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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Morphogenesis:Vertebrate Limb Development,第十四章 附肢的发育和再生,附肢发育的研究是发育生物学的一个重要课题,。脊椎动物，特别是鸟类和两栖类附肢（limb）的发育包含了大量的、各种各样的诱导作用。,有尾类的蝾螈和美西螈附肢具有明显的再生能力，,是研究再生的极好模型。,一、脊椎动物附肢的发育,脊椎动物的附肢是一个极其复杂的器官，每一块骨和肌肉的位置都被精密地组织在一起。,附肢在三个基本轴上是不对称的，但左前肢总是和右前肢呈镜面对称,。,脊椎动物的附肢都是由体壁中胚层和外部的表皮共同组成的,。,孵化10天的完整鸡翅标本，示三个发育轴：近侧-远侧轴、前后轴及背腹轴。,在所有的四足动物中，附肢发育的,基本形态发生原则（basic morphogenetic rules）,是相同的。,构建一个附肢所需要的位置信息要在一个三维（或包括时间在内的四维）的、相互协调的系统中发挥作用。现在已鉴定了一系列蛋白，在附肢近远轴、前后轴和背腹轴的形成过程中发挥作用。,1、附肢的起源,脊椎动物的附肢在起源上是由胚胎体壁向外生长形成的,，主要是由来自中胚层的疏松间质形成的,中央核,，以及来自外胚层的,表皮,两大部分组成。,附肢的原基称为附肢芽（limb bud）,。附肢芽形成的位置在每一物种是恒定的，由Hox基因沿身体前后轴表达的水平决定。,鸡胚胎的肢芽,。,孵化后第三天胚胎的侧面出现肢芽,翅肢芽,腿肢芽,顶外胚层嵴,美西螈（,Ambystoma maculatum,）的预定前肢场,前肾,肩带,腮周侧翼组织,附肢,腮,体节,2、附肢的早期发育,附肢早期发育的第一个迹象是体节中胚层细胞沿胚胎长轴的增殖，逐渐在表皮的下面形成厚的细胞团,它们从附肢场的,侧板中胚层,和,体节中胚层,分离出来，进而转变为间质细胞进行迁移。,附肢的发育开始于间质细胞从附肢的,骨骼前体细胞,(,limb skeletal precursors,)和附肢的,肌肉前体细胞,(,limb muscle precursors,)分离后的增殖，这些细胞在内胚层组织下聚集并形成一环状的突起，此突起称为肢芽。,Induction of the early limb bud:Wnt proteins and fibroblast growth factors(FGFs),肢芽形成的信号来自于侧板中胚层(,lateral plate mesoderm,)细胞，这些细胞会分泌成纤维生长因子,FGF10,，而,FGF10,能够促使外胚层和中胚层之间分肢形成的交互作用。,当含有,FGF10,的小珠子被放置于侧翼内胚层下方，会有额外的分肢形成。,(A)在分肢正常形成之处的侧板中胚层lateral plate mesoderm里，有FGF10表现。(B)当将会分泌FGF10的细胞转植于鸡胚的侧翼时，FGF10会使一异位的分肢形成。,FGF10的表达及其在鸡肢发育过程中的作用,Wnt proteins and fibroblast growth factors(FGFs),FGF10原本分布于整个侧板中胚层，但是在附肢形成之前，FGF10便被限制在侧板中胚层将形成附肢的区域，FGF10被限制主要与Wnt proteins有关。,孵化4854h鸡胚附肢芽开始形成的分子模型,如图所示，一开始FGF10表现于整个侧板中胚层，然后在后肢形成之处，受到Wnt8c限制。而在前肢形成之处，则受到Wnt2b限制。FGF10经由外胚层的Wnt3a来诱发顶外胚层嵴(AER)中的FGF8表现，FGF8能诱导并维持Wnt proteins表现，使得FGF10于侧板中胚层内能连续性地表现。,顶外胚层嵴,前肢、后肢的分化,Gain-of-function实验结果表明，,转录因子,TBX4和TBX5,分别与后肢和前肢的特化有关,。,Loss-of-function资料也表明，人类,TBX5,基因缺失会导致上肢和心脏的异常，但下肢基本不受影响。,TBX4和TBX5在FGF10诱导形成的肢芽中的表达,异位表达TBX4，可以使FGF10诱导形成的前肢转变为后肢,扫描电镜观察孵化4.5 天的鸡胚肢芽，显示顶外胚层嵴AER。,附肢发育中外胚层和中胚层间的相互作用,附肢的向外生长涉及AER和中胚层间持续的相互作用。,一旦中胚层诱导其上方的外胚层形成AER，AER与中胚层的相互作用对附肢的向外生长是最重要的。,中胚层在附肢发育中也起着关键的作用,。AER起初的形成和继续存在依赖于位于其下方的中胚层。,渐进带(PZ)在附肢发育中的作用,渐进带位于肢芽的顶端，由快速分裂和增值的未分化细胞组成。顶外胚层嵴位于渐进带的上表面,。,不同时期的ZP细胞的移植对附肢发育有着不同的影响(见下图),AER 对下方的渐进带发出信号，如将AER移植到早期肢芽的背部将诱导异位生长。,The major signal is fibroblast growth factors,FGF-8,throughout ridge and,FGF-4,in the posterior region.,渐进带（PZ）细胞控制近远端分化,A.