非洲猪瘟病毒B602L蛋白的真核表达及多克隆抗体的制备.pdf

Chinese Journal of Veterinary Drug中国兽药杂志2 0 2 3年10 月第57 卷第10 期doi:10.11751/ISSN.1002-1280.2023.10.01非洲猪瘟病毒B602L蛋白的真核表达及多克隆抗体的制备刘郁夫12，林晓慧，郝文茜，冯夏宁,欧阳征亮3，陈瑞爱2,3*（1.肇庆学院生命科学学院，广东肇庆52 6 0 6 0;2.岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心，广东肇庆52 6 2 38；3.农业农村部动物疫病防控生物技术与制品创制重点实验室/广东省兽用生物制品技术研究与应用企业重点实验室/肇庆大华农生物药品有限公司广东肇庆52 6 2 38）肇庆大华农生物药品有限公司，广东肇庆52 6 2 38）收稿日期 2 0 2 3-0 5-14文献标识码 A文章编号 10 0 2-12 8 0（2 0 2 3）10-0 0 0 1-0 8中图分类号 S855.3收稿日期 2 0 2 3-0 5-14文献标识码 A文章编号 10 0 2-12 8 0（2 0 2 3）10-0 0 0 1-0 8中图分类号 S855.3摘要 为为表达非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白，制备相应的多克隆抗体，根据NCBI网站上公布的非洲猪瘟病毒（Pig/HLJ/2018株）B602L基因序列进行密码子优化和基因合成，随后克隆至杆状病毒转移载体pFastBacl中，获得重组杆状病毒质粒，再把重组杆粒转染昆虫细胞Sf9,拯救重组B602L基因的杆状病毒。经间接免疫荧光和westernblots鉴定结果显示,B602L重组蛋白与His标签抗体、非洲猪瘟标准阳性血清均能发生特异性反应,并且B602L重组蛋白可以细胞分泌上清的形式进行表达。通过His镍株亲和纯化的方式纯化重组蛋白,B602L蛋白大小约7 0 ku，与预期相符。将B602L重组蛋白与弗氏佐剂配比免疫BALB/c小鼠，制备小鼠多克隆抗体，经间接ELISA检测，该抗体效价可达1:512 0 0 0,并且与B602L重组蛋白具有良好的反应性。本研究可为进一步研究非洲猪瘟B602L蛋白的结构与功能、研制非洲猪瘟诊断制品提供生物材料。关键词非洲猪瘟；B602L；真核表达；多克隆抗体Eukaryotic Expression of B602L Protein of African SwineFever Virus and Preparation of Polyclonal AntibodyLIU Yu-fu2,LIN Xiao-hui,HAO Wen-qian,FENG Xia-ning,OUYANG Zheng-liang,CHEN Rui-ai?:2,3*(1.School of Life Sciences,Zhaoqing University,Zhaoqing,Guangdong 526060,China;2.Zhaoqing Branch Center of Guangdong Laboratory for Lingnan Modern Agricultural Science and Technology,Zhaoqing,Guangdong 526238,China;3.Key Laboratory of Biotechnology and Bioproducts Development for Animal Epidemic Prevention,Ministry of Agriculture andRural Afairs/Guangdong Enterprise Key Laboratory of Biotechnology R&D of Veterinary Biologics/ZhaoqingDahuanong Biology Medicine Co.,Ltd,Zhaoqing,Guangdong 526238,China)基金项目：广东省科技计划项目（2 0 2 0 B1212070015）；肇庆市科技项目（2 0 2 1C001）；肇庆学院大学生创新训练项目(X202310580122)作者简介：刘郁夫，博士，从事兽医微生物与免疫学研究。通讯作者：陈瑞爱。