细胞生物学实验.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细胞生物学实验,海洋科学系,刘均玲（,13698999696,）,实验一 细胞膜的渗透性,一、实验目的与要求,1.,掌握细胞膜通透性的实验方法。,2.,观察并掌握相对分子量、脂溶性大小、电解质和非电解质对细胞膜通透性的影响。,细胞膜在不断变化的环境中必须保持自身的稳定状态才能生存。细胞膜允许一些物质通透，又能降低甚至阻止另一些物质的通透，所以细胞膜具有选择通透性。,二、实验原理,未溶血,溶血,血红蛋白从红细胞中逸出的现象称为,溶血现象,。,渗入红细胞的溶质能提高红细胞渗透压，使水进入红细胞，引起溶血及细胞膜破裂。此时光线较容易通过溶液，使溶液呈现透明即溶血。,二、实验原理,二、实验原理,在不同相对分子量、脂溶性大小以及电解质和非电解质等各种溶液中，红细胞质膜对各种溶质的渗透性不同。由于溶质透入速度不同，溶血时间也不同。因此，通过观察红细胞溶血现象时间的不同来记录渗入速度，从而测量各种物质通透性的差别。,四、实验方法与步骤,溶血现象的观察：,取试管,2,支，分别加入,0.017mol/L,氯化钠和,0.032mol/L,葡萄糖低渗溶液,3ml,，再加入,2,滴制备好的,50%,鸡红细胞悬液，注意观察溶液颜色的变化，由不透明的红色悬液变成透明的血红蛋白溶液（红细胞发生破裂，造成,100%,红细胞溶血，使光线比较容易透过溶液）。,四、实验方法与步骤,红细胞的渗透性,（,1,）取试管一支，加入,017mol/L,氯化钠溶液,3ml,，再加入,2,滴制备好的,50%,鸡红细胞悬液，轻轻摇动，混匀后静置于温室中，观察试管中发生溶血的时间及其变化。,注意是否有颜色变化？是否有溶血现象？为什么？,四、实验方法与步骤,（,2,）分别在下列几种等渗溶液中进行实验，步骤同（,1,）。,0.32mol/L,葡萄糖,0.17mol/L,氯化铵,0.17mol/L,醋酸铵,0.17mol/L,硝酸钠,0.12mol/L,草酸铵,0.12mol/L,硫酸钠,0.32mol/L,甘油,0.32mol/L,乙醇,0.32mol/L,丙酮,五、注意事项,试管中有红细胞和测试溶液时，不应强力摇晃，以免造成人为的红细胞破裂。,目测法判断标准：快速溶血：；慢速溶血：或；不溶血：。,溶血现象可用一张有字的白纸来辅助识别，能够清楚地透过溶液看到溶液后方纸上清晰的字迹时，为完全溶血。,因相对分子质量大小对膜通透性有影响，所以将溶血时间适当地延长至,15min,，,15min,时 仍然不溶即判断为不溶血。,编号,溶液种类,是否溶血,溶血所,需时间,结果分析,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,六、作业,记录观察到的现象，并对实验结果进行分析和比较。,实验二,鸡血细胞的体外融合试验,一、实验目的与要求,掌握,PEG,体外诱导细胞融合的原理和基本方法。,掌握在光学显微镜下融合细胞的形态特征。,细胞融合是用人工的方法使两个或以上的细胞融合成异核细胞。异核细胞可进入有丝分裂，使来自两个亲本细胞的基因组合在一起，形成只含一个细胞核的杂种细胞。,二、实验原理,PEG,溶液作为助融剂可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，引起细胞融合。,二、实验原理,细胞融合的频率和活力与所用,PEG,的分子质量、浓度、作用时间以及细胞的生理状态及密度等有关。本方法用分子质量为,400,6000,的,PEG,溶液可引起细胞的聚集和粘连，产生高频率的细胞融合。,二、实验原理,三、实验材料、仪器和试剂,1.,材料：成年家鸡。,2.,主要仪器：,注射器、刻度离心管、离心机、血细胞计数板、水浴锅、滴管、显微镜、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、酒精灯等。,3.,主要试剂：,0.85%NaCl,溶液、,GKN,液、,50%,（,W/V,）,PEG400,溶液、,Hanks,液、,0.5%,酚红、,Janus green,染液等。,1.,鸡血细胞悬液的制备,从家鸡的翼根静脉采血制备抗凝全血。加入,4,倍体积的,0.85%NaCl,溶液，制成红细胞储备液，保存于,4,。取鸡血细胞储备液,1ml,，加入,4ml 0.85%NaCl,溶液，混匀后，,1200rpm,离心,5min,，弃去上清液，再加入,5ml 0.85%NaCl,溶液按上述条件离心一次。最后，弃去上清液，加入,10ml,的,GKN,溶液制成鸡血细胞悬液。取,0.5ml,鸡血细胞悬液，用,GKN,溶液稀释至,1X10,7,个,/ml,，备用。,四、实验方法与步骤,2.,鸡血细胞的收集,吸取,1ml,鸡血细胞悬液放入离心管中，加入,4mlHanks,液混匀，,1000rpm,离心,5min,。弃去上清液，用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞团块松散。,3.PEG,诱导细胞融合,吸取,0.5ml 37,的,50%PEG,溶液，慢慢沿着离心管壁逐滴加入，边加边轻摇离心管，使,PEG,与细胞混匀，然后在,37,水浴中静置,2min,。,四、实验方法与步骤,4.,终止,PEG,作用,缓慢加入,5ml Hanks,液，轻轻吹打混匀，于,37,水浴中静置,5min,。,5.,细胞悬液的制备,用吸管轻轻吹打细胞团数次使细胞团分散，,1000rpm,离心,5min,，使细胞完全沉降。弃去上清液，加,Hanks,液，再离心一次，弃多数上清，留少许溶液，混匀。,四、实验方法与步骤,四、实验方法与步骤,6.,计算细胞融合率,细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞的细胞核总数之百分比。