第四章--蛋白质的转运、加工与修饰.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章 蛋白质的转运、加工与修饰,第一节 蛋白质的转运、到位,第二节 蛋白质的加工与修饰,细胞核DNA编码,细胞器DNA编码（线粒体和叶绿体）,细胞质核糖体,细胞器核糖体,绝大多数蛋白质,小部分蛋白质,(人线粒体核糖体组成蛋白有78个基因),蛋白质合成,（真核细胞）,（分泌、膜、胞汁及大部分细胞器蛋白）,细胞中蛋白质合成后必须定位于特定的位置（到位）。,如,膜：,细胞膜，细胞器膜；,水相腔室：,细胞质，细胞器基质或内膜腔；,镶嵌在质膜内：,受体、离子通道蛋白和转运蛋白；,细胞核（nucleus）：,DNA、RNA聚合酶；,溶酶体（lysosome）：,蛋白酶（proteolytic enzymes）,过氧化物酶体（peroxisome）：,过氧化氢酶（catalase）,过氧化物酶体（peroxisome）,分泌到细胞外：,细胞外间质蛋白、激素和细胞因子。,第一节 蛋白质的转运、到位,一、蛋白质转运与分拣信号,二、分子伴侣,三、翻译同步转运和翻译后转运,四、小泡运输的机制,五、受体介导的胞吞作用和内化蛋白质的分拣,六、高尔基复合体内蛋白质的分拣,一、蛋白质转运与分拣信号,1.信号序列（斑块）,2.跨膜疏水区信号,3.分拣信号,内质网（endoplasmic reticulum,ER）信号序列：,存在于所有分泌蛋白质前体中。,通常位于肽链 N-terminus,，引导新生肽链从细胞质进入内质网,基质（matrix）信号序列：,引导新生蛋白质从细胞质进入细胞器基质的,跨膜转运,内膜腔（intermembrane space）信号序列：,新生蛋白质,先进入基质，基质信号序列被切除,，露出的内膜腔信号序列,再引导蛋白质进入内膜腔,（即内、外膜间隙）,1.信号序列（斑块）（signal sequece/patch）,信号斑块：,蛋白质分子中,互不连续的肽段,折叠而,成的,具有,蛋白质到位功能,的,局部立体结构,，其功能与,信号序列相似。,信号-锚定序列（signal-anchor sequence）：,穿膜蛋白中的一段独特信号序列，其作用是将这些蛋白质锚定在脂双层膜上。,。信号序列常位于,链内,，,其,序列两端的荷电位置,决定该蛋白在细胞膜上的朝向（,序列中带正电荷端总是朝向细胞质侧）。,停止转运-锚定序列（stop transfer-anchor sequence）,：,停止新生肽的转运并锚定在内质网膜中。,2.跨膜疏水区信号,二、分子伴侣（,molecular chaperones）,分子伴侣：,非共价地与新生肽链和解折叠的蛋白质肽链结合，并帮助其折叠和转运，通常不参与靶蛋白的生理功能。,分子伴侣的功能：,指导,合成肽链正确折叠；,使肽链保持伸展状态，有利于蛋白质的分拣和跨膜转运；,应激状态下，防止蛋白质变性后内部疏水基团暴露而发生不可逆的凝集；,另外，还参与,新复制DNA与组蛋白装配成染色质,，,蛋白质的降解,，类固醇激素,受体的变构,，某些,酪氨酸蛋白激酶的活化,等多种生理生化过程.,分子伴侣的分类,按分子量大小分类，尚无明确界定。,(1)伴侣蛋白（,chaperonin,）：,具有独特双层7-9元环状结构的寡聚蛋白,包括GroEL蛋白和热激蛋白60等,。,功能：,蛋白质正确折叠和亚基组装。,(2)应激蛋白70家族(Stress-70 family)：,一类分子量约70kD的高,度保守的ATP酶，广泛分布于原核和真核细胞中，如大肠杆菌胞浆,DnaK/DnaJ,高等生物内质网Bip,Hsc1,Hsc2,Hsc4或hsc70,胞浆,Hsp70,Hsp68和Ssal4p,线粒体中的Ssclp,Hsp70等。,(3)应激蛋白90家族(Stress-90family):,分子量90kD左右,如大肠,杆菌胞浆HtpG,酵母胞浆Hsp83与Hsc83,果蝇胞浆Hsp83,及哺乳类,胞浆Hsp90与内质网Grp94（Erp90或内质网素endoplasmin）等.,其他分子伴侣：,eg.,核质素,T受体结合蛋白(TRAP),大肠杆菌的SecB和触发因子,（trigger factor）及PapD,噬菌体编码的支架蛋白(scaffolding,proteins)等均具有重要的分子伴侣功能。