赛恩斯医学硕士毕业论文答辩幻灯参考.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Genistein,后处理介导大鼠海马,CA1,区,eNOS/Nrf2/HO-1,信号通路及其神经保护作用,来源：,赛恩斯,http：/,一、研究的背景及意义,1.,对缺血性脑中风发病机制及防治的研究已成为医学界关注的重点。,2.,缺血大脑迅速获得血液供应是阻止缺血性神经元损伤的首要措施，然而，大量的血液迅速再灌注又进一步加重缺血组织的损伤,-,即,缺血再灌注损伤,。,3.,氧化应激和炎症,是缺血再灌注损伤病理生理机制的重要组成部分。脑缺血再灌注早期即有大量活性氧产生，并迅速启动损伤级联，加剧了初始损害最终导致神经元不可逆的损伤。因此，再灌注早期阻断氧化应激损伤是有效降低迟发性神经元死亡的关键。,4.Genistein,具有,酪氨酸激酶抑制剂活性,和,抗氧化作用,。,5,、,Genistein,作为酪氨酸激酶抑制剂可有效减弱短暂全脑缺血造成的神经元的延迟性死亡；一个单纯的氧诱导的脑缺血小鼠模型显示,Genistein,具有抗氧化活性。,6.eNOS,活性的升高对脑中风具有有益作用。另研究发现，,Genistein,能够诱导,eNOS,活性并激活核因子,NF-E2,相关因子,(Nrf2),，进而诱导抗氧化酶表达、减少心血管疾病的发生。,那么，,Genistein,postconditioning(GPC,，即缺血后给予,Genistein,),是否能通过,eNOS/Nrf2/,ARE,信号通路,降低氧化应激，从,而发挥抗缺血性神经元损伤的作用？目前尚未见报道。,本研究采用四动脉结扎,(4-VO),全脑缺血模型，观察,GPC,对缺血性神经元的保护作用，并探讨其可能的分子机制，为临床防治缺血性脑中风提供理论依据。,二、材料与方法,1.,主要实验仪器和试剂,大鼠脑立体定位仪,大鼠脑微量注射泵,冰冻切片机,激光扫描共聚焦显微镜,酶标仪,电泳设备,摇床,Morris,水迷宫,超低温冰箱等,组织裂解液,BCA,蛋白浓度测定试剂盒,eNOS,、,p-eNOS,、,Nrf2,、,HO-1,一抗及其相应的二抗,NBT/BCIP,显色液,NeuN,、,4-HNE,、,8-OHdG,一抗及对应的荧光二抗,TUNEL,试剂盒,2.,实验分组,SPF,级成年雄性,SD,大鼠,随机分组及,4-VO,模型,Sham,I/R,Veh1(IR+DMSO),GPC,Veh2(GPC+NaCl),L-NAME,30m,24h,I10m,I10m,I10m,I10m,I10m,30m,6h,1d,5d,椎动脉电凝并分离颈总动脉,缺血,尾静脉注射,Genistein,1mg/kg,侧脑室注射,L-NAME,1mg/5,l,0.9%NaCl,0.1%DMSO,3d,7d,9d,3.,技术路线图,再灌注,5d,检测,海马,CA1,区神经元,的凋亡及存活,实验方法及检测指标,再灌注,30min,6h,1d,3d,观察,p-eNOS,Nrf2,HO-1,蛋白表达,免疫荧光,染色法,蛋白免疫,印迹技术,TUNEL,染色,及,NeuN,染色,再灌注,3d,观察,海马,CA1,区神,经元,8-OHdG,4-HNE,Nrf2,HO-1,蛋白的,表达及定位,Morris,水迷宫,再灌注,7-9d,，,检测大鼠的空间,学习和记忆能力,4.,统计学分析,数据整理后，应用,SigmaStat3.5,统计软件进行统计学分析。所有计量资料数值以均数,标准差表示，采用单因素方差分析,(ANOVA),，多个实验组与一个对照组比较用最小显著差法,(LSD),，各实验组之间比较采用,q,检验,(Newman-,keuls,test),，,P,0.05,为差异有统计学意义。,三、实验结果与讨论,Genistein,后处理是否具有神经保护作用呢？,图,1,NeuN,及,TUNEL,免疫荧光染色观察再灌注,5d,大鼠海马,CA1,区神经元的存活及凋亡,图,A,：,NeuN,(,红色,),染色：生存的神经元；,TUNEL(,绿色,),染色：凋亡样神经元；图,B,：海马,CA1,区,1mm,长度内,NeuN,阳性神经元数量统计图；图,C,：海马,CA1,区,1mm,长度内,TUNEL,阳性神经元数量统计图,;*,P,0.05 vs.I/R,组，,#,P,0.05 vs.GPC,组，,n=5;40,bar=50m,A,B,C,小结,1,Genistein,后处理对缺血性神经元损伤具有保护作用，,eNOS,激酶抑制剂,L-NAME,减弱了该作用，说明,eNOS,可能参与了此保护作用。