微生物学chap4-微生物的营养和培养基.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章 微生物的营养,与培养基,营养,(nutrition),：生物体从外部环境中摄取对其生命活动必须的能量和物质，以满足正常生长和繁殖需要的一种最基本的生理功能。,营养物,(nutrient),：具有营养功能的物质。,营养物提供生命活动的结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境。,一些微生物可利用非物质形式的能源,光能。,一、细胞化学组成,整个生物界大体相同，主要是,C,、,H,、,O,、,N,（占干重,9097%,），,C,占约,50%,，此外为各种无机元素，由这些元素再组成化合物。其中,C/N,一般是,5:1,。,第一节,微生物的六种营养要素,元素,大量元素：碳、氢、氧、氮、磷、硫,其他元素：钾、钠、钙、镁、铁、锰、铜、,钴、锌、钼等,存在方式,有机物：蛋白质、糖、,类,脂、核酸、维生素、降解产物、代谢中间产物,无机盐灰分,水,细胞湿重的,70%90%,一般生物能利用的，微生物能利用；,一般生物不能利用的，微生物也能利用；,对一般生物有害的，微生物还能利用,。,微生物是杂食性的：,二、主要营养物及其功能,碳源（Carbon source）,氮源（Nitrogen source),能源（Energy source),生长因子（Growth factor),无机盐(Inorganic salt),水(Water),六种营养要素,参与微生物细胞的组成,提供微生物机体进行各种生理活动所需的能量,形成微生物代谢产物的来源,功能:,营养物质是微生物新陈代谢和一切生命活动的物质基础，失去这个基础，生命也就停止。,糖类：葡萄糖，果糖，麦芽糖，蔗糖，淀粉，半乳糖，乳糖，甘露糖，纤维二糖，纤维素，半纤维素，甲壳素，木质素，等,有机酸：乳酸，柠檬酸，延胡索酸，低级脂肪酸，高级脂肪酸，氨基酸，等,醇类：乙醇，等,脂类：脂肪，磷脂，等,烃类：天然气，石油，石油馏分，石蜡油，等,CO,2,碳酸盐：NaHCO,3,CaCO,3,白垩，等,其他：芳香族化合物，氰化物，蛋白质，肽，核酸,微生物可利用的碳源(化合物分类),(,),单功能：辐射能,双功能：还原态无机养料，如,NH,4,+,既是硝酸盐细菌的能 源，又是氮源,三功能：,N,C,H,O,类营养物质常是异养微生物的能 源，碳源兼氮源,一种营养物具有一种以上营养要素的功能,培养基中生长因子来源：,酵母膏、玉米浆、麦芽汁等。,作用：辅酶或酶活化,所需,。,维生素,微生物的种,硫胺素(B,1,),Bacillus anthracis,(炭疽芽孢杆菌),核黄素,Clostridium tetani,(破伤风梭菌),烟酸,Brucella abortus,(流产布鲁氏杆菌),吡哆酸(B,6,),Lactobacillus spp.,(各种乳酸杆菌),生物素,Leuconostoc mesenteroides,(肠膜状明串珠菌),泛酸,Proteus morganii,(摩氏变形杆菌),叶酸,Leuconostoc dextranicum,(葡聚糖明串珠菌),钴胺酸(B,12,),Lactobacillus spp.,维生素K,Bacteroides melaninogenicus,(产黑素拟杆菌),若干细菌所需要的维生素,（五）无机盐(inorganic salts),所需浓度在,10,-3,-10,-4,M,的元素为大量元素,所需浓度在,10,-6,-10,-8,M,的元素为微量元素,无机盐的生理功能,无机盐,大量元素,微量元素,一般功能,特殊功能,细胞内一般分子成分(P、S、Ca、Mg、Fe等),生理调节物质,渗透压的维持(Na,+,等),酶的激活剂(Mg等),pH的稳定,化能自养菌的能源(S,、,Fe,2+,、,NH,4,+,、,MO,2,-,等,),无氧呼吸时的氢受体(NO,3,-,、,SO,4,2-,等,),酶的激活剂(Cu,2+,、,Mn,2+,、,Zn,2+,等,),特殊分子结构成分(Co、Mo等),MnSO4过（超）氧化物歧化酶（SOD）的辅因子,Co