,eg.,嗜热菌枯草芽孢杆菌,中的,“冷激”蛋白Bs-CspB,和它的,嗜热伴侣,Bc-Csp,分别为,67和66AA,3D结构相似，仅12AA,（均在分子表面）差,异，但,Tm值分别为54和77,，突变分析表明，只有Arg3和Leu66,对Tm产生重大影响。,分子伴侣不仅与胞内蛋白的,折叠与组装,密切相关，还影响,蛋白,质的转运、定位或分泌；,也与,信号转导中信号分子的活性,相关。,Hsp70介导的蛋白质折叠,Hsp70的ATPase结构域,Hsp70的肽链结合结构域,天精亮亮亮苏甘,3.分子伴侣作用机理,热激蛋白70,GroEL,（也称Hsp60）,14个相同的亚基组成，形成两个七聚体的环,；每个亚基结合一个ATP。两个环上下堆叠在一起，中间形成一个通道。,GroES,（Hsp10）:七聚体复合物，与GroEL结合，帮助GroEL完成蛋白质折叠，因此称为,辅分子伴侣(Co-chaperonin),。,上面观,侧面观,GroEL的两个环,GroEL 与 GroES,近侧,GroES辅助的GroEL 作用模式,蛋白质进入通道,GroES 结合使通道扩大,近侧环内的ATP水解，,蛋白质折叠,远侧环内的ATP水解，蛋,白质和GroES从 GroEL释放,伴 侣 蛋 白,Media Connections,三、翻译同步转运和翻译后转运,真核细胞所有蛋白质的起始合成都是在,游离核糖,体上,1.翻译同步转运（co-translational translocation）,2.翻译后转运（post-translational translocation）,高尔基体,内质网,游离核糖体,细胞质,细胞核,线粒体,过氧化体,分泌途径,（翻译同步转运）,（翻译后转运）,小泡介导,小泡介导,溶酶体,叶绿体,跨膜转运,通过核孔,内体,网状内皮系统,1.翻译同步转运（co-translational translocation）,翻译同步转运：,在游离核糖体上合成,蛋白质N-端信号序列,信号,序列指导,核糖体与内质网膜结合,，使新生肽链边合成边,进入,内质网腔,(ER lumen）,.,进入内质网腔或膜的蛋白质:,一部分,留在内质网；,另一部分,形成转运小泡（transport visicle）被运输到,各,网状内皮系统，,并分泌或处理,.,调控型分泌（regulated secretion）：,分泌物如激素、粘液或消化酶,组成型分泌（constitutive secretion）：,更新膜蛋白和膜脂、细胞外基质、养分和信号分子。,内质网上蛋白质合成：,(1)分泌性蛋白,进入内质网腔,(2)膜蛋白,插入内质网膜,(1)分泌性蛋白,进入内质网腔,蛋白质进入内质网腔的分子调控基础：,信号序列,信号识别颗粒和受体,易位子,能量供应,16-30AA，通常位于N-端，在,极性区（Polar）,含1-2正电荷AA,，紧接其后是,连续6-12疏水aa,的,疏水区,；,引导,游离核糖体与内质网结合,起始新生肽,向内质网膜转运；,信号序列中,疏水残基,与内质网膜上,受体蛋白,结合；,合成后,信号序列被,信号肽酶,（signal peptidase）,切除（,切割位点的1,3位偏爱小R基氨基酸Gly,Ala;而芳香、碱性及大R基AA则抑制切割,）,。,信号序列,信号识别颗粒及其受体,信号识别颗粒(SRP):,由,6条多肽链,(P54,P9/P14,P68/P72,P19),和,300个核苷酸,的7SRNA组成的,核糖核蛋白,（ribonucleoprotein）,信号识别颗粒受体（SRP receptor),又称,停靠蛋白（docking protein）,两个亚基组成：,subunit,为,膜蛋白,，含300个氨基酸残基,subunit,是,膜周边蛋白,含640个氨基酸残基，负载着GDP，,并且有,GTP酶活性.,SRP receptor功能:,与SRP结合并引导肽链向内质网膜转运；使肽链的延长,继续,进行.,易位子（translocon）,新生肽链N-terminus带有正电荷,，不易进入疏水内质网膜。,需内质网膜提供一个,水相通道（aqueous channel）,即易位子。,易位子含两种蛋白成分：,转位链相关膜蛋白,（translocating chain-associated membrane,protein,TRAM protein）:,TRAM 蛋白至少跨膜8次，能与新生肽链进行交联，,启动所有蛋白质的转运,（也称易位子相关蛋白）,Sec61蛋白:,易位子通道主要由,Sec61,三个膜蛋白,组成。