临床细菌培养鉴定流程及报告.ppt

临床床细菌培养菌培养鉴定常定常规报告流程告流程1.思考题v1、血培养阳性结果如何分级报告？v2、如何根据尿液菌落计数分析尿培养结果是感染还是污染？2.医学微生物医学微生物实验室基本条件及室基本条件及设备医学微生物学医学微生物学检验的基本技的基本技术 临床各种床各种标本的采集、分离培养及本的采集、分离培养及报告方式告方式临床常床常见细菌的分离菌的分离鉴定定3.一、医学微生物一、医学微生物实验室基本条件及室基本条件及设备细菌实验室无菌实验室基本设备4.细菌菌实验室室细菌实验室是细菌检验的场所，在此完成标本接种、孵育、分离、细菌鉴定和药物敏感试验。所以细菌实验室必须具备空气及桌面消毒的条件，确保室内相对无菌。如：足够强度的紫外线灯管，耐酸碱的桌面等。5.无菌无菌实验室室无菌实验室仅限于制备、分装无菌培养基的操作，不进行有菌标本的分离及其它操作。无菌室应达到绝对无菌的标准，使用的前后均应严格消毒灭菌（一般均为紫外线照射），仅限操作人员进入，操作时应严格关门。6.基本基本设备生物安全柜孵育温箱（有条件的要有二氧化碳培养箱）显微镜接种器具冰箱、冰柜高压灭菌设备火焰灯7.二、医学微生物学二、医学微生物学检验的基本技的基本技术基本染色基本接种方法8.基本染色基本染色主要用于形态学检查，因为形态学检查是鉴定细菌的重要手段，有助于细菌的初步鉴别，也是决定采用何种生化鉴定的重要提示。有时通过形态学检查可得到初步诊断，如痰中的抗酸杆菌和泌尿生殖器官分泌物中的淋病柰瑟菌等，染色方法主要有革兰氏染色法，抗酸染色法，鞭毛染色法，异染颗粒染色法，墨汁荚膜染色法等。9.基本接种方法基本接种方法曲线划线法（又称连续划线法）、分区划线法、棋盘格划线法、倾注平板法、斜面接种法、穿刺培养法、液体培养基接种法等。10.三、三、临床各种床各种标本的采集、分离培养及本的采集、分离培养及报告方式告方式血（适用胸腹水）痰尿便脓11.（一）（一）（一）（一）血血 当微生物侵入血液迅速繁殖超出免疫系当微生物侵入血液迅速繁殖超出免疫系统统清除清除这这些微生物的能力些微生物的能力时时形成菌血症或真菌血症。形成菌血症或真菌血症。1.1.血培养中常血培养中常血培养中常血培养中常见见的分离菌的分离菌的分离菌的分离菌革革兰氏阳性菌氏阳性菌金黄色葡萄球菌凝固酶阴性葡萄球菌肺炎链球菌A群B群链球菌肠球菌革革兰氏阴性菌氏阴性菌大肠杆菌肺炎克雷伯菌阴沟肠杆菌产气肠杆菌伤寒沙门菌绿脓杆菌鲍曼不动杆菌12.2.标本的采集与运送本的采集与运送采血指征一般患者出现以下体症时可作为采血的重要指征：发热（38）或低温（36）、寒战、白细胞增多（计数10000109/L），特别有“核左移”未成熟的或杆状核白细胞，皮肤黏膜出血，昏迷，多器官衰竭，血压降低，CRP升高及呼吸快，特殊患者（如血液病）出现粒细胞减少，（成熟的多形核细胞1000109/L）血小板减少等，或同时具备上述几种体征时而临床可疑菌血症应采集血培养。新生儿菌血症应该增加尿液和脑脊液培养。最好在感染患者未进行系统性抗菌药物治疗之前及时采集血培养。13.采血时间及采血量采血培养应该尽量在使用抗菌药之前进行，在24小时内采集23份血培养（一次静脉采血注入到多个培养瓶中应视为单份血培养）。对间歇性寒战或发热应在寒战或体温高峰到来之前0.51小时，采集血液，或于寒战或发热后1小时进行。成人采血量810ml，儿童15ml。血液和肉汤之比1：51：10。14.标本运送采血后应立即送检，如不能立即送检，需室温保存或置3537孵箱中，切勿冷藏。自动化连续检测系统虽有允许延迟上机检测微生物生长的原理，还是应该尽量减少延迟上机时间。15.3.分离培养分离培养血培养操作过程中应注意生物安全防护。