DB22∕T 3172.2-2020 流感病毒HA和NA基因荧光RT-PCR检测第 2 部分：H7N4亚型禽流感病毒(吉林省).pdf

ICS 11.220 B 41 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 3172.22020 流感病毒 HA 和 NA 基因荧光 RT-PCR 检测 第 2 部分：H7N4 亚型禽流感病毒 Real-time RT-PCR detection on HA and NA genes of influenza virus Part 2：H7N4 subtype avian influenza virus 2020 - 10 - 14 发布 2020 - 10 - 30 实施吉林省市场监督管理厅 发 布 DB22/T 3172.22020 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。 DB22/T 3172流感病毒HA和NA基因检测 荧光RT-PCR法分为四个部分。 第 1 部分：H7N9亚型禽流感病毒； 第 2 部分：H7N4亚型禽流感病毒； 第 3 部分：H3N8亚型马流感病毒； 第 4 部分：H7N7亚型马流感病毒。 本部分为DB22/T 3172的第 2 部分。 本部分由长春海关提出并归口。 本部分起草单位：长春海关技术中心。 本部分主要起草人：王伟利、王准、王玮琳、姚贵哲、刘金华、肖芳、李玥、马文晨、杨帆、蔡阳、马玲。 DB22/T 3172.22020 1 流感病毒 HA 和 NA 基因荧光 RT-PCR 检测 第 2 部分：H7N4 亚型禽流感病毒 1 范围 本标准规定了H7N4亚型禽流感病毒HA和NA基因荧光RT-PCR检测方法的原理、 试验条件、 试剂与材料、仪器设备、样品、试验步骤和试验数据处理及试验报告。 本标准适用于H7N4亚型禽流感病毒检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件 Ct值：每个反应管内的荧光信号达到的设定的阈值时所经历的循环数（Cycle threshold） DEPC：焦磷酸乙二酯（Diethy pyrocarbonate） HA： 血凝素（Hemagglutinin） NA： 神经氨酸酶（Neuraminidase） RNA：核糖核酸（Ribonucleic acid） RT-PCR： 反转录聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction） Taq 酶：Taq 脱氧核糖核酸聚合酶（Thermusaquaticus DNA polymerase） 4 原理 根据H7N4亚型禽流感病毒HA基因和NA基因序列设计特异引物和探针，探针结合部位在扩增片段内部。HA基因和NA基因探针分别在5端标记FAM和VIC荧光素作为报告荧光基团，3端分别标记TAMRA和MGB作为淬灭荧光基团。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶发挥53的外切核酸酶功能，将探针降解，探针上的荧光基团游离出来，所发出的荧光不再为淬灭基团所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。据此荧光PCR仪可实现对HA基因和NA基因的同步实时检测。 5 试验条件 DB22/T 3172.22020 2 5.1 生物安全措施 所有培养物和废弃物的处置应按照GB 19489中的有关规定执行。 5.2 防污染措施 防止污染措施应符合GB/T 27401的规定。 6 试剂与材料 6.1 试剂 6.1.1 阴性对照：不含禽流感病毒的鸡胚尿囊液或组织。 6.1.2 阳性对照：体外转录 H7N9 亚型流感病毒非感染性 RNA，-20 保存备用。 6.1.3 2RT-PCR Buffer。 6.1.4 RT Enzyme Mix。 6.1.5 Taq 酶。 6.1.6 DEPC 水：0.1% DEPC 处理后的去离子水。 6.1.7 引物与探针： 见表 1 。 表1 H7N4 亚型禽流感病毒 HA 基因和 NA 基因引物和探针 引物 F1 5 AAAATAGAATACAGATAGACCCGGT3 引物 R1 5 GTGCACGGCATGTTTCC3 HA 基因 探针 P1 FAMCTTCGGGGCATCATGTTTTCTACTTCTAGTAMRA 引物 F2 5 GACAACCCCAGGCCAGTAGAT3 引物 R2 5 CCCCATACCTAAAGCTGAATCCT3 NA 基因 探针 P2 VICTGGCCCAATCAACAMGB 6.2 材料 6.2.1 离心管（1.5 mL、0.2 mL）。 6.2.2 荧光 PCR 反应管（0.1 mL、0.2 mL）。 7 仪器设备 7.1 生物安全柜。 7.2 高速冷冻离心机（12 000 r/min）。 7.3 微量可调移液器 (2.5 L 10 L、100 L、1 000 L)。 7.4 超低温冰箱（-80 ）。 7.5 荧光定量 PCR 仪（至少包含 FAM 和 VIC 通道）。 7.6 旋涡振荡器。 