Sec61含10个跨膜helices,与Sec61和Sec61共同形成,Sec61复合物,。这个,复合物能与核糖体大亚基紧密结合,，从而把核糖体与内质网膜连接起来，,启动部分蛋白质的转运,。,易位子结构,电镜下的易位子通道(炸面窝),易位子的功能,无蛋白质转运时,易位子胞质面被,Sec61,的一个片段关闭,;,核糖体-新生链复合物与内质网结合后，,易位子打开，同时,核糖体与易位子之间紧密密封,以,防止小分子物质进入易位子,;,肽链通过易位子通道进入内质网,.,分泌蛋白通过内质网膜进入内质网腔的全过程,膜蛋白插入内质网膜,以翻译同步转运方式,一边合成一边插入内质网膜,;,合成完毕后,部分留在内质网膜,大部分通过小泡转运到质膜或细胞外,;,膜蛋白插入内质网膜的过程需要,多种信号序列；,在转运过程中，蛋白质的,方向保持不变。,型膜蛋白,型膜蛋白,影响蛋白质方向的因素,由于蛋白质,信号锚定序列,两侧的亲水氨基酸残基的极性不同,，,故插入膜时,正电性强的一端总是朝向细胞质侧,，由此决定蛋白质,在膜上的定位方向。,信号锚定序列的长度,对蛋白质的方向也有影响。,含有长的疏水,片段（20 个残基）的一般是型膜蛋白。,型膜蛋白,II型膜蛋白,正电性强的一端总朝向细胞液侧,型膜蛋白,型膜蛋白,信号锚定序列：,有两种类型。型序列介导穿膜蛋白的N端域移位，型则介导C端肽链移位。,膜蛋白插入内质网膜的方式,、型膜蛋白形成机制,多跨膜蛋白质（multipass ransmembrane,protein）,与糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidyl,inositol,GPI）共价结合的膜蛋白,、,型膜蛋白形成机制,型膜蛋白,的C-terminus在细胞液，含有,N-端信号,序列和停止转运-锚定序列,（stop transfer-anchor sequence）.,如胰岛素受体,有,信号-停止转运-锚定序列,（signal-stop,transfer-anchor sequence），再如细胞色素P450,型膜蛋白,N-terminus在细胞液,如脱唾液酸糖蛋白（asialoglycoprotein）,型膜蛋白举例(胰岛素受体),含,一个N-terminus信号序列,和,一个停止转运-锚定序列；,序列中,22个疏水氨基酸的停止转运-锚定序列,，进入易位子后能,阻止新生肽链向内质网转运；,肽链合成结束后,，停止转运-锚定序列从易位子中移动出来，接着锚定在磷脂双层中。,型膜蛋白（脱唾液酸糖蛋白）,脱唾液酸糖蛋白,含一个信号-锚定序列,，引导新生肽链进入内质网，但信号序列的,N-terminus在细胞质。,信号序列进入易位子后，C端肽链继续合成，逐步进入内质网。核糖体始终结合在内质网膜上，直至蛋白质合成结束。,多跨膜蛋白质,多跨膜蛋白质（multipass transmembrane protein）：,是指,含有多个跨膜区段（疏水helices）的蛋白质。,第一个,helices是,信号-锚定序列,，进入易位子后新生肽链在内质网,内延伸，直到第二个helices形成,第二个,helices 是,停止转运-锚定序列,，阻止肽链进一步延伸，然后,与第一个helices一起锚定在内质网膜中,依次类推，,第三个,信号-锚定序列,入易位子，,第四个,停止转运-锚定序列,。,与GPI共价结合的膜蛋白,某些膜蛋白可借助,停止转运序列旁侧的氨基酸序列,信息,被内质网中的,转肽酶（transpeptidase）识别,，将,肽转到,糖基磷脂酰肌醇,上。,Media Connections,翻 译 同 步 转 运,2.翻译后转运（post-translational translocation）,指蛋白质合成时，核糖体不与任何细胞器相连，在,游离核糖,体(free ribosome),上合成的蛋白质的转运。因此，在,游离核糖体上合成的蛋白质的跨膜转运须解决一个问,题：,即,在膜上构建一个特殊的通道使蛋白质穿过疏水膜,。,（1）转运到线粒体（mitochondria）,（2）转运到叶绿体（chloroplast）,（3）转运到过氧化体（peroxisome）,（4）转运到细胞核（nuclear）,蛋白质合成后的分拣(sorting)、投递（traffcking）和到位（localization）,翻译同步转运,翻译后转运,不同类型的信号序列,（1）转运到线粒体（mitochondria）,线粒体和叶绿体,自主蛋白质约10%,，其他都在,细胞质游离核糖体,中合成。