DNA的提取与鉴定.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,专题,5,DNA,和蛋白质技术,课题,1,DNA,的粗提取和鉴定,讨论,2,：如何证明他们是遗传物质？,讨论,3,：怎样才能将细胞内的这些物质分离出来？,讨论,1,：构成生物体的遗传物质是什么？,1,、提取生物大分子的基本思路,选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子,2,、生物大分子,主要指蛋白质、酶和核酸,3,、提取,DNA,的基本思路,利用,DNA,与,RNA,、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取,DNA,，去除其他成分,基础知识,提取,DNA,的方法,4,、,DNA,的溶解性,DNA,和蛋白质等其他成分在不同浓度的,NaCl,溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使,DNA,充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反,根据,DNA,在,NaCl,溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，,DNA,的溶解度最小？,DNA,在,NaCl,溶液中的溶解度是如何变化的,？,在,NaCl,溶液浓度低于,0.14 mol/L,时，,DNA,的溶解度随,NaCl,溶液浓度的增加而逐渐降低；在,0.14 mol/L,时，,DNA,溶解度最小；当,NaCl,溶液浓度继续增加时，,DNA,的溶解度又逐渐增大。,如何通过控制,NaCl,溶液的浓度使,DNA,在盐溶液中溶解或析出？,当氯化钠的物质的量浓度为,2 mol,L,时，,DNA,的溶解度最大，浓度为,0,14 mol,L,时，,DNA,的溶解度最低。利用这一原理，可以使,DNA,在盐溶液中溶解或析出,6,、,DNA,在酒精溶液中的溶解性,DNA,不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将,DNA,与蛋白质进一步分离,7,、,DNA,对酶、高温和洗涤剂的耐受性,蛋白酶能水解蛋白质，但是对,DNA,没有影响,大多数蛋白质不能忍受,60,80,C,的高温，而,DNA,在,80,C,以上才会变性,洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对,DNA,没有影响,8,、,DNA,的,鉴定,DNA,与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定,DNA,的试剂,甲基绿（蓝绿色）,（一）实验材料的选取,1,、材料：,鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取,2,3,种实验材料,）,2,、原则：,凡是含有,DNA,的生物材料都可以考虑，但选用,DNA,含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大,实验设计,（二）破碎细胞，获取含,DNA,的滤液,1,、动物,细胞,动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可,答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂,(,细胞膜和核膜的破裂,),，从而释放出,DNA,讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？,2,、植物细胞,植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜,讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？,答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于,DNA,的释放；食盐的主要成分是,NaCl,，有利于,DNA,的溶解,实例：提取洋葱,DNA,时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液,讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？