DB42∕T 1024-2014 牛支原体肺炎诊断技术规程(湖北省).pdf

ICS 11.220 B 41 备案号： DB42 湖北省地方标准 DB42/T 10242014 牛支原体肺炎诊断技术规程 Diagnostic procedures for Mycoplasma bovis pneumonia 20140902 发布 20141101 实施 湖北省质量技术监督局 发 布 DB42/T 10242014 I 目 录 前 言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语与定义 . 1 4 牛支原体肺炎诊断 . 1 4.1 流行病学 . 2 4.2 临床症状 . 2 4.3 病理变化 . 2 4.4 分离培养和鉴定 . 2 4.5 生化反应鉴别检测 . 3 4.6 PCR 鉴别检测. 3 5 结果判断 . 5 附录 A（规范性附录） 试剂的配制. 6 附录 B（资料性附录） 牛支原体肺炎判断流程图. 8 附录 C（规范性附录） 生化反应鉴别检测. 9 DB42/T 10242014 II 前 言 本标准按GB/T 1.12009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。 本标准由华中农业大学提出。 本标准由华中农业大学归口。 本标准起草单位：华中农业大学、随州市弘大畜牧有限责任公司、松滋市春珍肉牛养殖场。 本标准主要起草人：郭爱珍、白智迪、晁金、胡长敏、陈颖钰、陈焕春、彭清洁、曹永强、周春。 DB42/T 10242014 1 牛支原体肺炎诊断技术规程 1 范围 本规程规定了牛支原体肺炎诊断技术以及结果判定依据。 本规程适用于牛支原体肺炎的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 66822008 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 186492002 牛传染性胸膜肺炎（牛肺疫）诊断技术 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本规程。 3.1 牛支原体 Mycoplasma bovis M.boivs 属于柔膜纲（Mollicutes）支原体科（Mycoplasmataceae）支原体属（Mycoplasma）成员。与羊无乳支原体 （Mycoplasma agalactiae） 关系密切， 曾被命名为无乳支原体牛亚种 （Mycoplasma agalactiae subsp. Bovis）。主要导致化脓性或凝固性坏死性肺炎，还可发见关节炎、腱鞘炎、角膜结膜炎、中耳炎、乳腺炎等。 3.2 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction PCR 是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。一般由三个步骤组成：模板的热变性，寡核苷酸引物复性到单链靶序列上以及由热稳定DNA聚合酶催化的复性引物引导的新生DNA链延伸聚合反应。 3.3 胸膜肺炎样微生物 pleuropnenmonia-like organism PPLO 即支原体（Mycoplasma），因为最初认识的支原体病为牛传染性胸膜肺炎（contagious pleuropneumonia），所以将该病的病原命名为胸膜肺炎微生物（pleuropneumonia organism，PPO)。之后，在人和动物的呼吸道、消化道和泌尿生殖道分离出多种特征相同的微生物，统称为胸膜肺炎样微生物 (Pleuropneumonia like organism)，简称PPLO。 4 牛支原体肺炎诊断 DB42/T 10242014 2 牛支原体肺炎诊断技术分为流行病学分析，临床症状观察，病理变化检查，支原体纯化和反应鉴别检测，PCR鉴别检测等，确诊有赖于2种或2种以上方法的联用与综合判断。 4.1 流行病学 育肥牛多发，与应激（长途运输、热或冷应激、抵抗力下降等）相关。