E-mail：c h e n s a 7 2 7 v i p.12 6.c o mChinese Journal of Veterinary Drug中国兽药杂志2 0 2 3年10 月第57 卷第10 期Corresponding author:CHEN Rui-ai,E-mail:chensa727 Abstract:To express the recombinant protein of African swine fever virus B602L,the corresponding polyclonalantibody was prepared.In this experiment,codon optimization and gene synthesis were carried out according tothe B602L gene sequence of African swine fever virus（Pi g/H LJ/2 0 18 s t r a i n)p u b l i s h e d o n NCBI w e b s i t e,subsequently B602L gene was cloned into the baculovirus transfer vector pFastBacl,and obtain a recombinantbaculovirus plasmid.Then transfect the baculovirus plasmid into insect cell Sf9 to rescue the recombinant B602Lgene baculovirus.The results of IFA and western blots identification showed that the B602L recombinant proteincan specific react with His labeled antibodies and African swine fever standard positive serum,and the B602Lrecombinant protein can be expressed in the form of cell secreted supernatant.The recombinant protein waspurified by affinity purification of His nickel strain,and the size of B602L protein was approximately 70 ku,whichwas consistent with expectations.Immunize BALB/c mice with the combination of B602L recombinant protein andFreunds adjuvant to prepare mouse polyclonal antibodies.Indirect ELISA detection showed that the antibody hada titer of 1:512000 and showed good reactivity with the B602L recombinant protein.This study can providebiomaterials for further studying the structure and function of African swine fever B602L protein and developingdiagnostic products for African swine fever.Key words:African swine fever virus;B602L;eukaryotic expression;polyclonal antibody非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（African swine fevervirus，A SFV)引起的一种重要猪传染病,以发病急、病死率高为主要特征,猪是ASFV唯一天然宿主1-2 ，自ASFV传人以来,给我国养猪业造成严重经济损失。目前市场上尚没有特效药物和有效疫苗可用于治疗和预防非洲猪瘟，完善的生物安全防护措施和快速检测技术是该病主要防控的手段3,且非洲猪瘟临床发病症状与经典猪瘟相似,开发特异敏感的血清学检测技术具有广阔的应用价值，有助于非洲猪瘟的鉴别诊断和防控净化工作4ASFV是一种有囊膜的、双股线性DNA病毒，病毒基因组结构复杂,编码151 16 7 个开放阅读框5。