,答：研磨不充分会使细胞核内的,DNA,释放不完全，提取的,DNA,量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等,（三）去除滤液中的杂质,为了纯化提取的,DNA,需要将滤液作进一步处理,讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？,答：可能含有核蛋白、多糖和,RNA,等杂质,答：用高盐浓度的溶液溶解,DNA,，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使,DNA,析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出,DNA,，就能够除去与,DNA,溶解度不同的多种杂质,为什么反复地溶解与析出,DNA,，能够去除杂质,?,答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的,DNA,与蛋白质分开；方案三利用的是,DNA,和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与,DNA,分离,讨论：方案二与方案三的原理有什么,不同,?,（四）,DNA,的析出与鉴定,1,、,DNA,的,析出,DNA,的析出用的是与滤液体积相等的,冷却的酒精溶液（体积分数为,95,），静置,2,3min,，溶液中会出现,白色丝状物，,这就是粗提取,DNA,。用玻璃棒沿,一个方向,搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水,2,、,DNA,的,鉴定,鉴定,DNA,时在试管中先加入物质的量的浓度为,2mol/L,的,NaCl,溶液,5ml,于两只试管中，其中一只加入,DNA,丝状物，各加入二苯胺,4ml,试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热,5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有,DNA,的溶液是否有蓝色,操作提示,1,、以血液为实验材料时，每,100ml,血液中需要加入,3g,柠檬酸钠，防止血液凝固。,2,、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧,DNA,分子的断裂，导致,DNA,分子不能形成絮状沉淀。,3,、二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。,二苯胺试剂的配制,称取,1.5g,二苯胺，溶于,100ml,冰醋酸中，再加入,1.5ml,浓硫酸，用棕色瓶保存。临用前，在,10ml,的上述溶液中再加入,0.1ml,体积分数为,0.2%,的乙醛溶液。,1.,制鸡血细胞液（活鸡鲜血经分离或沉淀获得）,0.1,g/mL,柠檬酸钠,100,mL,活鸡鲜血,180mL,500mL,烧杯中，玻棒,搅拌,，离心、分离或静置沉淀。,2.,提取,DNA,。,取血细胞,5-10mL,20mL,蒸馏水，用玻棒沿一个方向,快速搅拌,。,纱布,过滤,：滤液中含,DNA,和其他核物质，如蛋白质。,.,提取,血,细胞核物质：,.,溶解核内的,DNA,：,滤液,2mol/L,的,NaCl,溶液,40mL,，玻棒沿一个方向,轻缓搅拌,。,三、实验步骤,.,析出,含,DNA,的粘稠物：,.,滤取含,DNA,的粘稠物：,.DNA,粘稠物的再溶解：,在上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并沿一个方向,轻轻搅拌,，出现丝状物；当丝状物不在增加时，停止加水（此时,NaCl,溶液的浓度相当于,0.14mol/L,）。,用多层纱布,过滤,，含,DNA,的粘稠物留在纱布上。,20mL2mol/L,的,NaCl,溶液,步骤含,DNA,的粘稠物,在,20mL,烧杯中,轻缓搅拌,3,min,，使尽可能多的,DNA,溶解在,NaCl,溶液。,.,过滤含有,DNA,的,NaCl,溶液：,用放有两层纱布的漏斗,过滤,步骤所得的溶液，滤液中含有,DNA,。,.,提取含有杂质较少的,DNA,：,步骤所得的滤液体积分数为,95%,的冷却酒精,50mL,，用玻棒沿一个方向,轻缓搅拌,，溶液中（,析出,）出现乳白色丝状物，用玻棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。,3.DNA,的鉴定：,加入二苯胺试剂,4mL,，用玻棒,搅拌,使,DNA,溶解，沸水浴,5min,，观察溶液是否出现浅蓝色。,1.,共有“,三次过滤，两次析出，七次搅拌,”,2.,加入“,两次蒸馏水，,三次,NaCl,溶液,，一次酒精,”,三、实验小结,四、实验原理拓展介绍。,1.DNA,的释放。