血培养瓶处理传统手工法血培养每天至少检查一次，注意微生物生长可视信号，应无菌抽取培养物，涂片革兰氏染色，选择合适的培养基转种，同时做药敏试验。培养基的选择一般革兰氏阳性菌选血琼脂，革兰氏阴性球菌选血琼脂、巧克力琼脂，革兰氏阴性杆菌再加一个中国兰或麦康凯培养基，真菌需转种于真菌培养基。根据生长情况，挑取纯菌落进行进一步鉴定。16.4.结果果报告告阳性结果报告初初级报告：告：阳性血培养结果非常重要，应该立即口头报告给医生，包括革兰氏染色特性和形态，疑似何种菌等。同时记录报告日期、时间、内容以及接受报告人的姓名。中中级报告：告：报告直接抗菌药物敏感试验结果和细菌种属的初步鉴定结果。最最终报告：告：报告细菌种属名和标准抗菌药物敏感试验结果。阴性结果报告普通血培养3天无菌生长可报告为“72小时培养未见细菌生长”但培养瓶要继续培养至7天，如果发现有菌生长，可发补充报告，某些特殊致病菌培养时间需延长。17.（二）痰（即下呼吸道感染（二）痰（即下呼吸道感染标本）本）临床通常将正常人喉以上部位称为上呼吸道，上呼吸道定植有大量的正常菌群，而气管以下包括气管、支气管和肺泡称下呼吸道，通常无菌。下呼吸道感染包括急性气管支气管炎、慢性支气管炎急性发作，支气管扩张继发感染及肺实质感染（肺炎、肺脓肿）等。病原体有细菌、病毒、衣原体、支原体、真菌、立克次氏体和原虫等。下呼吸道感染者可有发热、咳嗽和咳痰，痰呈脓性、粘稠或血性，是下呼吸道感染细菌检查的主要标本。细菌学检验能明确感染病原，并提供有关抗菌药物对分离菌的抗菌活性，有助于疾病的治疗、流行病学调查研究和医院感染的监测。18.1.1.呼吸道呼吸道呼吸道呼吸道标标本本本本(痰痰痰痰)中常中常中常中常见见的分离的分离的分离的分离细细菌菌菌菌革革兰氏阳性菌氏阳性菌草绿色链球菌，肺炎链球菌，化脓性链球菌表皮葡萄球菌,金黄色葡萄球菌,其他葡萄球菌微球菌，消化链球菌，消化球菌肠球菌真杆菌，丙酸杆菌，乳酸杆菌放线菌，奴卡苗，结核分枝杆菌白喉棒状杆菌，类白喉棒状杆菌念珠菌革革兰氏阴性菌氏阴性菌韦荣球菌脑膜炎奈瑟菌，其他奈瑟菌卡他莫拉菌肺炎克雷伯菌及其他克雷伯菌沙雷菌，变形杆菌大肠埃希氏菌及其他肠杆菌科细菌百日咳鲍特菌，不动杆菌铜绿假单胞菌及其他假单胞菌属细菌嗜肺军团菌，气单胞菌流感嗜血杆菌，付流感嗜血杆菌拟杆菌，梭杆菌19.2.标本采集及运送本采集及运送对可疑烈性呼吸道传染病(如SARS，肺炭疽，肺鼠疫等)的患者采集痰标本时必须注意生物安全防护。自然咳痰法（最常用的方法）：以晨痰为佳，采集标本前应用清水、冷开水漱口或牙刷清洁口腔和牙齿。尽可能在使用抗菌药物之前采集标本，用力咳出呼吸道深部的痰，痰液直接吐入无菌、清洁、干燥、不渗漏、不吸水的广口带盖的容器中，标本量要1ml。标本要尽快送检，不能及时送检的标本室温保存2小时。20.支气管镜采集法、防污染毛刷采集法、环甲膜穿刺经气管吸引法、经胸壁针穿刺吸引法和支气管肺泡灌洗法，均由临床医生按照相应操作规程采集，但必须注意所采集标本尽可能避免咽喉部正常菌群的污染。小儿取痰法：用弯压舌板向后压舌，将拭子伸入咽部，小儿经压舌刺激咳嗽时，可喷出肺部或气管分泌物粘在拭子上送检。21.分离培养分离培养(1)痰标本培养前处理：不含或粘液很少的标本可直接接种，遇有含大量粘液的标本，应加入等量的液化剂（如PH7.6的10g/L胰酶溶液等），放置35待充分液化再行接种。亦可加液化剂后搅拌混匀离心，取沉淀物接种。一般细菌分离培养：将处理后的痰标本分别划区接种于血平板(适用于分离肺炎链球菌和其他细菌),巧克力平板(适用于分离嗜血杆菌)和麦康凯/中国兰平板。