植物生理必修课实验课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,植物生理学实验,植物组织中自由水、束缚水含量的测定,1、物组织渗透势的测定,2、植物组织水势的测定,3、硝酸还原酶活性测定,植株硝态氮的测定,4、植株磷素的测定,5、叶绿体色素的提取、分离及理化性质的鉴定,6、叶绿素的吸收光谱,7、叶绿素a、b含量测定,8、植物呼吸强度测定,9、植物（果实）固形物和酸度测定,10、IAA酶活性测定,11、油类种子萌发时脂肪酸含量测定,植物组织中自由水、束缚水含量的测定,一、实验目的：,了解植物组织中水分存在的状态与生命活动的关系，熟悉折射仪的使用。,二、,原理及意义：略,三、仪器设备与试剂试材,仪器,阿贝折射仪、分析天平、烘箱、钻孔器、干燥器、称量瓶、移液管等。,试剂,质量浓度65-75 蔗糖溶液,试材,新鲜土豆,植物组织渗透势的测定,一、实验目的：,了解植物组织在不同浓度溶液中细胞质壁分离的产生过程及用于测定植物组织渗透势的方法。,二、,原理及意义：,若植物组织细胞内汁液与外界溶液渗透势相同，此时植物组织细胞将近处于初始质壁分离状态。这种外液称为等渗溶液。用一系列梯度浓度外液处理观测植物组织细胞质壁分离现象，就可以大略计算等渗溶液的浓度。,三、仪器设备与试剂试材,仪器,显微镜等,试剂,0.1、0.2-0.8mol/L,的,蔗糖溶液,试材,洋葱,四、实验步骤：,1.配制0.1、0.2-0.8mol/L,的,蔗糖溶液浓度梯度；,2.浸入,洋葱,表皮5-10分钟,3.,显微镜观测找到未产生质壁分离的最高浓度和产生初始质壁分离的浓度，算出其平均值即等渗溶液的浓度。,五、计算,计算公式：s=-RTic,式中s为,植物组织细胞渗透,势，以bar表示；i为解离系数，蔗糖是1；R为气体常数，0.083 Lbar/molK；T为绝对温度，K（即 273t，t为实验温度,）；c为等渗溶液浓度，mol/L）。,植物组织水势的测定一小液流法,一、实验目的,掌握植物组织水势的测定方法，并了解渗透系统中水势大小是水分移动方向的决定因素。,二、,原理及意义,：,植物生活细胞是一个渗透系统，当将植物细胞或组织放人外界溶液中时，水分将以水势差为动力在两者间流动，最终达到动态平衡。如果植物组织的水势小于外界溶液的水势，植物细胞吸水，使外界溶液浓度增大；反之，植物细胞失水，使外液浓度变小。若植物组织与外界溶液水势相同，将不改变外部溶液的浓度，此时外液的渗透势就等于植物组织的水势。可以利用外界溶液的浓度不同其比重也不同的原理来确定与植物组织水势相同的外液，根据公式计算植物组织的水势。,四、实验步骤：,1.外界溶液的配制与渗透作用,配制 0108 mol/L 8个梯度的蔗糖溶液各5ml，注入8只试管中，并分别加上塞子后编号，作为对照组。将8只青霉素小瓶编号，分别从对照组中相同编号的试管中取蔗糖溶液4ml注人各瓶，加上塞子作为实验组。,或配制8个梯度的蔗糖溶液各10ml取5ml作为对照组，另外5ml加入另外一组试管作为实验组。,用剪刀或打孔器将玉米等植物的叶片（块茎）打成大小相同（约05cm）的小块（土豆再切为薄小原片），每瓶中投人20-40小块（约占1/4溶液体积），塞好塞子，放置 30 min。在此期间摇动小瓶数次。,用针尖挑取少许甲烯蓝粉末加入上述各青霉素瓶中，摇匀，此时溶液为浅蓝色。,五、计算,计算公式：W=-RTiC,式中W为植物组织水势，以bar表示；i为解离系数，蔗糖是1；R为气体常数，0.083 Lbar/molK；T为绝对温度，K（即 273t，t为实验温度）.,注意事项,1叶片投入小瓶要快，小瓶及时加盖，防止叶内或小瓶中水分蒸发影响实验结果。,2加人实验组的甲烯蓝粉末量不宜过多，以免影响溶液的比重。,3胶头细玻璃弯管要各溶液专用，如用一只弯管则应从低浓度到高浓度依次吸取溶液。,4释放蓝色液滴时要缓慢，防止过急挤压冲力影响液滴移动。,5观察液滴移动状况最好放在一个白色的背景下进行。,一、原理,硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐。,产生的亚硝酸盐与磺胺及萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。,生成的红色偶氮化合物在520nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以NO,2,-,g/（gh）为单位。,二、仪器与试剂,仪器：,分光光度计；真空抽气泵；天平；打孔器；保温箱（或恒温水浴）；试管，三角瓶（50mL）；移液管。,试剂：,磺胺溶液；-萘胺溶液；亚硝酸钠5g/mL；,硝酸钾0.2mol/L；磷酸缓冲液0.1mol/L.,三、实验步骤,1.将材料（小白菜、小麦、玉米等作物叶片）洗净，用蒸馏水冲洗，滤纸吸干。在叶片中部打取直径1cm的圆片，混匀后每个样品称0.3-0.4g，记录重量M，等重 2份，放入50mL三角瓶中编号。向放有称重后材料的三角瓶中如下表加入试剂，然后置真空干燥器中接真空泵抽气，至叶片沉在瓶底。之后于30水浴中遮光反应30min（t）。,2.显色,在酶解反应结束的三角瓶中各吸取1mL于三角瓶或者试管中，依次加入2mL-萘胺溶液和2mL磺胺溶液，30水浴反应30min，显色，测定520nm下OD值。,编号,硝酸钾溶液/mL,磷酸缓冲液/mL,蒸馏水/mL,1,0,5,5,2,5,5,0,3.标准曲线制作,取6支洁净烘干的试管按表1-2顺序加试剂，摇匀后于30恒温水浴中反应30min显色，然后在520nm波长下比色。以0g/mL浓度为参比，亚硝态氮（g）为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线或建立回归方程。,编号,亚硝酸钠溶液/mL,蒸馏水/mL,磺胺溶液/mL,-萘胺溶液/mL,0,0.0,1.0,2,2,1,0.2,0.8,2,2,2,0.4,0.6,2,2,3,0.6,0.4,2,2,4,0.8,0.2,2,2,5,1.0,0.0,2,2,四、结果计算,将样品溶液所测得的吸光度值代入标准曲线计算式中，得到溶液中亚硝酸盐含量。计算得到硝酸还原酶活性：,NR活性=m稀释倍数/（Mt）,其中，m样品溶液中所含亚硝酸盐含量，,g；,M样品重量，g；,t酶促反应时间，h.,硝酸盐还原为亚硝酸盐（植物体内由硝酸还原酶（NR）催化）。,产生的亚硝酸盐与对氨基苯磺酸（或对氨基苯磺酰胺）及萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。,生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定。,醋酸溶液；KNO,3,标准液；,混合粉剂,实验材料洗净的小白菜、小麦、玉米等作物叶片,三、试验试剂,1.标准曲线制作：,取7支洁净烘干的15ml刻度试管按顺序加试剂，即配成02.0g的系列标准硝态氮溶液。摇匀后在30保温箱或恒温水浴中保温30min，然后在nm波长下比色。以硝态氮（g）为横坐标，光密度值为纵坐标绘标准曲线。,四、实验步骤,磷素的测定,一、原理与意义 食物中的有机物经酸氧化分解，使磷在酸性条件下与钼酸铵结合生成磷钼酸铵。此化合物经a-1、2、4-氨基萘酚磺酸钠（或对苯二酚、亚硫酸钠或氯化亚锡等还原剂）还原成兰色化合物-钼蓝。用分光光度计在波长660nm处测定钼蓝的吸光值，以测定磷的含量。反应式为：H,3,PO,4,+12（NH,4,）,3,MoO,4,+21HNO,3,（NH,4,）3PO412MoO,3,+21NH,4,NO,3,+12H,2,O,（NH,4,）,3,PO,4,12MoO,3,+还原剂 钼蓝,二、仪器与试剂 1.仪器722可见分光光度计 2.试剂,（1）50ug/ml 标准磷溶液（0.2195g分析纯KH2PO4溶于400ml去离子水，加入5ml浓硫酸，定容至1L）,（2）2.5%钼酸铵与3mol硫酸1:1等体积混合。,（3）a-1、2、4氨基萘酚磺酸钠溶液：0.25g a-1、2、4氨基萘酚磺酸钠、0.5g亚硫酸钠溶于100ml水中，使用前再加水3份混合均匀。