,线粒体和叶绿体蛋白质的信号序列有,三种,：,基质信号序列,内膜腔信号序列,停止转运序列,线粒体蛋白转运的特点,转运信息,存在于N端基质信号序列中,只有,未折叠的蛋白质,才可以转运,转运发生,在外膜与内膜紧贴处,(细胞色素c例外),需ATP及复合物通道（内膜和外膜中）参与。,线粒体到位序列实验,无细胞体系中合成酵母线粒体蛋白；,一组加入胰蛋白酶处理；另一组加入线粒体后，再加入胰蛋白酶处理。,基质信号序列：,20-30AA(,N端),，,富含带,正电荷,（Arg,Lys）和含,有,羟基的氨基酸残基,（Ser,Thr）,易形成,两亲螺旋,。,信号肽进入,基质后被切除.,酵母细胞色素c氧化酶亚基的基质信号序列,线粒体基质蛋白的转运,线粒体基质蛋白的转运,这类蛋白质为,可溶性、定位于基质,内膜与外膜贴近处进入。,胞质伴侣蛋白,防止蛋白质折叠、聚集,以,保持伸展状态;,基质Hsp70,结合,防止蛋白质聚集和错误折叠;,少数,蛋白,入基质后可,自发折叠,，,多数蛋白,还需Hsp60辅助。,线粒体蛋白转运相关蛋白,受体蛋白-Tom,存在于,线粒体外膜,Tom40,嵌入在膜内,，,形成转运通道,Tom 37,70,71,识别少量含有内部信号序列,的蛋白质,Tom 20/22,复合物,识别蛋白质的,N-terminus,信号序列,Tom5,6,7,可能是,通道的组成成分,，也可能是通道的组装因子,受体蛋白 Tim,Tim,存在于,线粒体内膜,由多种蛋白质组成：,Tim 17/23、Tim 22/54、,Tim 44、Tim 9/10 和,Tim 8/13,Tim 44：,分别与Tim17/23和Hsp70结合。使蛋白质进入基质就能立即与Hsp70结合。,Tim9/10,和,Tim8/13,：,将,Tom,转运来的蛋白质“护送”到,Tim,。,内膜有两种通道：,Tim17/23:,转运进入,线粒体基质,的蛋白质。,Tim22/54:,转运定位在,内膜上,的蛋白质,Tim9/10:,能把蛋白质,护送,到Tim17/23,和Tim22/54,Tim8/13:,只能,护送,蛋白到Tim22/54,有些蛋白质不被为二者护送说明还,存在着,其他途径,。,能量供应,胞质伴侣蛋白,水解ATP，以保持蛋白质的,伸展状态；,基质伴侣蛋白,辅助进入,基质的,蛋白质,正确折叠,需水解,ATP,供能；,蛋白质,跨越内膜时,需要,电化学梯度,以提供,质子动力,（,proton-motive force,）,但,跨越外膜时不需要,.,蛋白质转运到线粒体内膜腔,转运到内膜腔的蛋白质有,线粒体基质和线粒体内膜跨越信号,。,细胞色素 c,1,的信号序列,N端,有两个信号序列:,整个蛋白质进入基质后，第二个信号序列（含有,连续的不带电荷的氨基酸残基,）引导它跨越内膜进入内膜腔.,细胞色素c1和细胞色素b2转运到内膜腔,保留性机制,非保留性机制,蛋白质转运到内膜腔有,多种分拣机制,。,蛋白质插入到线粒体内外膜,这类蛋白,富含苯丙氨酸和酪氨酸,不含色氨酸,。,如ADP-ATP载体蛋白（AAC）、孔蛋白等，,定位信号不在N端，而,在内部,（AAC在72-115）。,含1个以上的穿膜肽段，进入外膜的蛋,白有受体。,插入外膜,的蛋白质含有,基质信号序列和停止转运锚定信号,序列,。当,蛋白质在进入基质时，停止转运序列使蛋白质停止,转运,并锚定在外膜中；,插入内膜,的蛋白质具有几种不同的转运途径（图）,线粒体内膜蛋白到位有三种途径,Oxa1:Alb3/Oxa1/YidC,内膜蛋白家族.,（2）转运到叶绿体（chloroplast）,叶绿体蛋白质转运到基质中的方式与线粒体基本相同，,不同,的是叶绿体不能产生,电化学梯度,，所以,没有质子动力驱动,；定位,序列,多含碱性AA,富含Ser和Thr,序列长度20-120AA,;,内外膜转运,通道蛋白,分别称,Toc和Tic,.,类囊体（thylakoid）,在叶绿体基质中，是单层膜围成的扁,平小囊。,转运到类囊体,的蛋白质含有,基质信号序列,和,类囊体信号,序列,，不同的蛋白质含有不同的类囊体信号序列,。,进入类囊体的,蛋白质具有不同的受体,。,如,质体蓝蛋白和金属结合蛋白,分别,与各自的受体结合,后进入类囊体,（3）转运到过氧化体（peroxisome）,过氧化体是单层膜，所有的蛋白质都由核基因编码,，通过转运,进入,过氧化体基质.,大部分过氧化体蛋白,C端有SKL信号,或相关序列。