正常功能和发育。,2.,毛发和皮肤色素变浅：这是因为,苯丙氨酸竞争性抑制了酪氨酸酶,活性，使黑色素生成减少所致,。,PKU,的治疗,1.,低苯丙氨酸膳食：,3,个月,-10,岁，甚至终生治疗。妊娠期继续治疗,2.,高酪氨酸膳食：补充酪氨酸的不足,。,酪氨酸是合成蛋白质的基本成分，并且是甲状腺激素和儿茶酚胺的前体。,二、酪氨酸血症,对羟苯丙酮酸,氧化酶,尿黑酸,酪氨酸的代谢途径,酪氨酸,酪氨酸羟化酶,CH NH,2,CH,2,COOH,OH,酪氨酸的正常代谢,T,3,、,T,4,碘化,CH NH,2,CH,2,OH,OH,COOH,dopa,CH NH,2,CH,2,OH,OH,CH,2,NH,2,CH,2,OH,OH,OH,多巴胺,去甲肾上腺素,酪氨酸转氨酶,苹果酰乙酰乙酸,延胡索酸,+,乙酰乙酸,苹果酰乙酰乙酸,氧化酶,黑色素,酪氨酸酶,（一）酪氨酸的正常分解代谢和转变,1.,主要代谢途径是转氨基成酮后代谢,2.,转变成儿茶酚胺激素和黑色素 酪氨酸先转变为多巴，然后生成肾上腺素和去甲肾上腺素,3.,在皮肤黑色素细胞中酪氨酸酶催化下，酪氨酸羟化生成多巴，再转变为黑色素。,如果酪氨酸酶（,tyrosinase,）,缺乏，酪氨酸不能转变为黑色素，将导致白化病（,albinism,）,发病率约,1/13000,，患者表现为白色头发、浅色皮肤和灰蓝色眼睛等。,（二）,I,型酪氨酸血症,I,型酪氨酸血症（,tyrosinemia,I,）,是由于,延胡索酰乙酰乙酸酶,活性降低所致，另外，,对,-,羟苯丙酮酸氧化酶,活性也有下降,。,I,型酪氨酸血症又称肝肾型酪氨酸血症，因为病人有严重的肝功能损害和肾小管功能不良。,Fancoin,综合征,患者，为近端肾小管复合性功能缺陷性疾病，临床上有肾性糖尿、磷酸盐尿、尿酸盐尿、碳酸盐尿、肾小管性酸中毒，以及全氨基酸尿；这种疾病有时会并发肝肾型酪氨酸血症的特异性氨基酸尿。,I,型酪氨酸血症发病率约为,1/10,万，用低酪氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸膳食可减轻症状。,（三）,型酪氨酸血症,（,tyrosinemia,）,是由于肝脏胞浆酪氨酸转氨酶缺乏所致，血液酪氨酸水平增高，并从尿中排出。该症患者有流泪、惧光、角膜浑浊、皮肤过度老化、智力发育不全等症状。本病罕见。,含硫氨基酸包括甲硫氨酸、半胱氨酸和胱氨酸，胱氨酸是两个半胱氨酸脱氢后以二硫键结合形成，蛋白质中的半胱氨酸有不少以胱氨酸形式存在。,三、含硫氨基酸代谢紊乱,（一）含硫氨基酸的正常代谢,COOH,CH NH,2,CH,3,-SCH,2,-CH,2,COOH,CH NH,2,SH-CH,2,COOH,CH NH,2,SH-CH,2,-CH,2,甲硫氨酸,半胱氨酸,同型半胱氨酸,甲硫氨酸,S-,腺苷甲硫氨酸,同型半胱氨酸,ATP,S-,腺苷同型半胱氨酸,甲基,N,5,-CH,3,-FH,4,转甲基酶,甲硫氨酸循环,（二）同型半胱氨酸代谢紊乱,1.,同型半胱氨酸与心血管疾病,血液同型半胱氨酸增加时，心血管疾病的危险性也增加，可能与以下因素有关。