,融合率,=,视野内融合细胞的核数,/,视野内细胞的总核数,100,7.,染色和镜检,吸取细胞悬液，在凹面载玻片上滴一滴，加入,Janus green,染液混匀，染色,3min,后盖上盖玻片，在显微镜下观察细胞融合情况（注意区分细胞融合与细胞重叠）。,四、实验方法与步骤,五、注意事项,1.,高,Ca,2+,浓度能够提高细胞融合率。有些抗凝剂中含有和,Ca,2+,结合的化合物，与血液中的,Ca,2+,形成难解离的可溶性络合物，导致血液中的,Ca,2+,浓度降低，故起抗凝血作用，但同时会造成细胞的融合率较低。,2.,必须严格控制,PEG,的作用时间，通常处理细胞,1,2min,。,PEG,和二甲基亚砜（,DMSO,）并用，可以提高细胞的融合率。,3.,融合细胞继续培养就变成一个杂种细胞，它的染色体数不是两核的倍数，因为一些染色体会逐渐消失。,六、作业,绘细胞融合过程图。,实验三 石蜡切片法,一、实验目的,熟悉石蜡切片的制作过程。,掌握,HE,染色的基本原理和染色方法。,二、实验原理,石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。,苏木素与伊红对比染色法（简称,H.E.,对染法）是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。经过,HE,染色，细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。,三、实验用品,1.,器材,切片机、水浴锅、染色缸、玻片、显微镜、试剂瓶、剪刀、镊子、烘箱、离心管或青霉素瓶子。,2.,试剂,苏木色精、伊红、二甲苯、中性树胶、酒精、石蜡、氨水、盐酸、蛋清、甘油。,3.,试验材料,罗非鱼肝脏组织,四、实验步骤,1,、取材,2,、固定,3,、漂洗,4,、脱水,5,、透明,6,、透蜡,7,、包埋,8,、修块,9,、切片,10,、染色,1.,取材到切片,取材,固定（,Cannoys,），,材料厚度,2mm,。,100%,酒精,100%,酒精,二甲苯,:,酒精（,1:1,）,二甲苯,二甲苯,二甲苯,:,石蜡（,65 1:1,）,石蜡（,65,）,石蜡（,65,），以上处理各,20min,，最后一步石蜡也,20min,。,包埋,修块,切片,贴片,2.,脱蜡与复水,二甲苯,二甲苯,二甲苯,/,无水乙醇,(1/1),无水乙醇,无水乙醇,95%,乙醇,80%,乙醇,70%,乙醇,50%,乙醇,蒸馏水。,以上处理各,2-3min,。,3.,染色与观察,1%,苏木色精（,5min,）,水洗,0.5%,盐酸分色（数秒）,水洗,0.4%,氨水蓝化,水洗（,5min,）,70%,酒精,80%,酒精,1%,伊红（,95%,酒精溶解）,95%,酒精,95%,酒精,100%,酒精,100%,酒精,酒精,/,二甲苯,二甲苯,二甲苯,中性树胶封片。,未注明时间的一律处理,2-3min,。,五、作业,简述石蜡切片过程，绘制你所观察到的细胞形态。,提交一张你制作较好的玻片。,实验四 植物细胞骨架的观察,一、实验目的,掌握考马斯亮蓝,R250,对植物细胞骨架染色的方法。,通过对洋葱内皮细胞的处理，掌握植物细胞骨架的制备方法与显微形态观察。,二、实验原理,细胞骨架,(cytoskeleton),，是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同可分为微丝、微管和中等纤维。细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。,本试验采用去垢剂,TritonX-100,的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝,R250,染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。,三、实验用品,1.,试验材料：洋葱,2.,器材：显微镜、载玻片、滴管、擦镜纸、,PH,计,3.,试剂：,0.01mol/L,磷酸盐缓冲生理盐水,(PBS),0.2mol/L Na2HPO4-NaH2PO4,缓冲液（,PB,，,PH7.3,）,50ml,、,0.15mol/L,NaCl,、加双蒸馏水加至,1000ml,PB,0.2mol/L Na2HPO4 77ml,0.2mol/L NaH2PO4 23ml,M-,缓冲液,咪唑,(PH 6.7)50mmol/L,KCl,50mmol/L,MgC12 0.5mmol/L,EGTA 1mmol/L,EDTA 0.1mmol/L,巯基乙醇,1mmol/L,甘油,4mmol/L,用,1mol/L,HCl,调,pH,至,7.2,。,1%,的,Triton X-100/M-,缓冲液,0.2%,考马斯亮蓝,R250,染液,甲醇,46.5ml,冰醋酸,7ml,蒸馏水,46.5ml,3%,戊二醛,-PB,溶液（,pH7.3,）,四、实验步骤,取洋葱内皮,1cm,左右,置于含,PBS,液的载玻片上,湿润后，吸去,PBS,加,2,滴,1%Triton X-100/M-,缓冲液，,5min,吸去缓冲液，加,3%,戊二醛,-PB,溶液，固定,30min,加,PBS,洗,2,次，共,3min,加,0.2%,考马斯亮蓝,R250,染色,30min,用,PBS,洗,2,次，共,2min,，吸干,镜检并绘图,五、注意事项,用去垢剂,TritonX-100,的缓冲液处理材料时，应控制在,30min,左右。,每一次加液或染色后，应用,PBS,洗,2,次，并用滤纸吸干。,六、作业,画出实验所观察到的细胞骨架图，并注明放大倍数。,为什么用,TritonX-100,的缓冲液处理材料？,现在请开始实验,谢谢！,