,3.实验材料：小白菜,三、操作步骤,3.1磷标准曲线：分别吸取标准储备液配成0、5、10、20、25、30、35、40、45、50ug/ml梯度各1ml，然后依次加入3ml钼酸铵-硫酸混合溶液，摇匀再加a-1、2、4氨基萘酚磺酸钠溶液0.5ml,混匀，置于37度水浴10分钟，以0浓度为参比，选波长660nm处分别测定其吸光度，由此计算出回归系数，利用回归方程计算或绘制成校正曲线。,3.2 样品中磷的提取与测量：取干净小麦或小白菜等植物功能叶叶鞘2-4g，于研钵中加少量石英砂及5ml水研磨，匀浆转入25或50ml容量瓶或量筒，蒸馏水定容。取5ml上述提取液于3000g离心15分钟，取两份1ml上清液于干净试管，照标准曲线做法测定其光密度，并从标准曲线查出其浓度。,叶绿体色素的提取、分离及理化性质的鉴定,一、原理,叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。,提取液可用色谱分析的原理加以分离：因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。,二、材料、仪器设备及试剂,（一）材料：菠菜、小白菜叶片,（二）仪器设备,研钵；漏斗；三角瓶；剪刀；滴管；培养皿（直,径11cm）；康维皿或平底短玻管；圆形滤纸（直,径11cm）,（三）试剂,80丙酮；100丙酮、石英砂；碳酸钙粉；,推动剂：按石油醚；丙酮：苯（10:2:1）比例配,制（VV）。,三、实验步骤,1.叶绿体色素的提取,（1）取菠菜新鲜叶片45片（2g左右），洗净，擦干，去掉中脉、剪碎，,称重（1g）,，放入研钵中。,（2）研钵中加23ml,100丙酮、少量石英砂、碳酸钙粉,，研磨至糊状，再加1015ml,80丙酮,，提取3-5min，上清液过滤于三角瓶中，残渣用10ml95乙醇冲洗，一同滤于三角瓶中。,2.叶绿体色素的分离,（1）取圆形定性滤纸一张（直径11cm），在其中心戳一圆形小孔（直径约3mm）另取一张滤纸条（5cm1.5cm），用滴管吸取乙醇叶绿体色素提取液沿纸条的长度方向涂在纸条的一边，使色素扩散的宽度限制在0.5cm以内，风干后，再重复操作数次，然后沿长度方向卷成纸捻，使浸过叶绿体色素溶液的一侧恰在纸捻的一端。,（2）将纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中，使与滤纸刚刚平齐（勿突出）。,（3）在培养皿内放一康维皿，在康维皿中央小室中加入适量的推动剂，把带有纸捻的圆形滤纸平放在康维皿上，使纸捻下端浸入推动剂中。迅速盖好培养皿。,（4）当推动剂前沿接近滤纸边缘时，取出滤纸，风干，即可看到分离的各种色素：叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。用铅笔标出各种色素的位置和名称。,叶绿素的吸收光谱的测定,一、材料与试剂,1.材料：菠菜、小白菜叶片,2.仪器设备,研钵；漏斗；量筒；三角瓶；容量瓶；剪刀；滴管；培养皿（直径11cm）；康维皿或平底短玻管；圆形滤纸（直径11cm）；分光光度计等。,3.试剂,80丙酮；100丙酮、石英砂；碳酸钙粉；,推动剂：按石油醚；丙酮：苯（10:2:1）比例配,制（VV）。,二、原理,叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和类胡萝卜素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取；,提取液可以用色谱分析的原理将各种色素分开；然后将分离的叶绿素a和黄绿色的叶绿素b于波长400-700nm之间每隔5nm进行比色，读取它们的OD值，绘制吸收光谱曲线。,三、实验步骤,将E7分离的叶绿体色素纸层析滤纸用剪刀小心剪下蓝绿色的叶绿素a和黄绿色的叶绿素b(注意避开分层不清晰的色区)，分别浸入80丙酮洗下，用80丙酮为较零液，于波长400-700nm之间每隔5nm进行比色，读取它们的OD值，绘制吸收光谱曲线。