,（,1,）同型半胱氨酸内脂化合物形成：引起血小板聚集、血凝块和泡沫细胞形成,（,2,）同型半胱氨酸氧化：形成自由基,2.,同型胱酸尿症,根据同型半胱氨酸代谢紊乱的不同，同型胱氨酸尿症由以下几种原因引起。,（,1,）胱硫醚,-,-,合成酶缺乏：,（,2,）甲硫氨酸合成缺乏,（,3,）食物营养缺乏,继发性高氨基酸血症或氨基酸尿症主要发生在肝脏和肾脏疾患以及烧伤等，其氨基酸异常是该类患者机体物质代谢普遍异常的一部分，体液氨基酸测定对诊治有参考意义。,四、继发性氨基酸代谢紊乱,（一）肝功能衰竭和氨基酸代谢失衡,肝功能衰竭时有明显的氨基酸代谢紊乱，,AAA,在肝脏中降解减少，引起血浆,AAA,浓度增高。,BCAA,在肌肉中正常降解或加快。导致,BCAA/AAA,比由正常的,3.53,0.61,开始下降！慢性肝病可降至,2,，心功能衰竭低于,1.8,，肝性脑病小于,1,。,（二）肾脏疾病,肾功能衰竭常有蛋白质营养紊乱，表现为血清中必须氨基酸浓度降低，静脉补充氨基酸后，可使氨基酸浓度接近正常。,核苷酸是组成核酸的基本成分。嘌呤核苷酸合成和分解中最多见的代谢紊乱是高尿酸血症，并由此导致痛风。嘧啶核苷酸 从头合成途径中的酶缺陷可引起乳清酸尿症。,第三节 核苷酸代谢紊乱,（一）嘌呤核苷酸的代谢,嘌呤核苷酸（,purine,nucleotide,）,包括腺苷酸和鸟苷酸，是组成核酸的基本成分。,一、嘌呤核苷酸代谢紊乱,（二）高尿酸血症,高尿酸酸血症（,hyperuricemia,）,由嘌呤代谢紊乱或尿酸排泄障碍引起,1.,尿酸排泄障碍,肾小球滤过,肾小管分泌,髓绊降支被动重吸收,2.,尿酸生成过多,（,1,）由嘌呤合成代谢紊乱引起,次黄嘌呤,-,鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（,HGPRT,）缺失；,磷酸核糖焦磷酸（,PRPP,）合成酶亢进；,G-6-Pase,缺乏（,2,）,嘌呤,吸收增多（,3,）嘌呤分解增多,1.,痛风的概念,痛风（,gout,）,是一组疾病，由于遗传性和获得性的尿酸排泄减少和嘌呤代谢障碍，导致高尿酸血症及尿酸盐结晶形成和沉积，从而引起特征性急性关节炎、痛风石、间质性肾炎，严重者呈关节畸形及功能障碍；常伴有尿酸性尿路结石。,（三）痛风症发生机制,2.,尿酸结晶与痛风,1.,血浆清蛋白及,1,2,球蛋白减少,2.,局部,pH,降低,3.,局部温度降低,3.,各种痛风症状的发生机制,（,1,）急性关节炎：由尿酸钠结晶沉积于关节腔内引起，常是痛风症的首发症状,（,2,）痛风石 是痛风特征性损害，尿酸钠细针状结晶沉淀于组织，周围被单核细胞、上皮细胞、巨大细胞所围绕，形成异物结节，引起慢性轻度严症反应，痛风石呈黄白色大小不一的隆起,（,3,）间质性肾炎：,肾隋质或乳头处有尿酸盐结晶，其周围有圆形细胞和巨大细胞反应，,4.,痛风药物治疗的生物化学机制 临床常用别嘌呤醇（,allopurinol,）,治疗痛风症。,二、嘧啶核苷酸代谢紊乱,体内嘧啶核苷酸合成途径的原料来自谷氨酰胺、,CO,2,和天冬氨酸。当乳清酸磷酸核糖转移酶和乳清酸核苷酸脱羧酶缺陷时，乳清酸不能转化为尿嘧啶核苷酸，乳清酸可在血中堆积，并且随尿排出增多，称为乳清酸尿症（,orotic,aciduria,）乳清酸尿症是一种常染色体隐性遗传病。