将早期翅芽的PZ移植到已经形成尺骨和挠骨的晚期翅芽中，形成额外的尺骨和挠骨。B.将晚期翅芽的PZ移植到早期翅芽中，中间结构缺失。,附肢发育中至少要求三种类型的外胚层和中胚层间的相互作用,：第一，中胚层起始附肢芽向外生长和形成AER；第二，AER进一步刺激肢芽的向外生长以及肢芽中胚层的增殖和分化；第三，附肢芽中胚层提供保持AER所必须的刺激。,近远轴（P-D)的发育,附肢沿近远轴的分化是由AER和附肢中胚层诱导的相互作用产生的。,附肢芽的逐渐向外生长是由于位于AER下面间质细胞的增殖，而AER释放的分子维持间质细胞不断进行分裂。,由AER合成、释放到其下的间质中的成纤维细胞生长因子,FGF可能是鸡胚中维持间质细胞增殖的分子,。,如果AER在肢干发育的任何时期被移除，则末端肢更进一步的骨骼发育将会停止,如果有过多的AER移植到一个已经存在的肢芽上，会形成多余的构造，此构造通常接近肢干的末端。,如果腿部的间质组织直接被置放在翅膀的AER下，后肢的末端构造(脚指)会生长在翅膀的末端,如果在AER下的肢干间质组织被非肢干的间质组织取代，那么AER会退化，并且枝干的发育会停止,如果AER被一个装有FGF的有孔小珠所取代，那么仍然可以发育成正常的肢干,在肢干发育中，越早移除AER，则肢干的缺失越大。上图分别为在第三天、第三又二分之一天、第四天移除AER以及不移除AER对翅膀生长的影响,。,顶外胚层嵴（AER)对于肢芽近远轴图式的发育是必须的,生长因子可以替代顶外胚层嵴。,将AER切除后，移植能释放生长因子FGF-8的玻璃珠，可使肢几乎正常发育。,Specifying the limb mesoderm:Determining the P/D polarity of the limb,附肢沿P/D轴的分化是由AER和附肢中胚层诱导的相互作用产生的。PZ的间质细胞在其中起到重要作用。,但是这些间质细胞如何特化近-远轴？有两个模式被提出来解释这个现象：,渐进带模式（progress zone model）重视“时间”的量度,早期定位与扩散模式（early allocation and progenitor expansion model）重视“空间”的量度,渐进带模式（,progress zone model）,Progress zone model是假设每个中胚层细胞被分化的原因，是由它在渐进带(progress zone;PZ)中分裂所花的时间长短来决定。,一个细胞在增长区所花的时间越长，它获得越多有丝分裂的机会，而其构造越往远程发展。,既然增长区要维持一定的大小，当肢干生长时，细胞必须不断离开增长区；一旦细胞离开，他们就形成软骨组织。所以，第一个离开的细胞会变成stylopod(靠近体侧部分，如肱骨)，而最后离开的细胞形成autopod(远离体侧部分，如指骨)，见下图(A),早期定位与扩散模式,Early allocation and progenitor expansion model认为肢芽在很早就已经分化了，后来的细胞分裂只是扩张已经分化的区域，见下图(B)。,当早期将AER移除的时候，这些特化的区域还没扩张，所以大部分的间质细胞(在AER 200m之内)都死亡了，但当在较后期的胚胎阶段，肢芽生长且区域扩张了，200m的范围只会删除掉autopod的部分。,间质细胞特化近-远轴的两种模式,Hox,genes,meis,genes,and the specification of the P/D axis,同源基因(homologous gene)在附肢发育中起到重要作用，它可以用于解释附肢发育中的所有主要现象。包括,Hox,genes决定附肢域(limb field),，,Hox-D,genes决定指的特化等。,同源基因比较,右图(A)为正常老鼠的前肢，而图(B)为,Hoxa-11,与,Hoxd-11,两基因都已突变失去功能的老鼠前肢，其桡骨跟尺骨皆已消失。,Hox,genes在P/D axis形成中的作用,Hox gene特化前肢特定部分的假设,Hox-9特化肩胛骨，Hox-10特化肱骨，Hox-11特化尺骨跟桡骨，Hox-12特化掌骨，Hox-13特化指骨。,Hox基因在四肢形成期间的表现量改变情形,。,在肢柱形成时(phase)，Hoxd-9与Hoxd-10表现在新形成的肢芽。而在形成肢杆时(phase)，Hoxd-9到Hoxd-13都有表现在肢芽的后端，但只有Hox-9在前端跟后端都有表现。在肢身形成时，Hox基因的表现相反过来，Hoxd-13和Hoxa-13在前端跟后端都有表现，而Hoxd-10到Hoxd-12以及Hoxa-12表现在后端。,Hox基因和附肢畸形,附肢畸形在人类发育中还是比较普遍的.大约1%的新生婴儿有附肢前后轴向发育的缺陷,人类的许多遗传缺陷（如,Shh,信号途径或,Hox,基因突变）是导致附肢发育畸形的原因。