,叶绿素a、b的吸收光谱,叶绿素a、b含量测定,一、原理,根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。,在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。,二、材料、仪器设备及试剂,（一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片,（二）仪器设备：,分光光度计；电子顶载天平（感量0.01g）；,研钵；棕色容量瓶；小漏斗；定量滤纸；,吸水纸；擦境纸；滴管,（三）试剂：,96乙醇（80丙酮）；石英砂；碳酸钙粉。,三、实验步骤,1.取新鲜植物（菠菜）叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。,2.称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2-3ml95乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3-5min。,3.取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后用乙醇定容至25ml，摇匀。,4.把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。,四、实验结果计算,将测定得到的吸光值代入下面的式子：,Ca=13.95A,665,6.88A,649,Cb=24.96A,649,7.32A,665,Cr=18.08 A,649,+6.63 A,665,（Ca、Cb：mg/L）,叶绿素的含量（mg/g）=叶绿素的浓度提取液体积稀释倍数/样品鲜重,植物呼吸强度测定-真空干燥器,一、目的与原理：,通过实验了解植物呼吸强度的概念、意义以及植物呼吸强度的测定方法、原理。,植物以葡萄糖为基质进行有氧呼吸时，反应为：,C,6,H,12,O,6,+6O,2,6CO,2,+6H,2,O+674(千卡)CO,2,+2NaOH（过量）Na,2,CO,3,+H,2,O,NaCO,3,+BaCl,2,BaCO,3,+2NaCl,用标准HCl滴定剩余NaOH，即可求得呼吸强度。,二、材料与设备：,设备 18cm或21cm直径,真空干燥器；,30cm蒸发皿（置放NaOH）；25ml酸式滴定管、25ml移液管；1000-2000ml容量瓶、三角瓶；天平等。,材料 柑橘果实或土豆,三、实验步骤,1.样品称重；,2.用25ml移液管将浓度0.4M的NaOH 25ml放入,真空干燥器内的,蒸发皿，放好格板；,3.放入样品，封闭、开始计时，同时做一空白即不放样品；,4.1小时后开盖，取出样品和蒸发皿，将蒸发皿内NaOH洗入三角瓶，用5ml移液管加入饱和BaCl,2,5ml，加一滴酚酞指示剂；,5.用标准HCl滴定剩余NaOH，记录滴定量ml,四、结果计算,呼吸强度(co,2,mg/kg.小时),=V*N*22/W*T,V 空白与样品滴定量差；,N 标准HCl（当量）浓度,T 样品呼吸反应时间（小时）,22 co,2,的克当量,W 样品重kg,植物（果实）固形物和酸度测定,1.总酸度（可滴定酸）的测定,（1）原理 有机酸用碱液中和，生成盐类,RCOOH+NaOH RCOONa+H,2,O,用酚酞作指示剂，在pH8.2时即游离酸中和的终点，无色的酚酞与碱作用生成酚酞盐，同时失去以分子水，引起醌型重排而呈红色。,（2）,试剂和器材,0.1M NaOH 标准溶液、1酚酞溶液,三角瓶、碱式滴定管等,（3）操作过程,取清洁干净样品5克，放入研钵，加入少量水研磨为匀浆，洗入50或100ml容量瓶，蒸馏水冲洗、定容，摇匀。过滤部分入干净烧杯，取滤液20ml加入三角瓶，加酚酞3-4滴，用0.1M NaOH 标准溶液滴定至微红色1分钟不退即终点。