其中已报道的P72、P54、P30、Pp 6 2、CD 2 v、B602L等蛋白具有较强的免疫原性，是亚单位疫苗和血清学检测技术研发的主要靶点6 。而其中非结构蛋白B602L在感染晚期高效表达于细胞质中，一般认为是P72蛋白分子伴侣,在病毒核衣壳组装过程中发挥重要作用。王鹏飞7 利用pGEX-6P-1原核表达载体,原核表达B602L蛋白,并建立了基于B602L重组蛋白的间接ELISA检测方法。经比对,该方法与基于p72蛋白的阻断ELISA试剂盒检测结果的符合率为95%，提示B602L是ASFV主要的抗原性蛋白之一，但原核表达系统缺乏翻译后修饰机制,往往不能形成完整的三维构象8 为真核表达AFSVB602L重组蛋白，制备相应的多克隆抗体。本实验利用昆虫细胞真核表达系统，表达B602L重组蛋白，通过间接免疫荧光、SDS-PAGE和western blots试验鉴定重组蛋白,再以纯化的B602L蛋白免疫小鼠，制备B602L多克隆抗体血清，最后通过间接ELISA试验和westernblots试验对多克隆抗体的反应性进行鉴定。本试验可为后续ASFV血清学检测方法的建立、B602L单克隆抗体的制备提供前期基础和和生物材料储备。1材料与方法1.1样品及主要试剂非洲猪瘟标准阳性血清购自中国兽医药品监察所（2 0 2 10 1批）；pFastBacl质粒和Sf9昆虫细胞由岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心保存；根据草地贪夜蛾卵巢细胞的密码子偏嗜性，对ASFVB602L基因Chinese Journal of Veterinary Drug中国兽药杂志2 0 2 3年10 月第57 卷第10 期（M K 33318 0）进行密码子优化，由苏州金唯智生物科技有限公司进行基因合成；PrimeSTARMAXDNA聚合酶、限制性内切酶EcoRI、Sa l I购自宝日医生物技术（北京）有限公司；BAC/PACDNA小量提取试剂盒购自OMEGA公司；Anti-His鼠源单抗、羊抗鼠酶标二抗、FITC标记的羊抗鼠二抗、DH1OBAC感受态细胞购自北京索莱宝科技有限公司;Sf-900III昆虫细胞培养基、脂质体转染试剂Cellfectin II购自Gibco公司；弗氏佐剂购自Sigma公司；SPF级BALB/c小鼠购自肇庆瑞思元生物科技有限公司。1.2B602L杆状病毒转移载体的构建从NCBI网站上下载ASFVPig/HLJ/2018株（MK333180）的B602L基因序列,利用网络在线工具(https:/services.healthtech.dtu.dk）分析其信号肽序列，并在B602L蛋白的N端设计kozac序列(GCCACC)和蜂毒素信号肽序列（MKFLVNVALVFMVVYISYIYA），在B602L蛋白的C 端设计6 His 标签,并以柔性linker(G,S)3与目的基因相连。基因序列由苏州金唯智生物科技有限公司进行密码子优化和合成。以合成基因为模板，设计引物进行PCR扩增,引物序列见表1,并将B602L基因克隆至杆状病毒转移质粒pFastBacl的EcoRI和Sal I限制性内切酶中间。经测序验证没有移码和突变,命名为 pFastBacl-B602L。表1引物信息Tab 1Primerinformation引物名称引物序列片段长度Primer namePrimer sequences(5-3)Fragment length/bpB602L-FCCGGAATTCGCCACCATGAAGTTTTTAGTC1734B602L-RCGCGTCGACTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGATC1.3重组杆状病毒的拯救将构建好的杆状病毒供体质粒pFastBacB6 0 2 L转化进DH10Bac感受态细胞中,并在含卡那霉素50 g/mL、四环素10g/mL、庆大霉素7 g/mL、IPT G 12 5g/mL、X-gal 100 g/mL的抗生素平板中进行蓝白斑筛选，利用B602L-F/B602L-R引物对显白色的单菌落进行PCR鉴定。依据BAC/PACDNA小量提取试剂盒说明书抽提重组杆粒Bacmid-B602L，测定核酸浓度后置于-2 0 冰箱保存备用。