Vit B12复合成分，肽酶的辅因子,Mo固氮酶及同化型、异化型硝酸盐还原酶的成分,生理作用：,细胞组成成分,生化反应溶剂,维持各种生物大分子的稳定性，参与某些重要的,生化反应,物质运输媒体,调节细胞温度,维持细胞的渗透压,（六）水,存在状态：游离态（溶剂）和结合态（结构组成）,依碳源不同：,异养型,(,heterotrophs,):,不能以,CO,2,为主要或唯一碳源,自养型,(,autotrophs,):,能以,CO,2,为主要或唯一碳源,第二节 微生物营养类型,依能源不同：,光能营养型,(,phototrophs,):,光反应产能,化能营养型,(,chemotrophs,):,物质氧化产能,依氢供体不同,：,有机营养型,(,heterotrophs,):,以有机物为供氢体,无机营养型,(,autotrophs,):,以无机物为供氢体,微生物的营养类型,营养类型,能 源,碳源,实例,光能无机营养型,（光能自养型）,光能,CO,2,蓝细菌,紫硫细菌,绿硫细菌,藻类,光能有机营养型,（光能异养型）,光能,CO,2,及,简单有机物,红螺细菌,化能无机营养型,（化能自养型）,无机物,CO,2,硝化细菌,硫化细菌,铁细菌,氢细菌,化能有机营养型,（化能异养型）,有机物,有机物,绝大多数微生物，,原生动物,氢供体,无机物,有机物,无机物,有机物,在营养物质运送方面，细胞壁仅简单地排阻分子量过大,(600Da),的溶质进入,而具有磷脂双分子层和嵌合蛋白分子的细胞膜则是控制营养物质进入和排除的主要屏障。,依靠胞内外溶液浓度差，顺浓度梯度运输；,不消耗代谢能，无特异性；,运输氧、二氧化碳、甘油、乙醇、某些氨基酸等小分子；,促进扩散示意图,胞外,细胞膜,胞内,单纯扩散,促进扩散,浓度梯度,运输速率,单纯扩散和促进扩散的比较,单纯扩散随浓度增加而线性增加，而促进扩散在一定浓度后出现平台,单纯扩散、促进扩散、主动运输,：,被运输的溶质分子不发生改变。,特点：,是微生物吸收营养的主要方式,可逆浓度梯度运输，耗能,需载体蛋白，有特异性,运输,有机离子、无机离子、氨基酸、乳糖等糖类,特异性载体蛋白需要能量来改变载体蛋白的构象（亲和力改变蛋白构象改变耗能）,Group translocation,培养基(medium，culture medium)：是一种人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合养料。,第四节 培养基,一、定义,（一）四个原则,1、,目的明确,（根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基）培养什么微生物、获得什么产物、用途,二、选择和配制培养基的原则和方法,2、,营养协调,营养协调(注意营养物的浓度和配比，特别是碳氮比C/N比),C/N,比,:,微生物培养基中所含的碳源中的碳原子与氮源中氮原子的摩尔数之比。不是简单的某碳源的重量与氮源的重量之比。因为，不同种类的碳源和氮源，其中含碳量和含氮量差别很大。,一般培养基的,C/N,比为,100/0.52,。,以含氮量来看：,NH,3,(82%)CO(NH,2,),2,(46%)NH,4,NO,3,(35%)(NH,4,),2,CO,3,(29.2%)(NH,4,),2,SO,4,(21%),适宜营养物质的选择,种类,举例,说明,单糖,葡萄糖，麦芽糖，果糖，麦芽糖，半乳糖，木糖,用作速效碳源，但会加速菌体呼吸，溶氧下降中间代谢物积累,二糖,蔗糖，乳糖,用作速效碳源，但会加速菌体呼吸，溶氧下降中间代谢物积累,多糖,淀粉，玉米粉，纤维素,迟效碳源。纤维素只有少数微生物能够作为碳源。,糖蜜,甜菜糖蜜，甘蔗糖蜜,是非常好的碳源，成分复杂，在发酵工业中常用酵母发酵、抗生素和丙酮丁醇生产常用它为碳源。一般包括蔗糖35%，葡萄糖9%，果糖7%，8种其它糖类4%，其它还原物质3%，24种氨基酸占4.5%，有机酸5%，蜡质、甾醇和磷脂占0.4%，灰分12%，水20%。,麦芽,发芽的大麦,主要培养酵母用，工业上用麦芽汁发酵，制作啤酒。