牛运达后1周2周发病，运输途中经历恶劣气侯可加快发病。病程1个月以上。年龄越小病情越严重。 初生犊牛也可发病， 1周2周龄左右出现明显的呼吸道症状和关节炎症状， 与吸吮含牛支原体的母乳有关。 4.2 临床症状 发病率60%以上，死亡率可高达10%50%。初期发热，体温升至42左右；有清亮或脓性鼻汁，咳嗽，气喘，半夜及清晨咳嗽加剧；精神沉郁，食欲减退；眼结膜潮红，流浆液性或脓性分泌物。 病程较长时，患牛明显消瘦，可见关节炎，表现为关节脓肿，跛行甚至卧地不起；也可见腹泻，粪便呈水样，可能带有血液和黏膜；可见中耳炎。严重者可发生死亡。 常规抗生素治疗效果差，病情反复发作。 4.3 病理变化 主要集中在肺部与胸腔。肺和胸膜可能粘连，胸腔积液；心包积液；肺部病变轻者可见肺尖叶、心叶及部分膈叶边缘局部可见红色肉变， 重者可见大面积肉变区内广泛分布有黄白色干酪样坏死灶或化脓灶。其它病变与继发症或并发症有关。发生关节炎时，可见关节腔积液，有大量干酪样坏死物。 4.4 分离培养和鉴定 4.4.1 病料采集 无菌条件下取样，首选肺组织，其次为鼻腔深部分泌物和气管分泌物。 在肺组织病变与正常组织交界处，取3cm35cm3大小的组织样本，冷藏条件下快速送检或置无菌40%50%甘油生理盐水中，冷藏条件下快速送检按照GB/T 186492002进行。 气管分泌物可直接收集，冷藏条件下快速送检。 鼻拭子采集后置装有0.5 mL1.0mL灭菌生理盐水的无菌Eppendorf管中，盖严，冷藏条件下快速送检。 所有样本均须妥善包装，防渗漏，防破碎。标签用记号笔填写，应信息完整，字迹清晰，并附采样单。 4.4.2 分离培养 4.4.2.1 材料准备 本方法的试验用水应符合GB/T 66822008规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯。 培养基：支原体液体培养基见附录A中A.1,固体培养基配制见附录A中A.2。 4.4.2.2 操作方法 肺组织的初代接种培养方法按照GB/T 186492002进行，在表层消毒后，在病变和正常组织交界处取米粒至绿豆大小深层肺组织，先在支原体固体培养基表面进行样本切面涂抹，再在涂抹处划线，将病料接种于培养基表面，置于37、5% CO2恒温培养箱中培养，2d3d后，在光学显微镜下410倍放大，可观察支原体典型的“煎蛋样”菌落形态。 DB42/T 10242014 3 鼻拭子样本于采集管中涡旋5 min，取400L悬液经450nm孔径滤膜过滤，取100L滤液均匀涂布于支原体固体培养基表面，置于37、5% CO2培养箱培养, 2d3d后,用光学显微镜410倍观察菌落形态。 纯化或转接时，从支原体固体培养基挖取带支原体菌落的小块琼脂，涂抹、再划线接种于固体培养基表面，或接种于支原体液体培养基中，置于37恒温培养箱中，2d3d后,观察培养基上生长的典型菌落或观察到液体培养基由红色透明变为橙黄色透明时，表明有支原体生长。 4.5 生化反应鉴别检测 4.5.1 材料准备 生化管：葡萄糖、甘露醇、精氨酸、尿素、磷酸酶等生化管为商品化试剂。 牛支原体HB0801株作为牛支原体阳性对照，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No: M2010040。 4.5.2 操作方法 吸取10L（约107CFU）的牛支原体液体纯培养物，分别深部接种于各种生化管中，置于37恒温培养箱中，12h24h后观察结果。牛支原体不分解葡萄糖、甘露醇、精氨酸和尿素，但具有磷酸酶活性，其牛支原体生化反应鉴别见附录C。 4.6 PCR 鉴别检测 4.6.1 16S rRNA PCR 检测 利用16SrRNA通用引物，进行PCR扩增，将PCR产物测序，获得序列与GenBank中的序列进行同源性比对，鉴定牛支原体。但该方法不能区分牛支原体与无乳支原体。 4.6.1.1 仪器和耗材 PCR仪，电炉，离心机，混匀器，微量可调移液器，1.5 mL Eppendorf管，PCR反应管，核酸电泳仪，凝胶成像系统。 4.6.1.2 试剂 灭菌双蒸水，Taq Mix，琼脂糖。 