,（4）计算,总酸度（）=(M*V*K)/W*(50/100)*100,M NaOH 标准溶液的浓度,V NaOH 标准溶液的滴定用量（ml）,K 酸换算系数 苹果酸为0.067、柠檬酸为0.064、酒石酸为0.075、醋酸为0.060、乳酸为0.090,W 样品重量（克）,2.果蔬组织固形物的测定,固酸比是园艺学作为果实品质或成熟度常用的参考指标之一。“固”是指可溶性固形物（soluble solids），通常可用手持糖量计测定或阿贝式折射仪。由于糖的测定较为复杂，而果汁的可溶性固形物主要是糖，因此，在生产上通常用可溶性固形物的测定值作为糖含量的参考数据。由于果实成熟时糖含量逐渐增加而酸含量逐渐减少，所以固酸比往往随果实的成熟而逐渐增高，用固酸比可作为果实成熟的指标之一。如美国加州规定甜橙果汁的固酸比达8:1时即达到成熟。我国规定外销和内销柑橘的固酸比不能低于8:1。,（1）原理 溶液浓度不同其折射率不同，二者正比例变化。,（2）仪器与试剂 阿贝式折射仪等,（3）操作步骤 用蒸馏水将阿贝式折射仪测定面洗净，调零；用干净滤纸或棉花搽干，滴上1-2滴待测溶液，合上；读数。,（4）计算 读数或根据稀释倍数算出组织可溶性固形物,吲哚乙酸氧化酶活性的测定,一、原理,IAA氧化酶是一种含铁的血红色素蛋白质，参与吲哚乙酸(植物生长素)在植物体内的氧化。,在吲哚乙酸氧化酶的作用下，吲哚乙酸受到氧化，生成无植物生理活性的3一亚甲氧基代吲哚最终产物。,以破坏吲哚乙酸的速度表示酶活性的大小，用比色法测定吲哚乙酸含量的变化。,二、材料、仪器设备及试剂,材料：绿豆,仪器设备：研钵、试管、可见光分光光度计、,恒温水浴锅,试剂：氯化锰、吲哚乙酸、磷酸,三、实验步骤,1新鲜绿豆芽，去子叶，留胚轴待用。,2取5g下胚轴加磷酸缓冲液5ml（预冷），研磨成匀浆，用磷酸缓冲液定容至40ml.6000*离心10分,酶液待用。,3、取2 支试管，作如下处理：,（1）氯化锰1ml+二氯酚2ml+吲哚乙酸1ml+酶液1ml,（2）氯化锰1ml+二氯酚2ml+吲哚乙酸1ml+磷酸1ml，于30度下恒温水浴30分钟,4.取反应液1ml+吲哚乙酸试剂A 4ml，暗处30下保温30min。于530nm下比色读取光密度值。,5.标准曲线的绘制：配制浓度为0、5、10、15、20、25ug/ml的吲哚乙酸溶液，按上述方法分别测量光密度值。,6.从标准曲线上查出吲哚乙酸残留量，按下列公式计算样品中酶活性：,Uug(IAA)/g鲜重.h=(C,2,-C,1,)*10/(1/V,总,*V*T/60),U为样品中酶活性ug(IAA)/g(鲜重).h,C,2,为反应液中吲哚乙酸残留量（ug/mL）,C,1,为无酶反应液中吲哚乙酸残留量（ug/mL）,V,总,为1g鲜重样品制得的酶液体积（mL）,T为反应时间(min),10为反应液体积（mL）,油类种子萌发时脂肪酸含量的变化,实验目的,了解在种子萌发时脂类物质分解成脂肪酸。,实验原理,油菜籽等油类种子萌发时，在脂肪酶的作用下，贮藏的脂肪水解成脂肪酸和甘油。生成的脂肪酸可用碱进行滴定。,器材与试剂,实验仪器,小型磨粉机，研钵，台式天平，水浴锅，漏斗，大试管和橡皮塞，培养皿，三角烧瓶，移液管，碱式滴定管,实验试剂,95%乙醇 0.05mol/L NaOH，1%酚酞试剂,实验材料 未,发芽和不同发芽时间的花生种子,实验步骤,1.取4-5g花生种子于培养皿中的湿滤纸上发芽，待胚根长达0.51cm左右即可用于实验。,2.称取4-5g花生种子置于试管中放入研钵中，加少量石英砂，3-6ml 95乙醇，研磨成匀浆，加95乙醇定容50ml，加盖；另取相当于4-5g干花生种子的已发芽的花生种子放入研钵中，加少量石英砂，3-6ml 95乙醇，研磨成匀浆，用95乙醇洗入另一试管，95乙醇定容至50ml,加盖；,3.将两支试管70水浴保温30分钟，取出静置几分钟，上清液用放有少量活性炭的滤纸过滤1-2次或3000r/min 离心5分钟。两试管中各取提取液10ml放入三角瓶，各加入酚酞试剂2滴，用0.05mol/L的NaOH滴定至稳定的微红色既终点，记录NaOH用量/4-5（风干种子g）,即脂肪酸总量(相当于0.05mol/L NaOH ml数),