,Genistein,后处理是否诱导,eNOS,激活（磷酸化）,?,图,2 GPC,对,大鼠海马,CA1,区神经元,eNOS,、,p-eNOS,蛋白表达的影响,图,A,：再灌注不同时间点,p-eNOS,、,eNOS,蛋白的表达；,Sh,：,Sham,组；,R,：再灌注；,：,I/R,组；,：,GPC,组；,GPC:,Genistein,后处理；图,B,：,p-eNOS,蛋白表达统计图：,n=4,；*,p,0.05 vs.I/R,组,A,B,图,3 L-NAME,对再灌注,3d,大鼠海马,CA1,区神经元,eNOS,磷酸化水平的影响,图,A,：各实验组再灌注,3 d,p-eNOS,蛋白表达；图,B,：各实验组再灌注,3 d,p-eNOS,蛋白表达统计图，,n=5,，*,p,0.05 VS.I/R,组；,#,p,0.05 VS.Vehicle2,组,A,B,小结,2,Genistein,后处理可诱导全脑缺血大鼠海马,CA1,区,eNOS,磷酸化水平升高，,eNOS,激酶抑制剂,L-NAME,可有效降低,GPC,诱导的,eNOS,磷酸化水平。,结果揭示：,eNOS,磷酸化水平升高参与了,Genistein,的神经保护作用。,Genistein,后处理是否能有效降低缺血再灌注后神经元的氧化应激损伤呢,?,4-HNE,是脂质过氧化的最终产物，被公认为氧化应激最稳定的标记物,8-OHdG,，是,DNA,氧化损伤的特异产物,图,4,全脑缺血再灌注,3 d,，各实验组大鼠,海马,CA1,区,4-HNE,及,8-OHdG,免疫荧光染色,GPC,I/R,A,B,GPC,I/R,图,A,：绿色,:,NeuN,；红色,:4-HNE,；图,B,：红色,:DAPI,；绿色,:8-OHdG,；,n=4-5,；,40,；,bar=50,m,小结,3,GPC,能有效降低氧化应激损伤；,eNOS,激酶抑制剂,L-NAME,废除了此神经保护作用。,Nrf2/ARE,信号是生物体内抗氧化应激反应最重要的内源性防御系统。那么，,GPC,是否通过,eNOS,诱导了此信号通路,?,图,5 A-C GPC,促进,大鼠海马,CA1,区,Nrf2,蛋白表达,图,A,：再灌注不同时间点核内,Nrf2,蛋白表达；图,B,：再灌注不同时间点核内,Nrf2,蛋白表达统计图，,n=4,，*,p,0.05 vs.I/R,组；图,C,：再灌注,3d,各实验组,Nrf2,蛋白的表达及统计图；*,p,0.001 vs.I/R,组，,#,p,0.001 vs.Vehicle2,组,A,C,B,图,5 D,免疫荧光染色法观察大鼠再灌注,3d,海马,CA1,区,神经元内,Nrf2,的表达及定位,绿色：,Nrf2,；红色,:,NeuN,；黄色：二者的共定位；,40,；,bar=30m.,L-NAME,图,6,大鼠再灌注,3d,海马,CA1,区神经元内,HO-1,蛋白表达,及其与,Nrf2,的共定位,B,图,A-B,：,HO-1,蛋白表达及其统计图；图,C,：,HO-1,与,Nrf2,蛋白的共定位，*,p,0.05 VS.I/R,组；,#,p,0.05 VS.vehicle2,组；绿色：,Nrf2,；红色：,HO-1,；蓝色：,DAPI,；合成图为三者的共定位；,40,；,n=4-5,；,bar=50m,；,C,L-NAME,I/R,Sham,GPC,Vehicle2,L-NAME,HO-1,NeuN,A,小结,4,GPC,可显著增加海马,CA1,区神经元胞核中,Nrf2,蛋白的表达并引起下游靶基因,HO-1,的表达，而,L-NAME,阻断了此作用。,此结果进一步揭示,GPC,通过,eNOS,诱导了,Nrf2/HO-1,抗氧化信号通路，从而阻断了缺血再灌注后迟发性神经元损伤。,海马是学习和记忆的重要部位，而海马,CA1,区是缺血最敏感的区域。,那么，,GPC,是否能改善大鼠缺血后空间学习记忆能力,?,图,7,GPC,对大鼠缺血后空间学习和记忆能力的影响,图,A-B,：潜伏实验和探索实验统计图；,n=5,；*,p,0.05,vs.I,/R,组；,#,p,0.05,vs.GPC,组,.,图,C-D,：潜伏实验和探索实验大鼠游泳路程轨迹图,D,C,A,B,小结,5,GPC,能有效的改善大鼠缺血后的空间学习和记忆能力。,四、总 结,1.GPC,对缺血性神经元损伤具有保护作用。,2.GPC,可通过诱导,eNOS,磷酸化水平并上调,Nrf2/HO-1,信号通路，从而降低脑缺血诱导的氧化应激损伤。,3.GPC,能有效改善大鼠短暂全脑缺血后的认知功能。,五、不足与展望,1.GPC,是否可增加,Nrf2,的,DNA,结合活性有待进一步研究。,2.GPC,是否也触发了其它促生存信号转导通路（如雌激素受体信号），从而起到抗缺血性神经元损伤的作用。其确切的机制还有待多层面、多角度的进一步探究。,谢 谢！,