,过程:,细胞质可溶性的,过氧化物酶体定位信号受体1,（PTS1R）与信号序列结合,再与过氧化体膜上的,过氧化物酶体膜锚定蛋白受体,（Pex14p，已鉴定出Pex1p-Pex22p）,结合,然后在,ATP水解驱动,下进入过氧化体。蛋白质进入后,SKL序列不被切除.,有些过氧化体蛋白,含有,N端信号序列,，与,细胞质受体PTS2R,结合,再结合到膜受体Pex14p上，然后进入过氧化体,。进入后信号序列,被切除.,过氧化体膜蛋白,不含SKL序列，其转运过程未知.,过 氧 化 氢 酶 进 入 过 氧 化 体,过氧化氢酶四聚体,PTS1R:,Peroxisomal targeting signal 1 receptor,Pex14p:,Peroxisomal membrane anchor protein,（4）转运到细胞核（nuclear）,入核蛋白质:,都含有,核定位信号,序列（nuclear localization,signal,NLS,）。,特征：,含,4-10个氨基酸,信号序列；序列中偏爱碱性氨基酸,（Lys,Arg,Pro）序列上游的,Pro以防止helix的形成,；疏水氨,基酸残基很少。,出核蛋白质：,含有,核输出信号序列,（nuclear Export signal,NES,）,NES由大约,10个氨基酸残基,组成，,富含Leu,。,NLS,核孔复合物,蛋白质通过核膜上的,核孔,进入细胞核，在真核生物中，,核孔是一个近100种,蛋白质,（酵母近30种）组成的大于120mDa的巨大复合物。,核孔对输入分子有分子量限制。,蛋白质输入细胞核与 Ran 循环,Ran：,是一种小的 GTP 酶；,核输入受体：,importin 和importin，异源二聚体；,Ran GAP：,Ran GTP 激活蛋白，于细胞质；,RCC1：,Ran 核苷酸交换因子，于细胞核。,蛋白质输出细胞核的过程与输入细胞核相似。,eg:,P53:,转录因子保留在核中,当P53的四聚体转变成二聚体或单体时,NES暴,露,穿梭出核。,eg:,PRAK（,p38调节活化蛋白激酶,）:,含核输出信号和核定位信号，从而具有,核质穿梭作用。,1,2,3,4,5,6,Ran 循环,Mechanism of Protein Import into the Nucleus,溶酶体分拣信号,甘露糖6-磷酸（M6P）,溶酶体酶,在内质网被部分糖基化，由,非网格蛋白包被小泡,运到,内侧高尔基体。先由,N-乙酰氨基葡萄糖磷酸转移酶,在,甘露糖6-OH,上添加,磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖,，再由,磷酸二脂酶水解除去,N-乙酰,氨基葡萄糖,，产生,分拣信号M6P,；再与受体结合被转运。,溶酶体酶的甘露糖磷酸化,M6P,GlcNAc,M6P 分拣途径,已发现两类受体：阳离子依赖性受体（CD-MPR，二聚体）和阳离子非依赖性受体（CI-MPR，单体）,滞留在细胞质中的蛋白质,决定滞留在细胞质中蛋白质的信号知之甚少。,不含已,述信号的蛋白质留在细胞质是不令人信服的。,发现有相当多的细胞质蛋白质的,N端被酰化。,酰化是不,是滞留细胞质信号？如果是侧是一种,非肽类信号。,Media Connections,翻 译 后 转 运,四、小泡运输的机制,小泡的萌发、形成及融合需要许多蛋白质参与,（1）小泡的类型,（2）小泡的融合,小泡运输过程中保持生物膜的不对称性,蛋白质不会因小泡的萌发和融合而释放到胞液中,（1）小泡的类型,根据,小泡外包被蛋白的不同,，可将小泡分为,三种,，,包被蛋白与小泡可逆性聚合，蛋白质差异很大。,网格蛋白（clathrin）包被的小泡,包被蛋白（COP ）包被的小泡,包被蛋白（COP）包被的小泡,网格蛋白（clathrin）包被的小泡,笼形蛋白,哺乳动物细胞表面有一,些内陷的区域，称为,有,被小窝,（coated pit）,这些有被小窝的形成需,要,三种蛋白质,成分：,a.网格蛋白（clathrin）,b.连接蛋白（adapter protein）,c.发动蛋白（dynamin）,网格蛋白,（,clathrin,）,一种纤维蛋白，由 3 条重链和 3 条轻链组成，形状象 3,个分支的树叉，又称,三脚蛋白复合体（triskelions）,b.连接蛋白（adapter protein）,现已发现多种连接蛋白（adapter protein/adaptin）。