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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,硕士研究生论文答辩,安徽省立医院急诊医学,2011,年,5,月,不同高压氧预处理对大鼠肾缺血再灌注损伤的研究,答辩人：朱春艳,导 师：刘 宝 教授,不同高压氧预处理对大鼠肾缺血再灌注损伤的研究,研究背景,:,肾脏缺血再灌注损伤是急性肾衰竭发病的重要原因之一，在临床上常见于失血性休克、肾脏移植、腹主动脉和肾动脉手术、部分肾脏切除、肾实质切开取石,1,等。其发病机制复杂，迄今仍未完全阐明，有研究表明与肾血流动力学异常、肾小管上皮细胞代谢障碍、肾小管上皮脱落、管腔中管型形成、再灌注氧自由基生成、炎症细胞浸润和细胞因子异常等有关,2,。高压氧有提高机体耐低氧能力、清除氧自由基、抑制炎症反应和细胞凋亡、改善微循环等作用,5,6,7,8,。本研究观察大鼠缺血再灌注后血尿素氮（,BUN,）、肌酐（,Cr,）、丙二醛（,malonic,dialdehyde,，,MDA,），肿瘤坏死因子,-,（,tumor necrosis factor-,，,TNF-,）、白介素,-6,（,interleukin-6,，,IL-6,）的变化，研究不同时间高压氧预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的影响并探讨其可能机制,1.,材料与方法,实验动物：雌性清洁级,SD,大鼠,50,只（安徽医科大学实验动物中心提供），体重,200,250g,，饲养环境维持,12h,昼夜节律，自由取食及饮水，手术前,12h,禁食。,实验方法：,1.2.1,实验分组 将大鼠随机分为假手术组（,S,组，,n=10,）；缺血再灌注组（,IR,组，,n=10,）；高压氧预处理,1,组（,H1,，,n=10,）：连续,4,天高压氧预处理；高压氧预处理,2,组（,H2,，,n=10,）：连续,8,天高压氧预处理；高压氧预处理,3,组（,H3,，,n=10,）：连续,16,天高压氧预处理。假手术组仅打开腹腔找到双侧肾蒂，,20min,后关闭腹腔，缺血再灌注组和高压氧预处理组均进行肾脏缺血再灌注损伤造模。,1.2.2,高压氧预处理 实验分组后，,S,组及,IR,组不行高压氧干预。高压氧预处理组分组后行高压氧治疗，,1,次,/d,，,H1,组高压氧预处理,4,次，,H2,组预处理,8,次，,H3,组预处理,16,次。高压氧处理采用空气加压舱，预处理时将大鼠置于密闭消毒后容器中，容器内加入适量无菌注射用水并湿润大鼠毛发，防止静电发生。容器的进氧管接舱内的直流式供氧口，排气管接舱内的排气口，,20min,缓慢加压到,0.25MPA,，,100%O2,维持,1h,，减压,20min,，共,100 min,；末次高压氧预处理后,24h,，建立肾脏缺血再灌注损伤模型。,1.2.3,建立大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型,(,图,1),大鼠称重后，按每,100g,给予水合氯醛,0.3ml,腹腔注射麻醉。顿性分离肾蒂，分离出输尿管后，用无创伤血管夹夹闭右肾动静脉，同法夹闭左肾动静脉，开始计时，并观察肾脏颜色，由红润变为苍白表示夹闭有效，,30min,后移除双侧血管夹，再观察肾脏颜色由苍白转为红润表示再灌注成功。若松开血管夹,5min,，肾脏未转变为正常的红色，认为再灌注失败。逐层关闭腹膜、腹白线、皮肤，以,0,号线打结，用,75%,酒精消毒伤口后放回笼中继续饲养,肾脏颜色苍白,夹闭双侧肾蒂,30min,1.2.4,标本采集及实验 缺血再灌注损伤,24h,后处死大鼠，由下腔静脉采血,5-6ml,，,3500r/min,离心,5min,取上层血清保存于,-80,冰箱中备用（用于测定血,Cr,、,BUN,、,TNF-,和,IL-6,）。取左肾腹面下半个肾组织，于,10,中性缓冲福尔马林溶液中固定交由病理科人员，常规脱水、透明、石蜡包埋，置入冰箱中保存备用。切片，,HE,染色待用。,1.2.5,在生化实验室行血,Cr,、,BUN,测定。酶联免疫吸附实验（,ELISA,）法测定血液中,TNF-,、,IL-6,水平，严格按照试剂盒的说明书步骤进行。,1.3,统计学分析 数据采用,SPPSS13.0,统计软件进行统计学分析，计量资料采用,S,表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用,t,检验，以,P0.05,有统计学意义。,结果,2.1,肾组织形态学观察,S,组为正常肾组织；,IR,组肾脏外形肿大，皮质肿胀，颜色发白，髓质呈暗红色；,H1,、,H2,组肾脏外观接近于假手术组，,H3,组更接近于缺血再灌注组。,HE,染色,S,组肾小球、肾小管结构正常；,IR,组肾小球萎缩，肾小管上皮细胞有不同程度坏死，间质明显水肿，大量炎症细胞浸润，毛细血管通透性增高，有红细胞溢出；,H1,轻度肾小球萎缩，,H2,仅有肾小管上皮肿胀，,H3,组有炎症细胞浸润，肾小管透明变性。