生物检定法.ppt

<p>,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章 生物检定法,第一节 概述,一、生物检定定义,:,利用药物对,生物体,(,整体动物、离体组织、微生物等）的作用以测定其效价或生物活性的一种方法。它以药物的,药理作用,为基础，,统计学,为工具，选用特定的实验设计，在一定的条件下比较供试品和相当的,标准品,所产生的特定反应，通过等反应剂量间比例的计算，从而测得供试品中活性成分的效价。,二、生物检定包括整体和离体测定,:,整体：,直接反应药品对生物的作用，但费动物，供试品用量多，耗时长，精密度和灵敏度较差。,离体：,个体差异小，实验时间较短，精密度和灵敏度较高，能在一定程度上保留药理作用特性，尤其适用于微量激素的测定，缺点是不一定能反映供试品在整体的作用。,三、生物检定的应用范围,1,药物的效价测定,2,检验方法的核对,3,体内微量生理活性物质的测定,4,中药质量的控制,5,某些有害杂质的限度检查,第二节 生物检定中的基本概念,（一）生物反应是生物检定的基础,生长素的测定方法：,形态方法,生物化学方法,a,去垂体大鼠体重增加法,a,正常狗血中含氮物减少法,b,正常大鼠体重增加法,b,去垂体大鼠血清碱性磷酸酶增加法,c,侏儒小鼠体重增加法,c,去肾大鼠中尿素氮减少法,d,去垂体大鼠尾椎生长法,d,正常狗或正常大鼠氮贮留增加法,e,正常大鼠肝重,增加法,e,去垂体大鼠血清无机磷增加法,f,正常大鼠下颌骨或头盖骨测定法,f,遗传性高血糖大鼠血糖上升法,g,去垂体大鼠胫胃端软骨增加法,g,去垂体大鼠肾转脒基酶活性上升法,（二）剂量与反应关系,质反应,:,当观察某一反应或反应的某一特定程度出现与否，例如死或不死，惊厥或不惊厥，只能出现与不出现两种情况，故不能用量来表示个体的反应程度，只能用一组动物中出现正或负反应的百分率来表示，如死亡率，惊厥率，这类反应称质反应。,量反应,:,药物对生物体所引起的反应随着药物剂量的增加产生的量变可以测量者，称为量反应。例如血压的变化值，血糖浓度，器官组织的重量等。,时反应,:,为特殊的量反应,它是观察某一反应或反应的某种程度出现所需时间，例如血液的凝结时间，动物生存时间等。,（三）对比检定,当标准品的剂量,ds,和供试品的剂量,dt,产生的反应程度相等时，,ds，dt,为标准品和供试品的等反应剂量，,ds,中所含的单位,ds.Ps,和,dt,中所含的单位,dt.Pt,相等，即,Psds=Ptdt,两药效价的比值,R=Pt/Ps=ds/dt (6-1,),即标准品与供试品的效价的比值,R,是它们等反应量的反比。效价强,R,倍，等反应剂量就小,R,倍，相反亦然。,式中,Ps,已知，,ds,和,dt,是实验中所用的剂量，,Pt,是供试品的效价，是需要通过实验测定的。,Pt=dsPs/dt (6-2),lgR=M=lgPT/Ps=lgds/dT,M=lgR=lgPt-lgPs=lgds-lgdt=Xs-Xt,效价比值（,R,）,=antilgM=antilg(Xs-Xt,）（,6-3,）,供试品效价,Pt=antilg(Xs-Xt+lgPs,）,当供试品按标示量或估计效价进行试验时,P,T,=R,*,供试品的估计效价或标示量 （,6-,4,）,第三节 生物检定的常用方法,质反应直接测定法,质反应平行线测定法,量反应平行线测定法,质反应的直接测定法,直接测定法就是在较短的时间内能够准确的测得各个动物对,S,和,T,的最小效量的方法。,最小效量（,MED,）。,由于生物的个体差异，最小有效量参差不齐，但有一定的规律性。,如洋地黄测定的鸽法：,直接测定的具体方法是将实验对象分成两组，一组为,S,，,一组为,T,，,分别测定,S,和,T,的,MED,，,然后再计算出,S,和,T,各自地,lgMED,及均值,Xs,和,Xt,。