,油脂,棉籽油，玉米油，豆油，葵花籽油等。,热值高，液体培养时消耗氧气多。在工业上常常少量添加作为消泡剂使用。,醇类,甲醇，甘油,甲醇被用来培养酵母。,烃类,CH,4,，C,2,H,6,，C,4,H,10,，C12C20烷烃,热值高，液体培养时消耗氧气多。溶解性不好，液体培养对搅拌要求高。,有机酸,乙酸，乳酸，柠檬酸等,利用会导致pH上升,常见微生物氮源,种类,可以利用的微生物,特点,有机氮源：牛肉浸膏、酵母浸膏、花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、麦麸、尿素等,大部分微生物，如青霉，酵母，大肠杆菌。,含有丰富的氨基酸，是微生物的优良氮源。,无机氮源：铵盐、硝酸盐、氨水等,部分微生物（氨基酸异养型不能利用）,硝酸盐要还原后才能用，可以同时调节pH。,N,2,少数细菌（约50多个属，100多种）,生物固氮是地球上仅次于光合作用的第二个重要的生物化学反应。,常用的培养基中的无机盐及参考浓度（g/L）,无机盐,提供的元素,参考浓度,培养基名称,MgSO,4,Mg,0.5,察氏培养基,KH,2,PO,4,/K,2,HPO,4,K，P,0.12/1.0,克氏培养基,KCl,K,0.5,察氏培养基,NaCl,Na,5,牛肉膏蛋白胨培养基,CuSO,4,5H,2,O,Cu,0.016,氧化硫酸杆菌培养液,ZnSO,4,7H,2,O,Zn,0.22,氧化硫酸杆菌培养液,FeSO,4,Fe,0.01,察氏培养基,CaCl,2,2H,2,O,Ca,0.25,氧化硫酸杆菌培养液,NaHCO,3,Na,0.1,蓝细菌培养基,MnCl,2,4H,2,O,Mn,0.05,氧化硫酸杆菌培养液,（NH,4,）,6,Mo,7,O,24,4H,2,O,Mo,0.01,氧化硫酸杆菌培养液,pH,渗透压和水活度,氧化还原电位,3、,物理化学条件适宜:,细菌,:pH7.08.0,放线菌：,pH7.0 8.5,酵母菌,:pH3.86.0,霉菌：,pH4.06.0,(1)pH：微生物有最佳生长pH,微生物在生长过程中培养基pH值可能发生的变化：,在含糖基质上生长,会产酸而使,pH,下降，,在分解蛋白质和氨基酸时,会产,NH,3,而使,pH,上升，,以,(NH,4,),2,SO,4,作,N,源,会过剩,SO,4,2-,而使,pH,下降，,分解利用阳离子化合物如：,NaNO,3,会过剩,Na+,而使,pH,上升。,维持培养基pH的方法,使用磷酸缓冲剂：,K,2,HPO,4,/KH,2,PO,4,采用“备用碱”：CaCO,3,、,CaHCO,3,采用弱酸盐：柠檬酸盐、乳酸盐等,采用液氨或盐酸,渗透压(osmotic pressure):高浓度溶液向低浓度溶液渗透时，其溶质分子所产生的压力。,高渗溶液会导致微生物细胞发生质壁分离,低渗溶液会导致微生物细胞吸水膨胀甚至破裂,(2),水的可利用性,用水活度,(water activity,aw),表示,a,w,：在天然环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水含量,。,a,w,=P/P,o,P:溶液的蒸汽压 P,o,:纯水的蒸汽压,水活度需等渗适宜。微生物适宜生长的a,w,为0.60.998之间。,在常温常压下，纯水的,a,w,为1.00,在同温同压，某溶液的饱和蒸汽压与纯水的饱和蒸汽压之比。,溶 液,a,w,30%葡萄糖溶液,0.964,1%葡萄糖+20%甘油,0.955,1%葡萄糖+40%蔗糖,0.964,饱和氯化钠溶液,0.78,饱和氯化钙溶液,0.30,饱和氯化镁溶液,0.30,饱和氨化锂溶液,0.11,几种溶液的水活度值,氧化还原电位,Eh,（,redox potential,）：氧化还原系统中的还原剂释放电子或氧化剂接受电子的趋势。,好氧微生物：,+0.1V,。