荧光共振能量转移FERT.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子能级与荧光,S,0,S,1,T,1,h,n,0,h,n,1,h,n,2,2.,荧光（,Fluorescence),：,当处于基态的分子吸收光能后进入激发态，并且立即返回基态并以光的形式释放能量，这种光称为荧光。,4.,激发,(Excitation,Ex),和发射,(Emission,Em,),光谱（,Spectra):,1.,能级（,Energy Level,）：,原子的可能状态是不连续的，因此各状态对应能量也是不连续的。包含电子能级、振动能级和转动。,3.,磷光（,P,hosphorescence,）,:,分子从激发三线态返回基态以光的形式释放能量。,CFP,Ex.440nm,Ex.470nm,Em,.470nm,YFP,Em,.535nm,荧光共振能量转移,(FRET),现象,3.FRET,现象的特征,:,选择性激发供体,却能检测到受体发射的荧光,1.,供体,(Donor,D),Donor,2.,受体,(Acceptor,A),Acceptor,FRET,原理,(Principle),FRET,的条件,发生,FRET,需要,三,个条件：,1,、供体分子的发射光谱和受体分子的吸收光谱必须有显著的重迭，一般大于,30,；,2,、供体分子和受体分子间的距离必须在,1 10 nm,之间,.D,和,A,间的,FRET,效率：,3,、供体分子的发射态偶极矩与受体分子的吸收态偶极矩、以及它们的向量必须满足一定的条件,R,0,:,E,=50%,时供体和受体分子间的距离,.,对于特定的供体受体对是常数,;,R,:,供体和受体分子间的距离,.,E,:FRET,效率,.,对于,R,特别灵敏,.,举例,:,假设,R,0,=5nm,1,）,R,=10nm,E,=1.5%,2,）,R,=5nm,E,=50%,3）,R,=6nm,E,=25%,450 500 550 600,l,(nm),D,Em,A Ex,1),蛋白分子的共定位,;,2),蛋白分子聚合体,;,3),转录机制,;,4),转换途径,;,5),分子运动,;,6),蛋白折叠等生物学问题,.,FRET,的应用,通过,FRET,技术可以获得有关两个蛋白分子之间相互作用的空间信息。常用于解决如下问题,:,Laser,Laser,D,A,FRET,技术应用一,:,检测两个发光分子间的重合与共定位,荧光标记,利用,FRET,技术检测不发光分子间相互作用的策略,FRET,技术应用二,:,检测分子间的相互作用,Laser,Laser,FRET,技术应用三,:,检测分子的折叠与构象变化,FRET,技术应用举例：细胞内钙离子浓度的实时测量,Miyawaki,A,et al.,Nature 1997,388:882-887,(b),BFP-GFP BFP-YFP CFP-YFP CFP-,dsRED,GFP-,dsRED,在,FRET,实验中经常使用的供体,-,受体荧光分子对,2.,绿色荧光蛋白类,(,G,reen,F,luorescent,P,roteins,GFPs,),1.,染料类,(Dye),FITC-,Rhodamine,Alexa488-Cy3 Cy3-Cy5,参考阅读文献,Jonathan D.Violin,et al.,A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory,phosphorylation,by protein,kinase,C.,J Cell Biology,2003,161:899909,Elizabeth A J et l.,FRET Imaging.,Nature Biotechnology,2003,21:13887-1395,Rajesh B S.Fluorescence resonance energy transfer(FRET)microscopy imaging of live cell protein localizations.,J Cell Biology,2003,160:629633,Jin Zhang,et al.,.Genetically encoded reporters of protein,kinase,A activity reveal impact of substrate tethering.,PNAS,2001,98:1499715002,Michael G.Erickson,et al.,DsRed,as a Potential FRET Partner with CFP and GFP.,Biophysical Journal,2003,85:599611,Alexander,Sorkin,et al.,Interaction of EGF receptor and Grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer(FRET)microscopy.,Current Biology,2000,10:13951398,思 考 题,2,.,你认为,FRET,技术特别适合什么领域,?,举例说明。,1.,为什么,FRET,效率对供体受体分子间的空间距离非常灵敏,?,3.A,和,B,分子都不能发射荧光,要求采用,FRET,技术检测二者之间的相互作用特征,请问应该如何处理,?,论文题目：,供体受体对之间,R,0,定量分析与计算,