其临床上用尿嘧啶治疗。,第四节 检测方法评价,一、血清总蛋白测定,血清总蛋白测定的,前提,：,所有血浆蛋白是单纯的多肽链，糖脂类和金属有机物等均不计在内，其含氮量平均为,16%,；几百种血浆蛋白理化性质虽不同，但与化学试剂的反应性（如呈色、沉淀）一致。,蛋白质测定的,基本原理：,一般利用下列蛋白质特有的结构或性质：,重复的肽链结构；,芳香族氨基酸对酚试剂反应或紫外光吸收；,与色素结合的能力；,沉淀后借浊度或光折射测定。,凯氏定氮法（,kjeldahl,method,）,于,1883,年建立，是经典的蛋白质测定方法。,（一）凯氏定氮法,原 理,蛋白质含量,=N,元素含量,6.25,方 法,蛋白质,水解,硫酸胺,蒸馏,浓硫酸,氨,吸收,硼酸胺,HCl,滴定,酸消耗量,蛋白,含量,1.,准确度高，精密度高，灵敏度高，是公认的参考方法；,2.,操作复杂，费时，应用范围较小。,方法评价,（二）双缩脲法,原理,双缩脲反应（,biurea,reaction,）,NHCR,CONH,CR,CONH,CRCO,NHCR,CONH,CR,CONH,CRCO,Cu,2+,紫红色,1.,葡萄糖、酚酞、胆红素等对结果有干扰；,2.,高脂血症影响显色，应用丙酮抽提除脂。,注意事项,1.,准确度高，特异性好，精密度高；,2.,试剂单一，操作简便，显色稳定，是临床常用方法；,3.,线性范围较小，灵敏度较小，应用范围较窄。,方法评价,酚式剂法（,phenol reagent method,）由,Folin,在,1921,年首创，早期用于酪氨酸和色氨酸测定，后由吴宪用于蛋白质定量。,酚式剂法,原理,酪氨酸、色氨酸,磷钼钨酸,钼蓝钨蓝,还原,比色测定,750nm,1.,方法简便，灵敏度高；,2.,受糖类、酚类等还原性物质影响，准确度较差；,3.,适用于纯净单一蛋白质，应用范围较窄。,方法评价,（四）紫外分光光度法,原理,芳香族氨基酸分子中的共轭双键,最大吸收波长,280nm,方法,紫外分光光度计测定,1.,直接测定，不需显色，,2.,方法简便，灵敏度高；,3.,受核酸影响，准确度较差，常用经验公式校正结果；,4.,适用于纯净单一蛋白质，且仪器较贵，应用范围较窄。,方法评价,（五）染料结合法,原理,蛋白质的带电荷特性,常用染料：,氨基黑、丽春红、考马斯亮蓝、邻苯三酚红钼,1.,方法简便、快速，灵敏度高；,2.,不同蛋白结合力不一致，结果准确度较差；,方法评价,比浊法（,turbidimetry,）,基于某些酸如三氯醋酸、磺基水杨酸等能与蛋白质结合而产生沉淀的原理而设计，血浆尿液等加入一定浓度的此类蛋白沉淀剂后可产生微细沉淀，测定悬浮液的浊度大小与蛋白质的浓度成正比。,比浊法,1.,方法简便、快速，灵敏度高；,2.,结果准确度较差；常与其他方法联合应用。,方法评价,二、血清清蛋白测定,常用,方法,盐析法：硫酸胺沉淀法,电泳法：醋纤膜电泳法、琼脂糖电泳法,免疫法：免疫扩散法、免疫比浊法、放射免疫法,染料结合法：溴甲酚绿法、溴甲酚紫法,溴甲酚绿法,清蛋白,pI4.66,，在,pH=4.2,的琥珀酸缓冲液中带正电荷，可与带负电荷的染料溴甲酚绿（,bromocresol,green BCG,）结合形成蓝绿色复合物，在,630nm,有吸收峰。