,S,组,IR,组,H1,组,H2,组,H3,组,2.2,大鼠肾脏功能检测,IR,组,Cr,、,BUN,明显高于,S,组（,P0.05,）,H1,、,H2,、,H3,组与,IR,组相比，,BUN,、,Cr,明显下降（,P0.05,）,组别,例数,BUN,（,mmol,/L,）,Scr(umol,/L),S,10,6.390.35,64.781.97,IR,10,25.442.83,a,150.5724.81,a,H1,10,11.470.62,b,85.137.98,b,H2,10,10.620.38,b,81.503.97,b,H3,10,7.490.49,b,72.176.16,b,注：与假手术组（,S,组）比,a,P0.05,，,与,IR,组比,b,P0.05,2.3,细胞因子及,MDA,的检测 对细胞因子水平和,MDA,检测表明，,H1,组、,H2,组、,H3,组血清,TNF-,、,IL-6,和,MDA,水平低于,IR,组（,P0.05,）。但,H3,组较,H2,组细胞因子和,MDA,水平升高（,P0.05,）,组别例数,TNF-,(pg/ml)IL-6(pg/ml)MDA(nmol/L)S,组,108.284.287.131.455.090.12IR,组,1017.564.84c10.421.17c22.171.89cH1,组,1013.591.14d9.031.10d13.671.97dH2,组,1010.631.16d8.381.88d9.690.63dH3,组,1015.774.00d e8.961.50d e10.810.75d e,3.,讨论 肾脏缺血再灌注损伤导致的急性肾脏损伤和肾移植功能障碍的一个重要原因，近年来，虽然在肾缺血再灌注损伤机制研究方面取得了很大的进展，如氧自由基的产生、钙超载、嘌呤醇耗竭、中性粒细胞侵、细胞凋亡、血管内皮损伤及各种炎症细胞因子的释放等在肾脏缺血再灌注损伤的病理生理过程中起着重要作用，但预防和早期治疗肾脏缺血再灌注损伤方面仍研究较少。,高压氧治疗现在已经广泛应用于临床，高压氧能提高机体对低氧的耐受力和体内抗氧化酶的活性，清除氧自由基，减轻炎症介质的释放，改善组织氧供。高压氧在治疗颅脑损伤、,CO,中毒、心肌缺血等疾病方面已取得了显著的效果。而且已有相关文献报道，高压氧预处理能减轻缺血再灌注损伤，包括心脏、脑、肝脏、脊椎等，但国内外高压氧在预防肾脏缺血再灌注损伤作用方面研究较少。,肾脏缺血再灌注损伤在临床上比较常见，如各种原因导致的休克、心功能不全、心肺复苏术后、尤其肾动脉手术、肾脏移植等，本研究就高压氧预处理对肾脏缺血再灌注作用机制方面进行了相关研究。,已有动物实验证实，在缺血再灌注损伤中，损伤程度与脂质终产物,MDA,水平呈平行关系,10,，故血清,MDA,水平可间接反映细胞膜脂质过氧化的强弱。本研究表明，高压氧预处理,4,天、,8,天、,16,天,24h,后大鼠,BUN,、,Cr,较缺血再灌注组明显下降，存在统计学差异（,P,0.05,）。,MDA,水平也明显降低，炎症因子,TNF-,、,TL-6,减轻,存在统计学差异（,P,0.05,）。病理学上也显示预处理组较缺血再灌注损伤组存在显著差异（见图,2,），肾小球充血减轻、萎缩明显减少，肾小管上皮细胞坏死减少、只有少量炎症细胞浸润、血管通透性减轻，红细胞渗出减少，表明高压氧预处理在肾脏缺血再灌注中有保护作用。,本研究表明，高压氧预处理随着时间对肾脏缺血再灌注保护作用发生变化，其作用机制之一是通过体内抗氧化酶作用，在本研究中，高压氧能够提高抗氧化酶活性，如,4-8,天能降低炎症指标,TNF-,、,IL-6,和,MDA,水平。但机体对高压氧诱导的抗氧化酶系统活性提高可能有限度，在本研究中，,16,天高压氧预处理血清丙二醇、,TNF-,、,IL-6,与,8,天高压氧预处理比较反而上升（,P,0.05,），病理学上加重（见图,2,），故推测高压氧预处理对大鼠肾脏的保护作用可能与时间有关。,这与,Benedetti S11,研究相一致。国内学者邓姣、丁倩,12,等也报道了高压氧预处理兔脊髓缺血再灌注损伤，研究结果与本研究类似,高压氧预处理的另一个机制可能与低氧诱导因子,-1,（,hypoxia inducible factor-1,HIF-1,）、促红细胞生成素（,erythropoietin,EPO,）有关，高压氧预处理能提高,HIF-1,、,EPO,基因在大脑皮层和海马,13,表达，提高大脑对缺血再灌注耐受。,HIF-1,、,EPO,基因也存在于肾脏上，故推测高压氧预处理能够提高,HIF-1,、,EPO,基因表达，从而对肾脏有保护作用。,研究表明，高压氧还能够升高机体组织中,NO,水平,14,，,NO,能够舒张肾血管，改善肾组织血供，对肾缺血再灌注损伤起保护作用,15,。但具体机制仍需进一步研究。本实验仍存在一些不足，如高压氧预处理对大鼠肾脏保护效果最大时间节点不确定，推测为机体抗氧化酶系统和氧化酶系统达到平衡为其时间点，这将在以后的研究中进一步探讨,总之，高压氧预处理能提高肾脏对缺血再灌注损伤的耐受性，减轻缺血再灌注损伤。,