分子标记技术(ISSR).ppt

*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,ISSR(Inter-simple sequence repeat),分子标记技术,主讲人：关 锰,分子标记的概念,广义的分子标记,(molecular marker),是指可遗传的并可检测的,DNA,序列或蛋白质。,蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。,狭义的分子标记,概念只是指,DNA,标记，而这个界定现在被广泛采纳：,能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的,DNA,片,段，它直接反映基因组,DNA,间的差异。,分子标记的特点,（,1,）直接以,DNA,的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；,（,2,）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；,（,3,）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；,（,4,）表现为中性，不影响目标性状的表达；,（,5,）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。,分子标记的类型,基于杂交的分子标记,，如,RFLP,（,Restriction fragment length polymorphism,即限制性长度片段多态性）。,基于,DNA,序列和芯片的分子标记，如,SNP,（,Single nucleotide polymorphism,，单核苷酸多态性）。,基于,PCR,的分子标记,，它又分为两类：,RAPD,（,Random amplified polymorphic DNA,）,DAF,（,DNA amplification fingerprinting,）,SSCP,（,Single strand,confirmational,polymorphism,）,小卫星,DNA,（,Minisatellite,DNA,）,微卫星,DNA,（,Microsatellite,DNA,）,又称,SSR,（,Simple sequence repeat,）,ISSR,（,Inter simple sequence repeat,）,AP-PCR,（,Arbitrary primer PCR,）,它主要有,SCAR,（,Sequence characterized amplified region,）,STS,(Sequence tagged site),位点特异的,PCR,标记方法,多位点标记方法,基于,PCR,技术的,DNA,扩增方法,AFLP,（,Amplified fragment length polymorphism,）,AFLP,是先酶切，再用特殊设计的引物进行扩增,CAPS,（,Cleaved amplified polymorphic sequence,）,CAPS,是先扩增，再酶切扩增片段,PCR,与酶切相结合的方法,微卫星,DNA,Microsatellite,，,MS/Simple Sequence,Repeat,SSR,短的，简单的串联重复序列；,基元是,1-6,个碱基,(,有的定义为,1-5,个碱基,),；,广泛存在于真核细胞整个基因组的不同位置上；,高度多态性,(,微卫星,DNA,长度的多态性,),；,微卫星,DNA,两端多是高度保守的单拷贝序列；,共显性标记。,特点,ISSR,原理简介,ISSR(inter,-simple sequence repeat),是,Zietkeiwitcz,等于,1994,年在微卫星基础上发展起来的一种新的分子标记。其基本原理是,:,用锚定的微卫星,DNA,为引物，即在,SSR,序列的,3,端或,5,端加上,2-4,个随机核昔酸，在,PCR,反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间,DNA,片段进行,PCR,扩增。所扩增的两个,SSR,区域之间的多个条带通过聚丙烯酞胺凝胶电泳得以分辨，扩增谱带多为显性表现。由于微卫星在基因组中广泛分布，且等位变异特别丰富，因而可以检测到高的多态性。,ISSR,分子标记的特点,优点：,ISSR,标记结合了,RAPD,和,SSR,的优点,所需,DNA,模板的量少、多态性丰富,无需试剂盒、结果记录方便、实验成本低、操作简单、稳定性较高、呈孟德尔式遗传,缺点：,是,PCR,扩增时最适反应条件需要一定时间摸索,其标记大多为显性标记,在解决交配系统、计算杂合度和父系分析等问题时效果不佳,特性,RFLP,RAPD,SSR,ISSR,AFLP,分布,普遍存在,普遍存在,普遍存在,普遍存在,普遍存在,遗传,共显性,多数显性,共显性,多数显性,多数显性,多态性,中,高,高,高,非常高,等位检测,是,不是,是,不是,不是,检测位点数,13,110,15,050,更多,20100,样品信息量,低中,高,高,高,非常高,基因组区域,底拷贝编码,整个基因组,整个基因组,整个基因组,整个基因组,技术难度,中等,简单,简单,简单,中等,重复性,高,中等,高,高,高,DNA,样品量,230g,1100ng,50-100ng,250ng,100ng,耗费时间,慢,快,快,快,中等,可靠性,高,中等,高,高,高,ISSR,实验流程,DNA,提取及检测,引物设计,PCR,扩增,电泳检测,结果统计及分析,必须对扩增条件进行优化，包括对,Tag,酶、引物浓度及其退火温度、,M g,2+,浓度、模板浓度等。,引物设计是,ISSR,技术中最关键、最重要的一步。基因组中,SSR,一般为,26,个寡聚核苷酸，用于,ISSR,的引物常为,5,或,3,端加锚定的二核苷酸、三核苷 酸、四核苷酸重复序列，重复次数 一般为,48,次，使引物的总长度达到,1618bp,。,5,或,3,端用于锚定的碱基数目一般为,14,个，锚定的目的是引起特定位点退火，使引物与相匹配,SSR,的一端而不是中间结合，从而对基因组中特定片段进行扩增、检测。由于植物基因组中,SSR,最多的 是,(AT),n,、,(TA),n,、,(GA),n,、,(CT),n,等二核苷酸重复序列，在选择,ISSR,引物时，应以二核苷酸重复序列为主，少选寡聚三核苷酸、四核苷酸引物。,PCR,产物需经电泳分离、染色显示后才能进行谱带观察、统计。琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是目前通用的两种电泳技术。一般采用,1.5%-2%,的琼脂糖凝胶电泳或,5%-8%,的聚丙烯酰胺凝胶电泳。前者,EB,染色紫外光下观察、拍照；后者经银染可见光下观察记录，拍照。一般当琼脂糖电泳分离效果不理想时采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。谱带统计分析采用相关软件,NTSYS,或,PAUG,。,应用领域,种质资源鉴定,遗传作图,基因定位,遗传多样性,系统与进化,分子生态学,谢谢！,