,adaptin,与网格蛋白骨架相连；,adaptin,识别内化作用（internalization）膜受体中酪氨酸分拣信号（YXX,为大疏水R基,）；,和/或 adaptin,在组装连接子时与膜发生相互作用。,连接蛋白有不同亚型，亚基间,形成,异源四聚体,，称为,连接子,（adaptor,AP）,AP1：,高尔基体 内体（endosome）,AP2：,质膜 内体,AP3：,高尔基体 溶酶体，液泡,（vacuole），黑素小体,（melanosome），血小板小,体（platelet vesicles）,不同的连接子介导不同转运过程,c.发动蛋白（dynamin）,一种细胞质蛋白，约由 900 个氨基酸组成；,能结合并水解 GTP；,发动蛋白的亚基围绕萌发,小泡的“颈部”进行多聚化,，然后水解 GTP，使小泡与膜相连的部位收缩，直至小泡解离。,小泡萌发时各种蛋白质的掺入及对膜蛋白的选择,被排除的膜蛋白,网格蛋白,连接子,发动蛋白,网格蛋白包被小泡的解聚,网格包被小泡形成后就进行解聚,解聚由细胞质伴侣蛋白,Hsp70,催化,生成的网格蛋白可再利用,包被蛋白（COP）包被小泡,回收、转运内质网,逃逸蛋白（escaped proteins）,，,这些蛋白C端具有,回收信号序列（retrieval signals）,。,COP:,含7个亚基（,）,各亚基聚集在一起形成,包被体（coatomer）;,ADP核糖基化因子（ADP ribosylation factor,ARF）：,一种小GTP结合蛋白;,包被体与ARF结合，引起局部的,膜突起;,小泡与膜解离需要,脂酰辅酶A,（fatty acyl CoA）的参与，但具体机制未知.,COP 小泡的形成,脂酰辅酶 A,COP小泡的解聚,核糖基化因子（ARF）脱落,COP 小泡的功能,介导蛋白质从,高尔基体向内质网,运输,介导蛋白质在,高尔基体内,部进行逆向转运（retrograde transport）,包被蛋白（COP）包被小泡,COP小泡的形成过程,与 COP相似,，但所需要的,蛋白成分不同;,COP的,包被和连接蛋白,包括：,Sec23/24复合物，Sec13/31 复合物，Sec16;,COP的小 GTP 结合蛋白是 Sar1;,介导蛋白质从,内质网运输到高尔基体；,包被发生在,内质网出口（exit sites），这些部位没有核糖体。,（2）小泡的融合,运输小泡有不同的包被蛋白，但小泡与靶膜的融合有,着共同的特征.,相关因子：,N-乙酰马来亚胺敏感因子（,N-ethyl maleimide-sensitive,factor，,NSF,）,同源四聚体，能,结合并水解 ATP;,可溶性NSF连接蛋白（,soluble NSF attachment proteins，,SNAP,）,：如-，-，SNAP，,辅助 NSF 与膜结合;,SNAP受体（,V-SNARE,）：,小泡萌发时掺入小泡，与特异的靶,膜SNAP受体（,T-SNARE,）作用，,引导小泡与特定的靶膜融合;,Rab蛋白：,GTP结合蛋白，GTP置换GDP，Rab构象变化，与特,定小泡膜表面蛋白结合。GTP水解使Rab蛋白释放出来并进,入下一个循环。,Rab蛋白在小泡融合过程中起调节作用.,小泡与受体膜的融合,V-SNARE,与,T-SNARE,相互作用使,小泡附着在受体膜上；,前融合复合物,形成。需要许多,V-,SNARE,与,T-SNARE,相互作用，GTP水解。,能被N-乙酰马来亚胺阻断，证明 NSF是必需的；,融合，具体机制未知；,解离，可能由NSF和SNAP催化；,含有 V-SNARE 的小泡重新形成,V-SNARE,T-SNARE,Rab-GTP,受体膜,卷曲螺旋型,螺旋,Rab-GDP,囊泡膜,靶膜,无序的SNARE模体,各 种 类 型 的 小 泡 运 输,网格蛋白包被的小胞：,胞吞作用；高尔基体,到内体、溶酶体等,COP包被的小泡：,高尔基体到内质网；,高尔基体内部逆向,转运,COP包被的小泡：,内质网到高尔基体,Media Connections,小 泡 运 输,五、受体介导的胞吞作用和内化蛋白质的分拣,受体介导的胞吞作用,（receptor mediated endocytosis）:,指细胞表面的,特异受体识别细胞外配体,，受体-配体复合物的细胞膜区,内化（internalization）,形成转运小泡，从而使受体-配体复合物得到运输；,配体内化的效率取决于其在细胞表面受体的浓度。