4.6.1.3 样本处理 在肺组织病健交界处取一小块深层组织置于玻璃匀浆器中，加入3mL4mL灭菌PBS，反复挤压组织块，制成组织悬液。将组织悬液自然沉淀10min，取上部液体通过0.45m孔径的滤膜过滤后，将滤液作为待检样本。 鼻拭子样本按4.4.2.2方法处理，将滤液作为待检样本。 牛支原体液体培养物无需处理，作为待检样本直接进行模板提取。 4.6.1.4 模板提取 吸取4.6.1.3中1 mL待检样本于1.5 mL离心管中，13000g离心15min,沉淀溶于500L纯水中，煮沸10min，冰浴1min，13000g离心30s，取上清作为DNA模板。 牛支原体阳性对照模板为牛支原体HB0801株的DNA。 4.6.1.5 引物序列 DB42/T 10242014 4 利用16S rRNA通用引物进行PCR扩增，引物序列如下： 16S rRNA 上游引物: 5-ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT-3 16S rRNA 下游引物: 5-CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT-3 4.6.1.6 PCR 反应体系 总体积20L，其中2Taq Mix10L，上下游引物 (10mol/L) 各0.8L，牛支原体DNA模板3.0L（30ng/L），去离子水5.4L。 4.6.1.7 PCR 反应产物检测 94预变性10min后， 94变性1 min， 60退火1 min， 72延伸1 min， 30个循环后， 72延伸7min。PCR 产物预期大小为1600bp。 将PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳（5 V/cm下，电泳30 min），浸泡在溴化乙锭（EB） （0.5g/mL）缓冲溶液中或1:1000染料GelRed(Biotium)（1.3g/mL）中染色15 min，紫外灯下观察，PCR产物大小应为1600bp。将PCR产物送商业公司进行序列测定。 利用BLAST软件将16S rRNA扩增产物序列与GenBank中牛支原体16S rRNA序列（GenBank 登录号:U02968）进行同源性比较，同源性应在99%以上；与无乳支原体（Mycoplasma agalactiae）16S rRNA (GenBank 登录号: CU179680)同源性也在99%以上。 4.6.2 UvrC PCR 检测 4.6.2.1 仪器和耗材 见4.6.1.1条款。 4.6.2.2 试剂 见4.6.1.2条款。 4.6.2.3 样本处理 见4.6.1.3条款 4.6.2.4 模板提取 见4.6.1.4条款。 4.6.2.5 引物序列 利用牛支原体特异性基因UvrC的特异性片段设计引物， 该引物序列对牛支原体保守， 但可区分无乳支原体和其他支原体，目的片段位于UvrC基因1450nt至1687nt之间，大小为238bp。 引物序列如下： UvrC1 上游引物：5-TAATTTAGAAGCTTTAAATGAGCGC-3 UvrC2 下游引物：5-CATATCTAGGTCAATTAAGGCTTTG-3 4.6.2.6 PCR 反应体系 见4.6.1.6条款。 4.6.2.7 PCR 反应和产物检测 DB42/T 10242014 5 94 预变性5min后，94 变性1min，53 退火30 s，72 延伸30s，30个循环后，72 延伸10 min。 反应结束后，将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳（5 V/cm下，电泳30 min），溴化乙锭（EB）染色5 min，阳性样本有一条238bp的目的条带。 5 结果判断 以上检测方法需联合运用，应能得出确诊结果，见附录B。 结果判断按如下标准之一确诊为牛支原体肺炎。 