将处于生长对数期的Sf9昆虫细胞接种于6 孔细胞培养板，静置4h后进行杆粒转染，步骤如下：将5g 的Bacmid-B602L杆粒与8 L Cellfectin II转染试剂分别加入12 5L的Opti培养基中，室温预混5分钟；再将两者混匀后置于室温静置5分钟;随后缓慢滴加到 Sf9细胞中。在Sf9细胞中连续盲传3代，直至出现明显细胞病变。1.4B602L重组蛋白的表达鉴定通过间接免疫荧光和westernblots试验，检测Sf9细胞中是否表达外源蛋白B602L。间接免疫荧光试验方法简要如下：将B602L病毒液接种至Sf9培养基，置于27温箱培养7 2 h后，经4%多聚甲醛固定处理、0.1%TritonX-100细胞透化，以His标签抗体（1:10 0 0 倍稀释）为一抗孵育1h，用PBS洗涤3次，再用FITC标记的羊抗鼠二抗（1：50 0 倍稀释）孵育1h,PBS洗涤3次后置于荧光显微镜下观察。westernblots试验方法简要如下：收获病变明显的Sf9细胞，冻融3次后，离心分离上清和细胞沉淀样品，进行12%SDS-PAGE电泳，经NC膜转印后，分别以anti-His单抗（1:50 0 0 倍稀释）和ASFV标准阳性血清(1:50 0 倍稀释）为一抗4孵育过夜，PBST清洗3次后，再分别以HPR标记羊抗鼠IgG二抗（1:10 0 0 0 倍稀释）和HPR标记免抗猪IgG二抗(1:10 0 0 0 倍稀释）室温孵育1h,PBST清洗掉残留的二抗，用AzureBiosystemsC600多功能分子成像系统成像。1.5B602L重组蛋白的纯化将western blots 鉴Chinese Journal of Veterinary Drug中国兽药杂志2 0 2 3 年10 月第57 卷第10 期定正确的B602L杆状病毒液，按1:10 的比例接种Sf9细胞培养液,2 7 温箱孵育7 2 h,冻融3次后进行超声破碎，功率35W，工作时间5min、间歇时间2min，全部时间为10 min。以7 0 0 0 g的转速室温离心10 min，收集上清。利用His镍株亲和层析的方式纯化B602L重组蛋白。1.66B602L多克隆抗体的制备将纯化后的B602L蛋白以PBS稀释成浓度为1g/mL，与弗氏佐剂等体积混合，充分乳化后，以背部皮下多点注射的方式免疫BALB/c小鼠，每只小鼠免疫0.2mL,每隔14d进行二免和三免。三免过后14d以眼眶采血处死小鼠，并分离血清，分装后置于-20冰箱保存。1.7B602L多克隆抗体的验证为验证B602L小鼠多抗的效价，通过间接ELISA方法检测B602L小鼠多克隆抗体的效价。将纯化的B602L蛋白以50ng/孔的浓度，4过夜包被96 孔酶标板，用含5%脱脂牛奶的PBST于37 温箱封闭1h，加人1000倍稀释的B602L小鼠多抗，再进行2 倍倍比稀释，经HRP标记羊抗鼠IgG二抗（1:10 0 0 0 倍稀释）孵育，最后显色检测450 nm吸光度值。为验证B602L小鼠多抗的反应性，通过westernblots试验检测多抗与重组蛋白B602L的反应性。westernblots试验方法简要如下：将纯化的B602L蛋白经SDS-PAGE电泳、NC膜转印后，先后以B602L小鼠多抗（1:2 50 倍稀释）为一抗，HPR酶标记的羊抗鼠IgG（1：10 0 0 0 倍稀释）为二抗孵育，PBST清洗3次后通过化学发光显色2结果与分析2.1杆状病毒穿梭质粒的构建及鉴定以合成的B602L基因为模板,用B602L-F/B602L-R为引物进行PCR扩增，结果如图1所示，可扩增出17 0 0bp左右的目的条带,与预期相符。将目的条带切胶回收后，以酶切连接的方式克隆至杆状病毒穿梭质粒pFastBacl,并测序验证，将验证正确的重组质粒命名为pFastBac-B602L。M18000bp300830086P2000bp1734bp1000bp750bp500bp250bp100bpM：D L8 0 0 0 D NA M a r k e r;1：B6 0 2 L基因PCR扩增结果M:DL8000 DNA Marker;1:PCR amplification results of B602L gene图1B602L基因PCR扩增Fig1PCR amplification of B602L gene2.2重组杆状病毒的拯救将杆状病毒穿梭质粒pFastBac-B602L转化至DH10Bac感受态细胞中，经转座、抗生素筛选和蓝白斑筛选，挑取白色单菌落进行PCR鉴定，然后扩大培养，根据BAC/PACDNA小量提取试剂盒制备杆状病毒重组质粒，命名为Bacmid-B602L。