,受体介导的内吞作用是,一种选择浓缩机制,，,既可保证细胞大量地摄入特定的大分子，同时又避免了吸入细胞外大量的液体。,（如低密脂蛋白、运铁蛋白、生长因子、胰岛素等,）,一些,由,小窝蛋白（caveolin）组成的小窝（caveolae）,含有一些受体蛋白，能介导特定类型的胞吞作用。但,大多数,受体介导的胞吞作用是,网格蛋白包被的小泡。,膜受体的胞质侧含有特异的分拣信号,，它们决定蛋白质形成小泡的类型以及运往的位置,不同蛋白质的分拣信号,（X=任何氨基酸，=R较大的疏水氨基酸）,LDL 的胞吞,肝细胞和成纤维细胞的,小窝占膜表面积的2%,，,小窝就是分子过滤器（molecular filter），,类似结构也存在于高尔基体的,TGN区（,trans Golgi network,）,跨膜受体蛋白的胞质端有（Tyr-X-X-）信号，,LDL受体缺陷，不能胞吞，患动脉粥样硬化，冠心病,受体运输到质膜进行再循环,转铁蛋白循环,转铁蛋白,脱辅基转铁蛋,白在中性pH,下与受体解离,pH 7.0,网格蛋白,pH 6.0,脱辅基转铁蛋白,晚期内体,转铁蛋白受体,铁离子释放到细胞质,低pH使铁离子与配体解离，,但配体仍与受体结合,pH 5.0,方式 受体去向 配体去向 举例,1 再循环 再循环 运铁蛋白,2 再循环 降解 LDL,3 降解 降解 上皮生长因子,运出细胞 运出细胞 母体的免疫球蛋,白通过胎盘,受体介导的胞吞作用中受体与配体的去向,一些蛋白质,通过,受体介导的内吞作用,进入细胞后就留在细胞内，然后进行轻度加工，如,卵黄原蛋白（vitellogenin）,。,一些蛋白质,转运是通过,胞转作用,（transcytosis）完成的。,胞转作用,是一种跨越细胞的运输过程，即,在细胞的一侧通过,胞吞,作用使物质进入细胞，然后通过,胞吐,作用在细胞,的另一侧将物质分泌到细胞外。,如,母体免疫球蛋白,通,过初生小鼠的小肠内皮细胞进入小鼠体内的过程就是,胞转作用,初生小鼠免疫球蛋白的胞转作用,受体介导的胞吞作用的功能,将胞外代谢物运输到胞内,。如铁离子、LDL、维生素 B,12,等；,是,细胞应答肽类激素和生长因子,的调节方式之一。通过胞吞,作用使,细胞表面受体数目减少,，使细胞对激素及生长因子的应答减弱，称为,受体的下降调节；,将需要,降解的蛋白质,内吞作用,溶酶体,。如巨噬细胞清除血液循环中被损伤的蛋白质；,某些,病毒或细菌毒素,进入细胞,。如,HIV,病毒、白喉毒素等。,Media Connections,LDL 的 胞 吞,第二节 蛋白质的加工与修饰,二硫键的形成,内质网中蛋白质的质量控制,蛋白质的共价修饰,蛋白质前体的加工,多亚基蛋白的组装,蛋白质糖基化,肽链的加工修饰,两个方面：,氨基酸侧链的修饰，肽键的断裂和肽段的切除,肽键的断裂修饰：,N端信号肽的切除：,真核信号肽的切除与内质网膜上的,信号肽酶,（亚基分子量12kDa,18kDa,21kDa,22/23kDa和25kDa）相关，其中18kDa和21kD亚基含有丝氨酸为中心的活性部位，与酵母中的Sec11p是同系物。,前肽的激活：,酶原和激素原（如弗林酶，胰岛素原），,酶切位,点,主要是,原肽旁侧的氨基酸,（1个，2个,和4个碱性氨基酸，ArgLys）,一个肽可产生一组肽。,N,C,垂体中叶,肽转换酶（PC1/3）,ACTH,-LPH,PC2,垂体前叶和中叶,-MSH,CLIP,内啡肽,-LPH,阿黑皮素原,CLiP:,染色单体连接蛋白(chromatid linking protein),LPH:,促脂解激素,MSH：,促黑激素,ACTH：,促肾上腺皮质激素,肽链的自我剪接。,蛋白质自我切去内含肽（intein），保留外显肽（extein）,蛋白质除去内含肽,内含肽的剪切,mRNA 剪切的比较,1.二硫键的形成,在真核细胞中，,二硫键是在粗面内质网腔中形成,的，所以,只有分泌性蛋白和膜蛋白的腔面结构域含有二硫键,谷光甘肽（,glutathione,）,是一种三肽，是真核细胞中含有巯基的主要分子。,细胞质中,GSH,与,GSSG,的比例是,50:1,，说明细胞质中没有二硫键形成,GSH,PDI 催化的二硫键重排,二硫键的形成的顺序：,首先在小结构域内形成，然后是远距离,的片段之间形成。,蛋白质的成熟需进行二硫键的重排：,催化重排的酶是,蛋白质二,硫键异构酶,（protein disulfide isomerase,PDI）,。,如果PDI与蛋白质结合后，,形成了不可逆的错误,，,PDI可从错误折叠的蛋白质上脱离。