巧克力平板需置5%二氧化碳环境（无二氧化碳培养箱可用烛缸），35培养24小时后观察菌落形态，涂片染色，挑取可疑纯菌落，做进一步鉴定。22.结果分析及果分析及报告告结果分析痰及下呼吸道分泌物标本易受到定植在上呼吸道的正常菌群污染。当从送检标本中分离出多种细菌时，确定那一种分离细菌是引起下呼吸道感染的病原菌，这对临床诊断与治疗至关重要。当在同一培养基上分离出1种以上的病原菌（复合菌）时，要结合患者的临床症状，涂片染色镜检情况及患者近期细菌分离培养结果等，综合判断所分离的多种细菌中那一种细菌可能为致病菌，通常多为优势菌。当分离的优势菌与涂片染色镜检结果一致时，要做药敏试验。若分离培养结果与涂片染色镜检结果不一致时，可不进行药敏试验，以免误导，仅报告分离鉴定结果，由临床大夫定夺是否重试。23.报告方式由于检验结果报告的时效性，下呼吸道标本细菌学检验结果分为初步和最终结果报告。初步初步报告：告：当标本涂片革兰氏染色细胞学和细菌学镜检发现有临床诊断意义的结果时，应及时发出描述性的初步报告。最最终报告：告：镜检结果与分离培养结果相一致时，最终报告规范的细菌名称和药敏试验结果。若分离培养结果与镜检结果不一致时，仅报告分离鉴定结果，不做药敏试验。若分离培养未检出优势菌，可报“未培养出病原菌”。24.(三三)尿尿尿路感染是指尿道内有大量微生物繁殖而引起的尿路炎症。从肾脏排泌出来的尿液正常情况下是无菌的，如果在尿液中分离出细菌（排除污染因素）即为菌尿，同时伴有感染症状者称为尿路感染。根据感染部位可分为上尿路感染（肾盂肾炎）及下尿路感染（膀胱炎），男性还可出现前列腺炎。25.1.尿中常尿中常见分离菌分离菌革革兰氏阳性菌氏阳性菌金黄色葡萄球菌血浆凝固酶阴性葡萄球菌肠球菌A群链球菌结核分支杆菌念珠菌革革兰阴性菌阴性菌大肠埃希菌克雷伯菌属变形杆菌属淋病奈瑟氏菌肠杆菌属假单胞菌属罗威登菌属沙雷菌属不动杆菌属假单胞菌属26.标本的采集与运送本的采集与运送尿培养检查的临床指征(有下列情况之一者，应进行尿培养）a.有典型的尿路感染症状b.有肉眼脓尿或血尿c.尿常规白细胞和/或亚硝酸盐阳性d.不明原因的发热而无其他局部症状e.留置导尿管的病人出现发热f.膀胱排空功能受损g.泌尿系统疾病手术前27.(2)标本采集a.清洁中段尿最好是晨尿，是临床上最常留取尿标本的方法b.耻骨上膀胱穿刺法是评估膀胱内细菌感染的“金标准”c.直接导尿法d.小儿收集包e.留置导尿28.(3)标本运送标本采集后应及时送检，2小时内进行接种，否则应置48冰箱保存，冷藏保存标本时间不得超过8小时。29.3分离培养分离培养一般培养:用定量接种环或无菌微量加样器取尿液0.001ml或0.01ml(已使用抗生素患者),接种于血平板和麦康凯/中国兰平板,不能定量时需用倾碟法记数，3537培养1824小时。(2)特殊培养:对临床要求真菌、淋病奈瑟菌及结核菌等培养者，根据细菌所需条件接种相应特殊培养基，放置相应条件下进行培养。30.4结果分析及果分析及报告告结果分析:一般单种细菌菌落数105cfu/ml可能为感染，需要进一步鉴定和做药敏试验；104cfu/ml可能为污染；在两者之间需要根据病人的临床表现进行评估。对于导尿标本103cfu/ml即为感染；耻骨上膀胱穿刺标本任意数目即为感染，均需进一步鉴定和做药敏试验。31.(2)报告方式初步初步报告告：在分离出细菌后，进行革兰氏染色，作出初步报告。最最终报告：告：有意义的阳性结果报告，应报告菌落计数、细菌种名及药敏结果。无意无意义的阳性的阳性结果果报告，告，报告菌落数、革兰氏染色形态特征，并注明是纯培养或是混合菌生长。阴性阴性结果果报告告:应报告无菌生长和菌落计数1000cfu/ml或100cfu/ml尿。32.（四）（四）粪便便急性感染性腹泻可以由细菌、病毒及原虫引起，实验室常规检查是细菌培养。