将Bacmid-B602L转染到 Sf9细胞中，盲传3代,直至细胞出现变大、变圆、死亡、脱落等典型病变（图2）。将His单抗作为一抗（1:10 0 0 倍稀释），FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗（1:10 0 0 倍稀释），依次孵育接种过重组杆状病毒48 h的Sf9细胞，仍可在荧光显微镜下观察到特异性结合的绿色荧光（图3），说明B602L重组蛋白Sf9细胞内成功表达。2.3B602L重组蛋白的表达鉴定收获病变明显的Sf9细胞，冻融3次后，离心分离上清和细胞沉淀样品，经westernblots检测，以anti-His鼠源单抗孵育，结果如图4所示，Sf9细胞沉淀和上清均可显色出特异性结合条带，说明B602L重组蛋白可在昆虫细胞中表达,并可分泌到细胞上清中。取Sf9细胞破碎裂解后上清样品，进行westernblots鉴定，以非洲猪瘟标准阳性血清为一抗（1:50 0 倍稀释），仍可显色出特异性结合条带，说明昆虫细胞表达的B602L重组蛋白抗原性良好，可被非洲猪瘟阳性血清识别。Chinese Journal of Veterinary Drug中国兽药杂志2 0 2 3年10 月第57 卷第10 期ABA：r Ba c u l o v i r u s-B6 0 2 L感染组;B：正常Sf9细胞A:rBaculovirus-B602L infection group;B:Normal Sf9 cells图2 杆状病毒感染引起的S9细胞病变（白光,10 0）Fig 2 Sf9 cytopathy caused by baculovirus infection(White light,100)ABA：B6 0 2 L重组杆状病毒感染组；B：空白对照A:B602L recombinant baculovirus infection group;B:Blank control图3间接免疫荧光试验鉴定B602L蛋白（绿色荧光10 0）Fig 3 Identification of B602L protein by indirect immunofluorescence assay(Green fluorescence,100)kuM1M2M32501501004B602L7050403525201510M：蛋白分子量标准；1：Sf9细胞沉淀，以His单抗为一抗孵育；2：Sf 9细胞上清，以His单抗为一抗孵育;3：St9细胞上清，以非洲猪瘟阳性血清为一抗孵育M:Protein molecular weight standard;1:Sf9 cell precipitation,incubated with His monoclonal antibody as primary antibody;2:Sf9 cell supernatant,incubated with His monoclonal antibody as primary antibody;3:Sf9 cell supernatant,incubated with African swine fever positive serum as primary antibody图4Westernblots试验鉴定B602L重组蛋白Fig 4 Identification of B602L recombinant protein by western blots assayChinese Journal of Veterinary Drug中国兽药杂志2 0 2 3年10 月第57 卷第10 期2.41B602L重组蛋白的纯化将接种B602L杆状病毒病毒液的S9细胞超声破碎裂解之后,离心收集细胞上清，采用亲和层析的方法纯化B602L重组蛋白，经SDS-PAGE鉴定，如图5所示，经His镍株纯化的B602L重组蛋白大小约70ku左右，BCA法测定B602L纯化后蛋白浓度为0.456 mg/mL。2.5B602L多克隆抗体的制备及验证将纯化的B602L的蛋白于佐剂充分乳化后，免疫BALB/c小鼠，三免免疫过后同通过小鼠眼眶采血收集血清，并通过间接ELISA试验和westernblots试验分析B602L小鼠多抗的反应性和效价。间接ELISA结果显示，B602L小鼠多抗血清的ELISA效价为1:512000;通过westernblots鉴定B602L小鼠多抗与纯化后B602L蛋白的反应性，结果显示1:2 50 倍稀释的多抗血清可与纯化后B602L蛋白反应（图6），表明本试验制备的B602L多克隆抗体与B602L蛋白反应性良好。