THP-1培养(总结).doc

THP-1培养1、 细胞复苏：从液氮罐中快速取出细胞，然后在37度水浴中快速摇动约1-2min，水面要在冻存管盖以下，防止水进入冻存管。2、 转入平板：在超净台中，取一平板，先加入12ml 1640培养液，铺满板底，然后把冻存管中的细胞全部吸到平板中，8字摇匀，显微观察状况，然后37度培养；3、 细胞换液：复苏过夜后，观察培养液有变黄(2-3天)，此时换液，先把细胞液全部吸入15ml离心管中，900-1000r/min离心5min，（转速不能大于1000），吸掉上层培养液，加入新的1640，吹匀，全部吸到培养板中，37度培养。4、 传代：悬浮生长细胞的传代：有以下两种方法：1、直接传代法：悬浮细胞自然沉淀瓶底；用吸管吸去上清1/22/3；轻轻吹打成细胞悬液；等分装入数个培养瓶（皿）2、离心传代法：将细胞悬液转移到离心管内；8001000r/min离心5min，弃上清；加新的培养液到离心管内；吸管吹打成为细胞悬液；分瓶（皿）悬浮细胞传代，如果需要做实验大量扩增细胞的话，可以传代前先将培养瓶直立静置，待大部分细胞都沉降的细胞瓶底，勿晃动，轻轻吸出培养基，再加入新鲜培养基即可。这样细胞数目不会损失多少，而且上层吸去的也是死细胞。但建议加入新鲜培养基后分瓶扩增，毕竟一个较小的空间和有限的培养基环境下细胞扩增有限。如果暂时不要做实验，只是维持传代的话，只要将大部分培养基吸去，留一点儿在瓶底，再加入新鲜培养基即可。至于悬浮细胞何时传代合适，个人经验（我只养过THP-1和U937两种悬浮细胞）是待培养基变黄有些过，这时显示培养基已明显偏酸，对细胞并不适宜。一般待培养基开始变黄，这时将细胞瓶放平，细胞能密密麻麻铺满整个瓶底就要传代了，这表明细胞的生长空间要不够了，就需传代分瓶扩增。5、 冻存液：20% 1640+70%胎牛血清+10%DMSO （ATCC里边有说明）；(7:2:1)梯度降温冻存，4度，30min；-20度，1h；-80度，过夜；然后转入液氮。6、 THP-1 细胞是悬浮细胞，相对贴壁细胞要求高一点。细胞养不好，可能的原因有，THP-1细胞特别依赖细胞浓度，ATCC上10 5到106每ML，是一个很高的密度，细胞少了就不太容易养好。1、细胞株的来源很重要，如直接来源于ATCC（American Type Culture Collection 美国模式菌种保藏中心）生命力要强于国内细胞库的2、注意细胞的密度一定要高，介于5105106/ML之间，增值的快。细胞数量太少，不适合THP-1生长，一般状态不好的THP-1在培养了3天后数量仍然不多，继续培养一天或者两天，培养基严重泛黄，细胞数量会巨增。这一点不同于同是单核细胞系的U937细胞。3、THP-1细胞适合在细胞ph环境偏酸环境生长，对培养基变化非常敏感，所以尽量使用相同ph的1640，4、还要注意，传代后切忌常移出培养箱观察，否则会影响细胞生长，状态变差，一般首先表现为细胞内颗粒变多。一般THP-1生长相当快，对于状态已经不好的情况，建议传代后34天再观察，一般4天时间培养基已明显泛黄，细胞数量巨增。1)THP-1细胞喜欢酸性条件，你不要老是换培养基。越酸的条件，细胞密度越大，细胞就长得越好。2） 不要频繁换液，一般2-3次换液离心一次（只是补充培养基）3） 使用1640（ATCC推荐），注意加碳酸氢钠2.5g就可以了，宁酸勿碱4） 注意冻存的时候密度大些，推荐用血清冻存5）感觉Hyclone的血清比较好6）复苏比较慢，建议开始用小瓶，不要用一次性的