7.7 高压灭菌器。 8 样品 DB22/T 3172.22020 3 8.1 采样工具 8.1.1 采样专用商品化棉拭子、剪刀、镊子、研体、5 mL 采样管、商品化一次采样袋。 8.1.2 除商品化棉拭子、采样袋外，上述采样工具应经 121 2 ，15 min 高压灭菌并烘干或经160 干烤 2 h。 8.2 采集 8.2.1 拭子 8.2.1.1 根据动物的种类，可采集咽喉拭子、泄殖腔拭子（禽）或鼻拭子（猪等其他动物）。采集方法如下： a) 取咽喉拭子时将拭子深入喉头及上颚裂来回刮 2 次3 次并旋转，取分泌液； b) 取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便； c) 取鼻拭子时将拭子深入鼻腔来回刮取 2 次3 次并旋转，取分泌物。 8.2.1.2 将采样后的拭子放入盛有 2.0 mL PBS（含有青霉素和链霉素）的采样管中，编号。 8.2.2 组织 病死禽采集气管分泌物或肺脏等组织；其他动物用无菌剪、镊采集肺脏等组织脏器，装入无菌采样袋或其他灭菌容器，编号。 8.3 贮运 样品采集后置保温箱中，加入预冷的冰袋，密封，24 h内送实验室。 8.4 处理 8.4.1 拭子 样品在震荡器上充分混合后，将拭子中的液体挤出，3 000 r/min 离心5 min，吸取上清液转入无菌的1.5 mL离心管中，编号备用。 8.4.2 组织 用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品2.0 g于研钵中充分研磨，再加10.0 mL PBS （含有青霉素和链霉素）混匀，3 000 r/min 离心5 min后，取1.0 mL上清液转入无菌的1.5 mL灭菌离心管中，编号备用。 8.5 存放 采集或处理好的样品在2 8 条件下保存应不超过24 h； 若需长期保存， 应放置-70 冰箱中，但应避免反复冻融。 9 试验步骤 9.1 核酸提取 采用市售RNA提取试剂盒或自动化核酸提取仪及配套核酸提取试剂进行提取。 9.2 荧光 RT-PCR 检测 9.2.1 反应体系 DB22/T 3172.22020 4 反应体系配制见表2与表3，每份检测样品的荧光RT-PCR体系为25 L。用旋涡振荡器进行混匀，瞬间离心后置荧光PCR仪扩增。 表2 H7N4 亚型禽流感病毒 HA 基因荧光 RT-PCR 反应体系 成分 用量 L 2RT-PCR Buffer（6.1.3） 12.5 RT Enzyme Mix 5 U/L（6.1.4） 0.5 Taq 酶 5 U/L（6.1.5） 0.5 F1 20 mol/L（6.1.7） 1.0 R1 20 mol/L（6.1.7） 1.0 P1 20 mol/L（6.1.7） 1.0 模板 RNA 5.0 DEPC水（6.1.6） 3.5 总计 25 表3 H7N4 亚型禽流感病毒 NA 基因荧光 RT-PCR 反应体系 成分 用量 L 2RT-PCR Buffer（6.1.3） 12.5 RT Enzyme Mix 5 U/L（6.1.4） 0.5 Taq 酶 5 U/L（6.1.5） 0.5 F2 20 mol/L（6.1.7） 1.0 R2 20 mol/L（6.1.7） 1.0 P2 20 mol/L（6.1.7） 1.0 模板 RNA 5.0 DEPC水（6.1.6） 3.5 总计 25 9.2.2 反应参数 9.2.2.1 第 1 阶段，反转录 45 30 min。 9.2.2.2 第 2 阶段，预变性 92 3 min。 9.2.2.3 第 3 阶段，92 15 s，57 20 s，60 30 s（在此收集荧光），40 个循环。 10 试验数据处理 10.1 结果分析条件设定 读取检测结果。 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点， 不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。 10.2 质控标准 DB22/T 3172.22020 5 10.2.1 阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。 10.2.2 阳性对照的 Ct 值应30.0，并出现特定的扩增曲线。 10.2.3 如阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件，此实验视为无效。 10.3 结果判定 10.3.1 阴性 无Ct值且无扩增曲线，或只出现单一通道有荧光信号，均判为阴性。报告样品中不存在 H7N4 亚型禽流感病毒核酸。 10.3.2 阳性 Ct值均30.0，且HA基因与NA基因同时扩增出特定的扩增曲线，判为阳性，报告样品中存在H7N4亚型禽流感病毒核酸。 10.3.3 有效原则 Ct值30.0的样本建议重做，重做结果无Ct者为阴性，否则为阳性。 A 11 试验报告 试验报告至少应给出以下几个方面的内容： a) 试验对象； b) 所使用的标准（包括发布或出版年号）； c) 所使用的方法（如果标准中包括多个方法）； d) 结果； e) 观察到的异常现象； f) 试验日期。 _