3讨论与结论非洲猪瘟是严重危害养猪业的重要猪传染病，临床感染导致猪出现呕吐、腹泻、高热、出血等症状,疾病病程短死亡率高，高毒力毒株短期内可导致病猪死亡率90%以上。且ASFV的病毒粒子呈正二十面体结构9-10 ,因病毒基因组结构庞大,致病机制复杂，目前尚没有特效药物和商品化疫苗上市，非洲猪瘟在我国流行早期，快速抗原检测技术是防控非洲猪瘟的主要防控手段4,1,但随着非洲猪瘟在我国进人常态化防控状态，弱毒株、亚急性病例不断增多,病猪排毒不规律、不明显，常导致错误诊断,因此需要通过血清学诊断技术对ASFV进行辅助诊断12 。ASFV重组蛋白制备可为血清学诊断技术开发、亚单位疫苗研发提供丰富的蛋白原料。B602L蛋白是ASFV感染晚期表达的一种非结构蛋白，被认为参与P72蛋白折叠修饰过程，是P72蛋白获得正确构象的分子伴侣，但具体作用以及工作机制尚未明确9。前期试验已证明B602L是ASFV主要抗原性蛋白之一，可被ASFV阳性血kuM125015010070?B602L504035251510M：蛋白分子量标准；1：纯化的B602L重组蛋白M:Protein molecular weight standard;1:Purified B602L recombinant protein图5SDS-PAGE鉴定B602L重组蛋白Fig 5Identification of B602L recombinantprotein by SDS-PAGEkuM125015010070 B602L504035251510M：蛋白分子量标准；1：纯化的B602L重组蛋白M:Protein molecular weight standard;1:Purified B602L recombinant protein图6Westernblots试验鉴定B602L多抗血清Fig 6Identification of B602L polyclonal antibodyserum by western blots assay清识别13-14,本实验室也以B602L原核表达蛋白为抗原包被ELISA板，建立的间接ELISA检测方法可敏感特异地检出ASFV临床阳性样品，与商品化ASFVELISA检测方法的符合率为90%以上（文章未发表），结果表明B602L蛋白可作为诊断试剂和亚单位疫苗研发的靶标。Chinese Journal of Veterinary Drug中国兽药杂志2 0 2 3年10 月第57 卷第10 期重组蛋白表达是非洲猪瘟研究的热点，当前常用的技术路线有大肠杆菌原核表达系统15-16 、昆虫细胞真核表达系统17 和哺乳动物细胞真核表达系统18-1。如蒋亚君等2 0 利用pET-28a系列原核表达载体，成功实现ASFVA104R蛋白在大肠杆菌上清中表达；张凯等15 利用原核表达的P22蛋白，建立间接ELISA检测方法，与商品化ASFV抗体检测试剂盒的符合率为97.7%；王鹏飞7 建立的基于B602L原核表达蛋白的间接ELISA方法与基于P72的阻断法ELISA方法符合率为95%，表明以ASFV抗原蛋白为基础建立血清学检测方法，操作方便，技术可行。但原核表达蛋白通常只含有蛋白的线性结构2 1,缺乏翻译后修饰过程,在区分弱阳性血清样品能力中仍有缺陷，而昆虫细胞真核表达系统具有表达成功率高、可对蛋白进行部分糖基化修饰、便于悬浮扩大培养的优点，受到研究人员的关注。杨扬等2 2 利用杆状病毒昆虫细胞表达系统实现B602L重组蛋白的表达,但并未分析表达的形式，笔者通过生物软件分析B602L的信号肽序列，发现B602L蛋白自身不含信号肽，因此在序列5 端设计蜂毒素信号肽，以提高B602L蛋白的分泌表达水平，有利于后期纯化。为制备B602L真核表达蛋白,本研究以杆状病毒昆虫细胞表达系统表达B602L蛋白,并以纯化的蛋白免疫小鼠，制备相应的多克隆抗体。结果显示，通过间接免疫荧光试验证明B602L蛋白表达成功，westernblots结果表明B602L重组蛋白可被标签抗体和ASFV阳性血清识别,并以细胞分泌上清的形式表达。制备的B602L多克隆抗体通过间接ELISA鉴定，效价为1：512 0 0 0,并且westernblots结果表明B602L多抗与重组蛋白具有反应性。本研究可为接下来ASFV血清学检测方法的研发提供前期基础。参考文献：1 Dixon L,Chapman 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