5.1 临床初步诊断为牛支原体肺炎：病料支原体分离培养获得典型菌落；纯培养物生化鉴定符合牛支原体生化特征； 5.2 临床初步诊断为牛支原体肺炎； 病料支原体分离培养获得典型菌落； 纯培养物用通用 16S rRNA PCR扩增和测序分析，与 GenBank 数据库中牛支原体 16SrRNA 为 99%； 5.3 临床初步诊断为牛支原体肺炎；病料直接进行 16SrRNA PCR 扩增和测序分析，与 GenBank 数据库中牛支原体 16SrRNA 为 99%；和/或用特异性 uvrC PCR 扩增出一条 238bp 的目的条带； 5.4 临床初步诊断为牛支原体肺炎；病料直接进行 PCR 扩增阴性时，应将病料进行支原体分离，再用纯培养物进行 PCR 扩增和产物分析后，按 5.2 进行判断。 DB42/T 10242014 6 附 录 A （规范性附录） 试 剂 的 配 制 本附录规定了牛支原体培养基、TAE电泳缓冲液、8万国际单位/mL青霉素溶液、1%酚红溶液、琼脂糖和7.0mol/L甜菜碱（三甲基甘氨酸）（PCR级）的配制。 A.1 牛支原体液体培养基 将PPLO肉汤粉 10.5g，酵母粉 2.5g，丙酮酸钠 0.5g，溶于 440mL超纯水中，116灭菌 20min后，添加马血清 50mL， 10MEM 5mL, 8 万单位/mL青霉素溶液 5mL,1%酚红溶液 500L，定容至 500mL，置4保存备用。 A.2 牛支原体固体培养基 将PPLO肉汤粉10.5g， 酵母粉2.5g， 丙酮酸钠0.5g， 琼脂粉7.5g,溶于440mL超纯水中116 20 min25min后，添加马血清50mL，10MEM 5mL, 8万单位/mL青霉素溶液5mL, 定容至500mL，倾平板，待培养基凝固后，置4保存备用。 A.3 TAE电泳缓冲液 Tris 4.84g/L, 冰乙酸 1.142mL/L， EDTA(pH 8.0)，0.001mmol/L, 定容至1000mL。 A.4 PBS缓冲液（pH7.27.4） NaCl 137mmol/L， KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。用HCl调pH值至7.4，定容至1000mL，121 ，30min高压灭菌。 A.5 8 万国际单位/mL青霉素溶液 取400万国际单位的青霉素粉剂，溶于50mL双蒸水中,至完全溶解后，0.22m细菌滤器过滤除菌，滤液置4保存备用。 A.6 1%酚红溶液 称取1g酚红加入1 mol/L NaOH溶液2mL，不断搅拌，将已经溶解的酚红溶液倒入容器中；未溶解的酚红继续加1 mol/L NaOH溶液2mL，重复上述步骤（NaOH溶液总量不可超过6mL）；加双蒸水至100mL，116灭菌15min后，至4保存。 A.7 琼脂糖 2%琼脂糖凝胶：琼脂糖粉2g，去离子水100mL,加热充分溶解，趁热倒入核酸电泳槽胶槽中。 0.8%琼脂糖凝胶：琼脂糖粉0.8g，去离子水100mL,加热充分溶解，趁热倒入核酸电泳槽胶槽中。 DB42/T 10242014 7 A.8 7.0 mol/L甜菜碱（三甲基甘氨酸） （PCR级） 甜菜碱0.82g，加灭菌超纯水溶解，终体积定容至1mL，0.22m细菌滤器过滤除菌，-20保存。 DB42/T 10242014 8 附 录 B （资料性附录） 牛支原体肺炎判断流程图 图B.1给出了联合运用判断牛支原体肺炎的基本流程。 图B.1 牛支原体肺炎判断流程 16s rRNA PCR产物序列测定 流行病学和临床初步诊断 病料采集 病料处理 牛支原体培养分离 低倍显微镜观察支原体典型菌落 生化反应鉴别检测 PCR 鉴别检测 uvrC 特异性 PCR 牛支原体肺炎的确诊 - + - +DB42/T 10242014 9 附 录 C （规范性附录） 生化反应鉴别检测 表 C.1 给出了牛支原体生化反应鉴别检测的判断依据。 C.1 牛支原体生化反应鉴别检测表 表 1 生化反应结果判定 种名 分解葡萄糖 分解甘露醇 水解精氨酸 分解尿素 磷酸酶活性 牛支原体 - - - - + 精氨酸支原体 - - + - - 无乳支原体 - - - - + 丝状支原体丝状亚种 + + - - - 绵羊肺炎支原体 + - - - 注：+反应阳性，-反应阴性。 _