,原 理,1.,反应液的,pH,要准确：,BCG,是一种,pH,指示剂，变色域在,pH3.8,（黄色）,-5.4,（蓝绿色）；,2.,缓冲液也可用柠檬酸盐或乳酸盐，但以琥珀酸盐效果最好；,3.,为提高显色稳定性，要用表面活性剂：如,Briji-35,、,Tween-20,、,Tween-80,等；,4.,特异性比较差，放置时间长与球蛋白成色。故要求,30s,内比色。,注意事项,1.,操作简便、快速，胆红素、溶血和中度脂血无干扰，是目前临床常用方法；,2.,线性范围较窄，为,10-60g/L,，应用范围较小；,3.,特异性较差，受球蛋白影响。,方法评价,醋酸纤维素薄膜和琼脂糖凝胶是目前最广泛采用的两类介质。,三、血清蛋白电泳,血清中的蛋白质除清蛋白等少数蛋白质能使用染料结合法等方法测定外，,其他都制备特异的抗血清，采用免疫化学方法测定。,目前应用免疫比浊法能够测定的血清蛋白质有：,Alb,、,PA,、,AAT,、,AAG,、,HAP,（,HP,）、,AMG,、,CER,（,Cp,）、,TRF,、,CRP,等。,此外，免疫球蛋白轻链、,AFP,、,2,微球蛋白等也可如此测定。,四、其他血清蛋白的测定,特点：,1.,必须先将各种氨基酸分离。,2.,应用广泛：血浆、尿液、脑脊液、羊水、各种细胞内液等。,3.,灵敏度高，样品用量少,4.,方法进展快，自动化程度高,五、氨基酸的测定,（一）自动分析仪,组成,数据处理系统,色谱系统,检测系统：,反应器、比色计、记录器,加样系统,控制系统,原理,吸收光谱法：,茚三酮反应，出现紫色,（,570nm,）与黄色（,440nm,）,发射光谱法：,邻苯二醛荧光反应，激发,波长,340nm,，发射波长,455nm,（二）氨基酸的层析分离,单向纸层析,双向纸层析,第,一,方,向,第二方向,优点：简单、方便,缺点：灵敏度低、分辨率差、费时,纸层析,原理：吸附、解吸、再吸附、再解吸,判定指标：比移率（,Rf,）,薄层层析,溶剂前沿,原点中心,斑点中心,a,b,（三）氨基酸的化学法测定,原理：,AA+,磷酸铜试剂,兰色络合物,特点：肽类有一定的干扰作用,色氨酸、亮氨酸和异亮氨酸不显色,尿氨基酸排泄率：同时测定的尿中,AA/Cr,（,mol,）,1.,尿液氨基酸测定：,原理：荧光分光光度法。,色氨酸与甲醛缩合，并被三氯化铁氧化，形成具有荧光化合物。,2.,色氨酸测定,3.,尿液羟脯氨酸测定：,可见分光光度法,多肽,羟脯氨酸,酸水解,氯胺,T,吡咯类化合物,红色化合物,二甲氨基苯甲醛,（四）氨基酸的酶法测定,苯丙氨酸测定：常用的有和脱氢酶法,苯丙氨酸,4-,氨基安替比林,醌亚胺,（红色）,苯丙氨酸氧化酶,H,2,O,2,二甲苯胺,550nm,比色测定,氧化酶法,苯丙氨酸,苯丙氨酸脱氢酶,苯丙酮酸,340nm,吸光度的上升速率,脱 氢 酶 法,NAD,+,NADH+H,+,测定苯丙氨酸含量,谷胺酰胺和支链氨基酸的测定也是利用相似的原理。,1.,常用的血浆总蛋白测定方法有哪些？各有什么优缺点？,2.,急性心肌梗死的,ARP,与时间进程及损害程度相关，简述其三个时期的特征。,3.,试述转铁蛋白的临床意义。,4.,低清蛋白血症常见的原因有哪些？,思考讨论题,（理论）,