,一般,+0.3+0.4V,厌氧微生物：,+0.1,以下,兼性微生物：,+0.1,以上好氧呼吸；,+0.1,以 下进行发酵,(3),氧化还原电位,4、原料来源的选择（经济节约）,经济节约原则,:,以粗代精、以废代好、以简代繁,原料来源要广泛,原料要易处理，处理成本要低,原料处理后，废物、废液、废气要少,三 灭菌处理,高压蒸汽灭菌：1.05kg/cm，121,0,C，1530min,高温灭菌对营养物质的破坏及pH变化,四、四种方法,生态模拟,查阅文献,精心设计,实验比较,五、培养基类型,（一）、依对培养基成分的了解：,天然培养基,(complex medium,undefined medium),，,指一些利用动、植物或微生物体或其提取物制成的培,养基，成分未知。如培养细菌所用的肉汤蛋白胨培养,基，培养酵母菌的麦芽汁培养基等。,优点：,取材方便、营养丰富、种类多样、配制方便,组合培养基,(defined medium),，或称合成培养基,(synthetic medium),是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制的、各成分（包含微量元素）的量都确切知道的培养基。如培养细菌所用的葡萄糖铵盐,培养基，培养放线菌的淀粉硝酸盐培养基（高氏一号）。,缺点：较昂贵，一般用于研究工作（代谢、遗传分析）。,优点：组份精确、重复性好。,半组合培养基，又称半合成培养基,(Semi-defined medium),是一类主要以化学试剂配制，同时又加有某种或某些天然成分的培养基。,培养基固化物琼脂与明胶的比较,化学,成分,营养,价值,分解性,融化温度,凝固温度,常用,浓度,透明度,粘着力,耐加,压灭菌,琼脂,聚半乳糖的硫酸酯,无,罕见,96,0,C,40,0,C,1.52%,高,强,强,明胶,蛋白质,作氮源,极易,25,0,C,20,0,C,512%,高,强,弱,第五节 实验室常用的培养基举例说明,参考书：微生物培养基的制造与应用，陈天寿主编，中国农业出版社，1995年6月第一版，996千字，55元。,Difco Manual,Dehydrated Culture Media And Reagents For Microbiology.Tenth Edition,1985.,The Oxoid Manual.Sixth Edition,1990,Difco and BBL Manual,营养琼脂（牛肉膏蛋白胨）,作用：一般好氧性细菌的分离培养,配方：蛋白胨 10g,牛肉浸膏 3g,NaCl 5g,琼脂 1520g,蒸馏水 1000ml,PH 7.07.2,高压蒸气灭菌 121，1530min,液体（普通）营养肉汤：不含琼脂,伊红美蓝（EMB）培养基,作用：分离肠道细菌,配方：,蛋白胨 10g,乳糖 5g,蔗糖 5g,K,2,HPO,4,2g,伊红Y 0.4g,美蓝 0.065g,琼脂 1520g,蒸馏水 1000ml,PH 7.2,高压蒸气灭菌 121，1530min,EMB(Eosin Methylene Blue),大肠杆菌,，因其强烈分解乳糖而产生大量的混合酸，菌体带,H,+,故可染上酸性染料伊红，又因伊红与美蓝结合，使,菌落呈深紫色。从菌落表面反光还可看到绿色金属闪光,。,产酸弱的菌株,的菌落,呈棕色,。,不发酵乳酸的菌落无色透明。,用于鉴别肠道细菌,是为了观察某种糖被分解后是否产生酸的一种培养基,伊红美蓝(EMB,Eosin Methylene Blue)培养基,SS培养基,Salmonella Shigella Agar,佐贝尔（ZOBELL“2216E”）培养基,作用：分离海水细菌,配方：陈海水 1000ml,（胰）蛋白胨 5g,酵母膏 1g,FePO,4,0.01g,琼脂 1520g,PH 7.67.8,高压蒸气灭菌 121，1530min,若没有,陈海水用,蒸馏水1000ml加3%NaCl代替,TCBS（Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose Agar）培养基,作用：分离鉴定弧菌,配方：,酵母浸膏 5g,蛋白胨 10g,硫代硫酸钠 10g,枸橼酸钠 10g,牛胆粉（Oxgall）8g,蔗糖 20g,NaCl 10g,柠檬酸铁 1g,溴麝香草酚蓝 0.04g,麝香草酚蓝 0.04g,琼脂 1520g,蒸馏水 1000ml,PH 8.58.7,待冷至60 时，倾入无菌平皿,特点：此培养基呈绿色，无沉淀。