,2.蛋白质的质量控制,（1）蛋白质折叠,（2）未折叠或错误折叠的蛋白质留在内质网,（3）泛素介导的蛋白酶解,（4）内质网蛋白从内侧高尔基体运回内质网,（1）蛋白质折叠,许多变性的蛋白质在,体外能自发地进行折叠,，但往往需要,几个小时,才能完成。而,分泌性蛋白质,在内质网腔中的折叠仅需,几分钟；,内质网含有多种蛋白质，能,加速新合成蛋白质的折叠,，,如,伴侣蛋白,Bip,、,钙连接蛋白（,calnexin,）、,钙网蛋白（,calreticulin,）、,蛋白质二硫键异构酶（,PDI,）、,肽基脯氨酰异构酶（,peptidylprolyl,isomerases,PPI,）,钙连接蛋白,和钙网蛋白(Calreticulin)构成了内质网内蛋白质折叠和装配的监控系统,GT：,葡萄糖转移酶,葡萄糖苷酶,错误,依赖于GLUT1,顺式Pro有利于肽键的折叠：,蛋白质中肽键绝大多数是反式构型,，但有,6%的肽基与Pro残基之间的肽键是顺式的,。,肽基脯氨酰异构酶：,催化未折叠肽段中肽基和Pro残基间的肽链旋转，,这种异构化作用往往是蛋白质结构域折叠的限速步骤。,（2）未折叠或错误折叠的蛋白质留在内质网,大多数情况下，,未正确折叠的蛋白质永久性地与内质网伴侣蛋白结合，再不能进行转运到位。,当,过多的未折叠蛋白积累于ER,，会加重ER肽链折叠的负担，细胞会发出信号，,暂停,核糖体工作，以缓解ER的压力，该过程称,未折叠蛋白反应（应答）（unfolding protein response,UPR）,也称内质网应激（ER stress）。,内质网应急：,增加内质网伴侣蛋白和其他相关酶的表达量。,关键作用是:,内质网跨膜激酶（,即,内质网跨膜蛋白需肌醇酶1，,inositol requiring enzyme 1,IRE1),IRE1,的,内质网腔面为,未折叠蛋白质的结合位点,，,细胞核面有,激酶和核酸内切酶活性,。IRE1与未折叠蛋白质结合，促进,HAC1,表达,HAC1,促进UPR相关蛋白(BiP、calnexin、PDI 等)的表达.,ER中,分子伴侣是Bip/GRP78,最重要,在ER中浓度约100mg/ml；,正常时：,Bip多与IRE1、ATF6和PERK结合。,内质网应急时：,需,大量,BIP，因此Bip与IRE1、ATF6和PERK解离，,并与未折叠蛋白结合。,ATF6,进入高尔基体加工后入核,激活UPR相关基因,;,IRE1,二聚化,激酶和Rnase被,激活,XBP1剪接，并入核,促进EDEM,GRP78,ERdj3等(蛋白质量监控)转录,，,促进蛋白降解,;,PERK,二聚化激活,促eIF2磷酸化,降低eIF2-GTP-tRNAmet的形成,抑制蛋白质合成,.,错误折叠蛋白形成聚集体,一些错误折叠蛋白降解前，在,动力蛋白,的作用下沿微管向细胞核旁中心体附近的,微管组织中心（MTOC）募集,，,在,波形蛋白（中间丝蛋白）作用下形成聚集体（aggresome）。,此时,分子伴侣和泛蛋白体系也向聚集体靠拢。,新生肽链折叠的质量控制的两种方式,a:原核细胞 b:真核细胞,(3)蛋白质的降解,除少数蛋白（如肌动蛋白，血红蛋白，半衰期50天），多数蛋白半衰期以分钟计。,胞内蛋白质降解有,多种方式：,氧化敏感氨基酸侧链,（精,赖,脯）,使蛋白质失活,；,泛素化识别序列,（,PEST：Pro/Glu/Ser/Thr),PEST结构域的磷酸化导致钙的结合能力提高，促进钙依赖性蛋白酶对蛋白质的降解,;,N端氨基酸规律,（如Ser20h;Asp=3min)，N端氨基酸介导的,蛋白质周转机制尚不清楚。,蛋白质降解：,清除错误蛋白，实现蛋白质的周转；,通过,胞吞或胞饮进入细胞的,胞外蛋白质,和,胞内蛋白,由两种途径降解：,内体溶酶体途径：,凝血因子，免疫球蛋白，白蛋白载体蛋白，激素等胞外蛋白通过该降解体系；只要进入溶酶体的生物分子均会被降解，因此，属,非特异降解体系,。,泛素蛋白酶体途径：,绝大部分胞内蛋白的降解通过该体系；泛素体系是,特异、选择性、可控的依赖于ATP的蛋白质降解途径。,泛素/泛蛋白（ubiquitin）:,76个氨基酸残,基的碱性蛋白质，,高度保守的蛋白质，从酵,母,人类只有3个AA差异。,广泛存在于真核细胞（细菌中不存在,泛素途径,）。分子5,链,1个，C-Arg-Gly-Gly从球形域中伸出.,泛素C端Gly的羧基,能与靶蛋白质中,Lys残基的氨基,形成肽键，使泛素与蛋白质共价结合。,泛素增强蛋白