每种感染性腹泻的致病菌因其独特的致病机理而引起一系列不同的典型症状，这些症状和详细的病史能为诊断腹泻疾病类型提供依据。因此，为了查找腹泻病因，必须了解患者的病史即：症状、发病时间、年龄、旅游史、进食情况和使用抗菌素情况。33.致病菌能够破坏宿主的防御系统，其致病机理是细菌产生毒素和对人体组织的侵袭性，值得注意的是有些细菌既具有侵袭性又能产生毒素。抗生素治疗可以破坏宿主的正常菌群，导致某些细菌如艰难梭菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和念珠菌等过度生长，也可引起腹泻。沙门氏菌、志贺氏菌、气单胞菌和邻单胞菌应作为实验室常规培养的主要腹泻病原菌。34.1.粪便便标本中常本中常见的病原菌的病原菌革革兰氏阳性菌氏阳性菌革革兰氏阴性菌氏阴性菌金黄色葡萄球菌伤寒及其他沙门菌厌氧链球菌种志贺菌属结核分枝杆菌致病大畅埃希菌产气荚膜梭菌弧菌属菌种艰难梭菌气单胞菌和邻单胞菌小肠结肠炎耶尔森菌弯曲菌35.2标本的采集与运送本的采集与运送粪便培养检查的送检指征(出现以下任何一种情况时建议做粪便培养)a.粪便涂片镜检白细胞5/HPb.重症腹泻c.体温38.5d.血便e.便中有脓液f.未经抗菌药物治疗的持续性腹泻患者g.来自疫区的患者36.(2)标本采集a.标本采集尽可能在发病早期和使用抗菌药物治疗之前b.自然排便采集粪便标本时，取有脓血、粘液、组织碎片部分的粪便，液体粪便则取絮状物c.直肠拭子采集粪便标本，适用于排便困难患者和婴幼儿37.标本运送a.粪便标本应尽快送检，室温条件下不能超过2小时。如不能及时送检，可加入pH7.0的磷酸甘油或转运培养基，但不易超过24小时b.直肠拭子采集的标本必须置于适当的运送培养基内，转运时间不宜超过2小时c.高度怀疑霍乱弧菌感染的标本运送必须符合特殊标本的安全要求38.3.分离培养与分离培养与镜检粪便标本直接镜检找到大量多核白细胞，提示侵袭性致病菌感染。如果肠道菌群紊乱，革兰氏染色镜检结果可以提示是酵母菌还是葡萄球菌感染。39.腹泻病原菌常规培养腹泻病原菌种类繁多,实验室不可能对所有可能引起腹泻的病原菌都进行培养。为保证获得较高的检出率,可以对患者进行腹泻病原菌常规培养,包括沙门氏菌、志贺氏菌、气单胞菌、邻单胞菌、弧菌，也包括可引起菌群失调的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和酵母菌。粪便标本至少接种SS、中国兰等培养基，必要时加血平板，培养1824小时观察结果。40.(2)腹泻病原菌特殊培养根据所疑病原菌的生长要求,选择合适的选择培养基进行分离培养鉴定。41.4结果分析及果分析及报告告阳性阳性结果：果：报告细菌种名和药敏结果阴性阴性结果：果：常规细菌培养阴性应报告“未检出常规培养病原菌”特殊细菌培养阴性应报告“相应细菌阴性筛选结果”42.（五）（五）脓汁（病灶分泌物）汁（病灶分泌物）微生物存在于周围环镜中，也存在于皮肤、粘膜表面，它们通过破损的皮肤或粘膜进入通常无菌的组织引起感染，在一个或多个解剖部位形成小脓庖或包裹性脓肿。细菌和真菌（条件致病菌或致病菌）都可导致炎性渗出，渗出物由白细胞、入侵病原体、体液及纤维蛋白混合组成，即：脓汁。病毒感染很少出现脓性分泌物。43.1脓汁（含汁（含创伤分泌物）中常分泌物）中常见的病原菌的病原菌革革兰氏阳性菌氏阳性菌革革兰氏阴性菌氏阴性菌葡萄球菌肠杆菌科细菌链球菌假单胞菌消化链球菌腐败谢瓦纳拉菌炭疽芽胞杆菌拟杆菌破伤风芽胞梭菌梭杆菌产气荚膜梭菌嗜血杆菌溃疡棒状杆菌产碱杆菌结核分枝杆菌无色杆菌放线菌、奴卡菌弧菌属细菌念珠菌气单胞菌44.2标本采集与运送本采集与运送标本采集与运送脓肿包括闭合和开放性，即感染伤口、穿透伤口、术后伤口、烧伤及褥疮等。