质控菌株接种后，35 培养1824h，观察结果如下：,菌株 菌号 生长情况 菌落颜色,大肠艾希氏菌 ATCC 25922 无；差 半透明,奇异变形杆菌 ATCC 25933 无；差 小，黄,粪链球菌 ATCC 19433 无；差 小，黄,霍乱弧菌 好 黄,河弧菌 好 黄,副溶血弧菌 好 蓝,创伤弧菌 较好，好 黄或半透明,TCBS培养基,副溶血弧菌(,Vibrio parahaemolyticus,),霍乱弧菌(,Vibrio cholerae,),血平板(BA),溶血：又称草绿色溶血，菌落周围培养基出现12mm的草绿色环，为高铁血红蛋白所致；,溶血：又称完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的溶血环，是细菌产生的溶血素使红细胞完全溶解所致；,溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化，红细胞没有溶解或缺损。,问 题,1、,什么是大量元素、什么是微量元素。,2、,微生物需要的大量元素包括哪几种？,3、,什么叫营养？什么叫营养物？营养物有那些生理功能？,4、,列举,微生物的六大营养要素。,5、,微生物的营养类型有哪几种？,6、,营养物质进入细胞有几种方式？比较营养物质进入细胞的差异？,7、,什么叫培养基？培养基有那几种类型？,8、什么叫选择培养基？什么叫鉴别培养基，举一个鉴别培养基的例子和鉴别原理。,9、配制培养基的基本原则是什么？,补：培养基的制备,.配制溶液,向容器内加入所需水量的一部分，按照培养基的配方，称取各种原料，依次加入使其溶解，最后补足所需水分。对蛋白胨、牛肉膏（闻着味道相当不错的东西）等物质，需加热溶解，加热过程所蒸发的水分，应在全部原料溶解后加水补足。,配制固体培养基时，先将上述已配好的液体培养基煮沸，再将称好的琼脂加入，继续加热至完全融化。并不断搅拌，以免琼脂糊底烧焦。,调节pH值,用pH试纸（或pH电位计、氢离子浓度比色计）测试培养基的pH值，如不符合需要，可用10%HCl或10%NaOH进行调节，直到调节到配方要求的pH值为止。,过滤,用滤纸、纱布或棉花趁热将已配好的培养基过滤。用纱布过滤时，最好折叠成六层，用滤纸过滤时，可将滤纸折叠成瓦棱形，铺在漏斗上过滤。（商品培养基此步省略）,分装,已过滤的培养基应进行分装。如果要制作斜面培养基，须将培养基分装于试管中。如果要制作平板培养基或液体、半固体培养基，则须将培养基分装于锥形瓶内。,分装时，一手捏松弹簧夹，使培养基流出，另一只手握住几支试管或锥形瓶，依次接取培养基。分装时，注意不要使培养基粘附管口或瓶口，以免浸湿棉塞引起杂菌污染。,装入试管的培养基量，视试管和锥形瓶的大小及需要而定。一般制作斜面培养基时，每只15150毫米的试管，约装34毫升（1/41/3试管高度），如制作深层培养基，每只20220毫米的试管约装1215毫升。每只锥形瓶装入的培养基，一般以其容积的一半为宜。,加棉塞,分装完毕后，需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是过滤空气，避免污染。棉塞应紧贴内壁不留缝隙，以防空气中微生物沿皱折侵入。棉塞不要过紧过松，塞好后，以手提棉塞、管、瓶不下落为合适。棉塞的2/3应在管内或瓶内，上端露出少许棉花便于拔取。塞好棉塞的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆札，准备灭菌。,灭菌,湿热灭菌,干热灭菌,抽滤除菌(针对一些不能高温变菌的成份),同一温度下，湿热灭菌比干热灭菌效果好,1,、,湿热中细菌菌体蛋白较易凝固,2、湿热的穿透力比干热大,3,、,湿热的蒸汽有潜热,制作斜面培养基和平板培养基,培养基灭菌后，如制作斜面培养基和平板培养基，须趁培养基未凝固时进行。在实验台上放1支长0.51米左右的木条，厚度为1厘米左右。将试管头部枕在木条上，使管内培养基自然倾斜，凝固后即成斜面培养基。,