,R=antilgM=antilg,（,Xs-Xt,）,S,T,MLDs(ds),Xs,MLD,T,(d,T,),X,T,/Kg,lg(ds*10),/kg,lg(d,T,*10),1.15,1.01,1.10,1.14,1.06,0.95,1.061,1.0044,1.041,1.057,1.025,0.978,1.11,1.23,1.06,1.31,0.94,1.36,1.045,1.090,1.025,1.117,0.973,1.134,Xs,的和,6166,X,T,的和,6.384,Xs,平均,1028,X,T,平均,1.064,第四节生物检定实例,一、,胰岛素的生物检定法,本法系比较胰岛素标准品,(S),与供试品,(T),引起小鼠血糖下降的作用，以测定供试品的效价。,标准品溶液的配制,供试品溶液与稀释液的配制检定法,二、,肝素生物检定法,本法系比较肝素标准品,(S),与供试品,(T),延长新鲜兔血或兔、猪血浆凝结时间的作用,以测定供试品的效价。标准品溶液的配制标准品稀释液的配制,供试品溶液与稀释液的配制按供试品的标示量或估计效价，照标准品溶液与稀释液的配制法配成高、中、低三种浓度的稀释液。相邻两浓度之比值,(r),应与标准品相等，供试品与标准品各剂量组的凝结时间应相近。血浆的制备迅速收集兔或猪血置预先放有,8,枸橼酸钠溶液的容器中,枸橼酸钠溶液与血液容积之比为,1:19,，边收集边轻轻振摇，混匀，迅速离心约,20,分钟（离心力不超过,1500g,为宜，,g,为重力常数）。立即分出血浆，分成若干份分装于适宜容器内，低温冻结贮存。临用时置,370.5,水浴中融化,用两层纱布或快速滤纸过滤，使用过程中在,4,8,放置。,检定法（,1,）新鲜兔血取管径均匀（,0.83.8cm,或,1.07.5cm,）、清洁干燥的小试管若干支，每管加入一种浓度的标准品或供试品稀释液,0.1ml,每种浓度不得少于,3,管,各浓度的试管支数相等。取刚抽出的兔血适量，分别注入小试管内，每管,0.9ml,立即混匀,避免产生气泡，并开始计算时间。将小试管置,370.5,恒温水浴中，从动物采血时起至小试管放入恒温水浴的时间不得超过,3,分钟，注意观察并记录各管的凝结时间。,（,2,）血浆取上述规格的小试管若干支，分别加入血浆一定量，置,370.5,恒温水浴中预热,5,10,分钟后，依次每管加入一种浓度的标准品或供试品稀释液及,1,氯化钙溶液（每种浓度不得少于,3,管,各浓度的试管支数相等），血浆、肝素稀释液和氯化钙溶液的加入量分别为,0.5,、,0.4,和,0.1ml,（或,0.8,、,0.1,和,0.1ml,），加入氯化钙溶液后，立即混匀，避免产生气泡，并开始计算时间，注意观察并记录各管凝结时间。将各管凝结时间换算成对数，照生物检定统计法（附录,）中的量反应平行线测定法计算效价及实验误差。检定法（,1,）的可信限率,(FL,),不得大于,10,。检定法（,2,）的可信限率,(FL,),不得大于,5,。,三、缩宫素的生物检定,取健康无伤的成年雌性大鼠，断乳后即与雄鼠隔离，出生后不超过,3,个月,体重,160,240g,。试验当日，选择阴道涂片在动情前期的动物，也可用雌性激素处理使子宫涂片为动情前期或动情期的动物。,检定法：,取选定的大鼠迅速处死，剖腹取出子宫，仔细分离附在子宫肌上的结缔组织,注意避免因牵拉使子宫肌受损。在子宫分叉处剪下左右,2,条，取一条将其下端固定于离体器官恒温水浴装置的浴杯底部，上端用线与记录装置相连，以描记子宫收缩；浴杯中加入一定量的子宫肌蓄养液,(10ml),，连续通入适量空气。蓄养液应调节至,32,35,之间并保持恒温,(0.5,),，子宫放入浴杯后，静置约,15,分钟,按次序准确注入等体积的标准品或供试品两种浓度的稀释液，待子宫肌收缩至最高点开始松驰时（约,60,90,秒钟），放去蓄养液并用蓄养液洗涤一次，再加入等量蓄养液，静置。按随机区组设计的次序轮流注入每组四个剂量，重复,4,6,组。,记录各剂量所致子宫收缩的幅度（,g,），照生物检定统计法中的量反应平行线测定法计算效价及实验误差。试验可信限率,(FL,),不得大于,10,。,第六节 药物标准物质的研究,1,药物标准物质研究状况,2,药物标准物质的必备条件：,材料均匀,性能稳定,准确定值,制备分装测定等需经国家权威部门认可,3,标准品效价,的表示方法,动物单位,效价单位,4,基因工程药物标准品的质量要求,原料鉴定,成品鉴定,制备要求,本章重点内容,概念：,生物检定,:,质反应：,时反应,:,量反应：,</p>