,The hand shows a relatively mild defect,polydactyly(,多指畸形,).,The pictures below show a much more severe limb phenotype that is associated with mutations of the,Hoxd13,gene,.Notice the difference between the heterozygous(,杂合型)on the left and a the homozygous(纯合型),condition on the right.,Again we can see the important contributions to understanding human diseases that have come from studying the lowly fruit fly!,果蝇和鸡的翅膀发育相关基因比较示意图,Truly amazing that structures that appear so different and that occur on animals separated by more than 600 million years of evolution share the fundamental molecular mechanisms patterning.,附肢发育中背腹轴的分化,背腹轴与来自中胚层和外胚层两者的细胞特化相关,背腹轴分化可能是由肢芽背部外胚层的,特异性旁分泌因子(Wnt7a),诱导产生的。,背部中胚层同时诱导背部肢芽的,rFng和Wnt7a,分子表达。腹部中胚层诱导,engrailed-1（,en-1,）,在肢芽腹部表达。,Dorsal-Ventral Axis of Limb,Wnt-7a,在背部外胚层中表达，它诱导背部中胚层的,Lmx-1,表达并特化背部轴向形成。,rFng,同样也,在背部外胚层中表达,。,en-1,表达细胞和,rFng,表达细胞之间的相互抑制作用，将决定顶外胚层嵴,AER,的中部边缘位置。,En-1,表达细胞与,Wnt-7a,相互抑制，由此对肢芽腹部区域进行定位.,外胚层控制发育中肢的背腹轴图式的形成。,Wnt-7a,在背部外胚层中表达，而,Engrailed,基因在腹部外胚层中表达。,lmx-1,基因在背中胚层中被,Wnt-7a,诱导表达，并且参与背部结构的确定,中肾,间质细胞,前后轴的特化,中胚层有一区域极化活动区(ZPA)，从ZPA发出信号指导肢芽后端的位置定位。,ZPA可扩散形态发生子模型(ZPA diffusible morphogen model):ZPA组织通过分泌一种可溶性形态发生素起作用，该物质从ZPA向外扩散由肢芽后端向前端形成一种浓度梯度。,RA(retinoic acid)：视黄酸,Tickle(1982):,retinoic acid could mimic the effects of ZPA,experiments supported the role of RA as the ZPA morphogen,Bryant and a Japanese group,(1987):,RA acted by inducing ZPA tissue,当极化活性区(the zone of polarizing activity;ZPA)被移植到前端肢芽的中胚层时，一模一样的手指如镜像一般，从正常的手指的前端冒出。,Specification of the limb field:Hox genes and retinoic acid,所有陆地的脊椎动物皆只有4个肢芽(limb bud：胚胎上的小突起，由此发育成肢)，而这4个肢芽皆在彼此的对面。虽然不同脊椎动物的附肢因为形成于不同体节而有所不同，但是附肢的位置却是固定的，这与沿着体轴前后端的Hox gene的表现有关。促使肢芽开始形成的重要物质为视黄酸(retinoic acid，RA)，倘若利用药物阻断视黄酸的合成，会因而阻碍肢芽的形成。Bryant和Gardiner(1992)推断RA沿着体轴前后端形成的浓度梯度可能活化一些特定细胞内的同源基因，因而这些特定细胞被包含在limb field内。而RA的来源可能是Hensens node。,(A)蝌蚪切除尾巴后，于再生的第一天，将尾端残余的部分浸泡于retinoic acid。之后，蝌蚪于尾端残余的部分长出许多脚。(B)蝌蚪切除尾巴后，没有浸泡于RA，使其正常地再生。4周后，于notochord上方可见neural tube，而肌肉也被包裹成束，却没有软骨或骨头生成。(C)浸泡于RA的尾端，箭头所指之处可见肢芽和骨盆的软骨及骨头的生成。在右边箭头所指之处，更可见股骨的雏型。,Shh,gene and ZPA,Hedgehog(,hh,),a segment polarity gene（,体节极性基因）,that we studied earlier,is involved in wing patterning.,Riddle(1993)showed that a vertebrate homolog of fly hh,called sonic hh(,shh,),is expressed by the ZPA.,hh基因在前端附肢原基的异位表达,利用原位杂合技术显示 Shh蛋白质在ZPA的表现,new limb bud has been induced by,Application of a FGF soaked bead,右图为Sonic hedgehog(,shh,)极化活性的分析试验。