,DNA,主要在鸡血细胞的细胞核内，正常情况下不会释放出来，蒸馏水对于鸡血细胞是一种低渗液，水分可以大量进入血细胞，使之胀破，同时加上玻璃棒快速搅拌的机械作用，加速血细胞的细胞膜和核膜的破裂。但,释放出来的大量,DNA,与,RNA,、蛋白质结合在一起，即释放的不是纯净的,DNA,，常称为,DNA,核蛋白,。,2.DNA,与蛋白质分离。,在高浓度（,2mol/L,）的氯化钠溶液中，核蛋白易溶解，析出,DNA,并溶解在高浓度的氯化钠溶液中,3.DNA,的析出与获取。,因为,DNA,在低浓度（,0.14mol/L,）的氯化钠溶液中溶解度小，而蛋白质的在其中的溶解度大,。所以在向含,DNA,的高浓度的氯化钠溶液中加入大量蒸馏水稀释氯化钠溶液，从而使,DNA,溶解度下降，蛋白质溶解度增高。,4.DNA,的再溶解。,用高浓度（,2mol/L,）的氯化钠溶液再溶解,DNA,粘稠物。,5.DNA,的沉淀和浓缩。,对于除去了蛋白质的,DNA,的氯化钠溶液，必须再进一步沉淀和浓缩，常用,酒精沉淀法,。即往,含有,Na,的,DNA,溶液，加入体积分数为,95%,的冷却酒精，混匀后可以使,DNA,沉淀、浓缩，形成含杂质较少的,DNA,丝状物,，悬浮于溶液中。若丝状物较少，可将混合液再放入冰箱中冷却几分钟即可。浓缩后的,DNA,丝状物可以用玻棒（玻棒有吸附,DNA,的作用）缓缓旋转的方法卷起。,6.DNA,的鉴定。,100,DNA,二苯胺 蓝色物,鉴定时蓝色的深浅与溶液中,DNA,的含量多少有关。,方法步骤,加入物质,目的,1,.,制备鸡血细胞液,柠檬酸钠溶液,2,.,提取鸡血细胞细胞核物质,20 m1,蒸馏水,3,.,溶解细胞核内的,DNA,2 m1,L,的,NaCI,溶液,40,mL,幻灯片,17,4,.,析出含,DNA,的黏稠物,蒸馏水,5,.,滤取含,DNA,的黏稠物,6,.,将,DNA,的黏稠物再溶解,2 mol,L,的,NaCl,溶液,20,mL,7,.,过滤含,DNA,的,NaC,l,溶液,8,.,提取含有杂质较少的,DNA,冷却的,95,的酒精,50,mL,A,:,(1),向试管中加入,0,.,015 mol,L,的,NaCl,溶液,5,mL,(2),加入,DNA,(3)4,mL,二苯胺试剂,9,.,DNA,的鉴定,B,:,(1),向试管中加入,0,.,015mol,L,的,NaCl,溶液,5,mL,(2)4 m,L,二苯胺试剂,加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固,加速血细胞破裂,溶解,DNA,使,2mol/L,的,NaCl,溶液稀释至,0.14mol/L,使得,DNA,最大限度地释出,使含,DNA,的黏稠物被留在纱布上,使含,DNA,的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中,除去含,DNA,的滤液中的杂质,提取,DNA,A,出现蓝色,B,无变化,课题延伸,本课题使用的洗涤剂是多组分的混合物，在严格的科学实验中很少使用。实验室提取高纯度的,DNA,时，通常使用十六烷基三甲基溴化铵（,CTAB,）、十二烷基硫酸钠（,SDS,）或吐温等化学试剂。,2.,实验中,NaCl,的物质的量浓度为,2 mol,L,和,0.14 mol,L,对,DNA,有何影响,?,1.,在,DNA,的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是,(),。,A.,稀释血液、冲洗样品,B.,使血细胞破裂、降低,NaCl,浓度使,DNA,析出,C.,使血细胞破裂、增大,DNA,溶解量,D.,使血细胞破裂、提取含杂质较少的,DNA,答：,B,答：,前者是溶解,DNA,，,后者是使,DNA,析出,3.DNA,遇二苯胺,(,沸水浴,),会染成,(),A.,砖红色,B.,橘黄色,C.,紫色,D.,蓝色,4.,提取鸡血中的,DNA,时，为什么要除去血液,中的上清液,?,答：,DNA,的提取，关键是对杂质的去除，由于上清液是血液中的血浆部分，不含,DNA,，,所以要除去上清液,(,含有蛋白质,),。,答：,D,5.,关于,DNA,粗提取的实验材料的选择，也经过了多次实验效果的比较，最终选择鸡血做实验材料的原因是什么？请回答下列问题：,（,1,）鸡血细胞中红细胞含有细胞核，家鸡属于鸟类，新陈代谢旺盛，因而血液中,细胞数目较多，可以提供丰富的,。,（,2,）实验前由老师制备血细胞液供同学们做实验材料，而不用鸡全血，主要原因是,。,（,3,）生活在牧区的人们，采集牛、羊和马血比较方便，若他们按实验要求完成实验步骤后，结果是,，这是因为这些动物和人一样，成熟的红细胞中无细胞核，若改用动物肝脏做实验材料，实验能顺利进行。这是因为,。（,4,）若选用动物肝脏做实验材料，在提取之前，最好增加什么,程序，使组织细胞更易分离。,