在采集脓汁标本前，用无菌生理盐水擦去表面分泌物以避免污染。开放性伤口尽量抽吸深部脓液，闭合性脓肿抽吸脓肿壁。若需要厌氧培养，最好进行床前接种迅速放入厌氧袋为好。(2)标本运送脓汁或厌氧袋，室温下2小时内，最长不超过24小时送达实验室。45.3分离培养与分离培养与镜检脓汁标本在培养的同时应涂片做革兰氏染色镜检，特殊情况或医生要求，需行直接镜检及抗酸染色镜检。革兰氏染色镜检有助于确定培养检查范围，评价标本质量。若见大量上皮细胞，则很可能为表皮污染，此时生长的菌落意义较小；大量多形核白细胞或吞噬细胞则提示有感染存在。46.根据镜检检查结果和/或感染部位，选择接种合适的培养基。所有脓汁或渗出液标本应至少接种三种培养基。营养血琼脂培养基：分离葡萄球菌及链球菌等。有条件最好置含510%二氧化碳环境中，3537孵育至少48小时。(2)选择培养基（麦康凯或伊红美蓝琼脂等）：分离革兰氏阴性杆菌。3537孵育至少48小时。营养肉汤管：如巯基乙酸盐肉汤或庖肉培养基，供需氧菌及厌氧菌生长，3537孵育，至少培养10天。47.4结果分析及果分析及报告告阴性阴性结果：果：培养48小时后，平皿和肉汤均无菌生长，报告“48小时无菌生长”。特殊原因，培养基放置更长时间仍无菌生长，报告为“X天无菌生长”。阳性阳性结果：果：根据鉴定及药敏试验结果报告。48.四、四、临床常床常见细菌的分离菌的分离鉴定定1形形态与培养特性与培养特性革兰氏染色：在生长有细菌的平皿上挑取可疑病原菌纯菌落涂片,革兰氏染色,在显微镜下观察细菌形态特征：球状、杆状、弧状等，识别是革兰氏阳性还是革兰氏阴性菌，确定下一步的鉴定路线。(2)氧化酶试验：对革兰氏阴性杆菌，首先要做氧化酶试验，区分是发酵菌还是非发酵菌。触酶试验：对革兰氏阳性球菌，要做触酶试验，区分是葡萄球菌还是链球菌。(4)凝固酶试验：区分凝固酶阳性葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌。49.上述四种基本试验，是临床常见细菌鉴定最基本的试验，也是为下一步选用合适鉴定系统最关键的试验，对细菌鉴定最终的准确性和少走弯路有着重要意义。50.2选用合适的用合适的鉴定系定系统细菌鉴定系统并非分类模式，尽管它们表面看来有些相似，对一群病原体的鉴定系统设计，基于一种或多种该群细菌都具备，而其他群细菌不具备的特征谱。用于该群鉴定的特性，通常不是用来分类，如分类用DNA或DNA杂交研究，而鉴定则基于与基因信息密切相关的表现型特征。常规鉴定试验应该选择方法学简单，反应判断明确，价廉等的试验鉴定系统。51.生化反应鉴定系统：根据上述原则和一些基本试验结果，选择相应的生化鉴定系统，按照厂商提供的图表、编码、计算机数据和鉴定概率等进行判读和鉴定，但要确保自己实验室条件和试验结果的可靠性。(2)血清学反应：血清学反应在细菌鉴定中常常有极大的作用，由于方法学上操作简单、快速，而且特异性高，它给一些细菌的准确鉴定提供了快速诊断方法。所以，血清学反应也是临床常见细菌鉴定较常用的鉴定方法。52.细菌鉴定错误的常见三个因素是形态、革兰氏染色反应和动力。大多数情况下，分离鉴定到属级水平不会发生困难，而明确至种和亚种，则需要我们检验人员有着扎实的理论基础和丰富的实践经验。由于微生物检验的特殊性，它对检验人员的理论基础及实践经验有着较高的要求。因此，对从事微生物检验的工作人员，不仅要经常学习更换知识，而且还要做到相对固定，这样对他们经验的积累有着重要作用。知识水平有限，难免有讲的不对的地方，望同道批评指正。53.54.4/18/202455.