先将,shh,gene插入鸡病毒基因序列中邻近促进子的地方，然后将此重组过的病毒放入培养的鸡纤维组织原细胞中。将此经过病毒转殖的细胞移植到鸡胚胎肢芽的前端。结果也产生镜像般的手指，显示分泌的蛋白质有极化的活性。,在第17期，刚被诱导出来的AER分泌FGF8到底下的间质细胞。已表达,Hoxb-8,与,dHand,的间质细胞被诱导而产生,shh,，因此在前肢肢芽的后端形成极化活性区。,AER和极化活性区(ZPA)之间回馈控制的效应,第16期的前肢肢芽,两期之间距离5h,在第18期，SHH蛋白质维持FGF在AER中的表现，而AER中的FGF又能维持shh基因的表现。,居间中胚层,侧板中胚层,表面外胚层,三个轴的协调,附肢的3个轴是相互作用和相互协调的。特化这3个轴机制之间的主要循环包括(1)由AER(FGF8)和dHAND建立极化活性区(Sonic hedgehog)；(2)由Sonic hedgehog(在极化活性区)诱导FGFs产生(在AER)，其方式是藉由Shh诱导Gremlin产生，而Gremlin会阻碍抑制FGFs的BMP；(3)由Wnt7a维持Sonic hedgehog的表现(在腹侧外胚层部分)；(4)由Sonic hedgehog阻碍Gli3分裂成抑制子(repressor)的形式，使得形成Gli3活化子(activator)与Gli3抑制子的浓度梯度(gradient)。,(1)由AER(FGF8)和dHAND建立极化活性区(Sonic hedgehog)；(2)由Sonic hedgehog(在极化活性区)诱导FGFs产生(在AER)，其方式是藉由Shh诱导Gremlin产生，而Gremlin会阻碍抑制FGFs的BMP；(3)由Wnt7a维持Sonic hedgehog的表现(在腹侧外胚层部分)；(4)由Sonic hedgehog阻碍Gli3分裂成抑制子(repressor)的形式，使得形成Gli3活化子(activator)与Gli3抑制子的浓度梯度(gradient),基因敲除实验证明,Wnt7a 和En-1分子在附肢轴向形成的重要性,A summary of the important interactions among the major axial patterning systems.This predicts that mutantions affecting primarily one axial system will have significant affects on the others.This has been demonstrated experimentally by making mouse knock outs of many of these important molecules.The Wnt7a KO mouse has a ventralized limb that is also missing posterior pattern elements and truncated,附肢发育过程中的分子信号途径,Hox基因表达的复杂模式调控软骨和肌肉的形成,细胞死亡与指和关节的形成,脊椎动物附肢中特定细胞的死亡是可遗传的,程序性细胞死亡,，是进化过程中经自然选择形成的。,细胞死亡在指/趾的成形过程中，特别是关节形成和手指的分离中起着重要的作用。,鸭胚和鸡胚后肢原基中细胞死亡模式的比较。,鸡胚趾间细胞的程序性死亡信号可能由BMP发出，封阻BMP的受体将会阻止这些细胞的程序性死亡。,noggin,expression,dominant negative BMP receptor,在附肢的正常发育过程中，BMP既可以诱导间质细胞发生凋亡，也可以刺激它们分化为软骨形成细胞，这要取决于它们所处的发育阶段。,在关节形成过程中，BMP7可以促进软骨的形成，而BMP2和GDF5在骨之间的位置表达，促进关节的形成。,BMP蛋白可能参与了软骨的稳定和关节的形成过程。鸡肢形成晚期，BMP7（A）和BMP2（B）的表达。,Noggin蛋白的作用。C，16.5天正常小鼠前肢中GDF5在关节形成处表达；D，Noggin缺陷型突变体小鼠中不表达GDF5，也不形成关节。,思考题,The functional roles of the limb mesoderm and the AER have been determined through experimentation.In the figure you can see the results of many of these experiments,complete the diagram by describing(in words or in words and cartoons)the resulting forelimb structure.What conclusions can be drawn from these experiments?What type(of the three classic ones)of experiment is being utilized for each approach?,