肿瘤细胞培养和杂交瘤技术.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,肿瘤细胞培养和杂交瘤技术,（优选）肿瘤细胞培养和杂交瘤技术,恶性转化细胞系和癌细胞系一样具有永久性生长能力和恶性表型，对此二种来源的细胞系鉴定也是相似的，为研究恶性肿瘤提供了有用模型。而一般转化细胞系只具有无限生长能力，不具有恶性细胞的表型，此种细胞系可相似于正常细胞的模型而被应用。,癌细胞来源于体内正常上皮细胞。癌细胞在体内或体外一样具有无控制生长和分化不全的特点，因此比正常细胞容易培养建细胞系。如20世纪50年代，国外建立了宫颈癌的,Hela,细胞系。,癌细胞的增殖是按指数方式生长的，自一个癌细胞增殖到能触及的程度要经过30代（10,9,，1,cm,3,1,g）。,这样1,cm,3,大小的肿块再经过10代（10,12,，10,cm,3,，1,Kg）。,这样的大小和重量时足以致病人于死亡。经治疗后如细胞数从10,12,减少至10,10,，重约10,g,时可称显效或部分缓解；若肿瘤细胞数减少到10,8,或10,6,，重约100,mg,至10,mg,时，可认为临床治愈或完全缓解，但仍有可能复发。要根治肿瘤细胞，必须彻底消灭所有癌细胞。外科手术切除大量肿瘤细胞，但转移癌细胞仍有复发的危险。,癌细胞的迅速增殖扩散受机体内环境中多种因素的影响如各种生长因子、抑素、激素、多胺、基因调节包括细胞周期基因和癌基因、,cAMP,和,cGMP,浓度（前者对细胞增殖负调节，而后者为相反）。,正常细胞周期的,G,1,期有一个特殊的调节点,R,点，在生长条件不适宜情况下，细胞不能通过调节点而不增殖，细胞通过,G,1,期进入,M,期前受一种不稳定蛋白质调节通过,R,点启动,DNA,的合成，例如抑癌基因,P,53,最重要的生物学功能就是通过调控细胞周期监测点来维持基因组的稳定性，当细胞,DNA,受损时，,P,53,诱导细胞周期终止或凋亡，而,P,53,突变或缺失使,P,53,功能失活则导致基因组紊乱，产生细胞转化。,体内细胞处于不同状态，大概分成三种命运,:,继续增殖细胞，不断离开,G,1,期通过细胞周期中不同时期（,S、G,2、,M）,完成细胞分裂，如骨髓干细胞，胃肠上皮中的基底细胞等，,不增殖细胞，这类细胞在分裂完成后，暂处于,G,1,期，正常情况下不合成,DNA，,不进入细胞分裂期，如肝细胞，只有受损或切除时肝细胞再分裂增殖。哺乳动物的初级卵细胞也属于此类。,不增殖细胞，这类细胞由,R,点走向分化细胞，并执行专门功能的细胞（称终末细胞）如神经细胞、哺乳动物成熟的红细胞、皮肤上皮的角质细胞、多性核粒细胞。,肿瘤和正常的组织同样在体内也具有三种不同的细胞群：,增殖细胞群（,A）：,是肿瘤中处于增殖周期的细胞，与肿瘤生长直接有关，亦是化学疗法最易攻击的部分。,暂不增殖细胞群（,B），,它是延长了,G,1,细胞或,G,0,细胞，目前不参加细胞周期，与肿瘤的扩大暂时无关，由于它保留着增殖的能力，在一定条件下成为肿瘤复发根源。,不再增殖群（,C），,它不再参与细胞周期，而日趋衰老，死亡，对肿瘤增长无意义。肿瘤的增长情况取决于3种细胞群的比例，肿瘤增殖率（,growth factor GF）,可由下列关系来决定：,GF=AA+B+C。A,群细胞越多，,B、C,群细胞越少，肿瘤恶性程度越高。,ml细胞悬液），计算活细胞平均数，连续7天。,转移各标本到另一平皿中，用无菌小型刀剪从肿瘤组织切下外层（细胞活性好）癌块，放于另一无菌平皿中。,而一般转化细胞系只具有无限生长能力，不具有恶性细胞的表型，此种细胞系可相似于正常细胞的模型而被应用。,五、癌细胞系和转化细胞系的鉴定,HITES选择培养基，加有氢化可的松（hydrocordisone）、胰岛素(insulin)、转铁蛋白(tramsferrin)、雌激素(estradiol)、硒(selenium)等成分。,这样的大小和重量时足以致病人于死亡。,2、克隆效应（cloning efficiency）,秋水仙素能与微管蛋白强烈结合，引起微管解体，纺锤体破坏，结果染色体的移动被阻断，细胞分裂停留在中期，它是属于M期的特异性药物。,HEPES缓冲液，10CaHEPES，2CaHEPES磷酸缓冲液，NaAc,Tris-EDTA缓冲液，无水乙醇，Eagles MEM/15%FCS，G418。,可见到清晰的每条染色体和上面的分带。,而一般转化细胞系只具有无限生长能力，不具有恶性细胞的表型，此种细胞系可相似于正常细胞的模型而被应用。,精心传代、换液、避免污染，需经半年以上的细胞培养，方能够达到建立细胞系的目的。,为了制备准确的细胞生长曲线，接种的细胞数要合适，对于癌细胞和转化细胞，通常接种3X104/ml细胞。,04%EDTA，含盖玻片的培养皿，血球计数器，固定细胞，冷醋酸甲醇（acetic:methanol为1：3,ice-cold）新鲜制备，去离子水，放射自显影，乳胶，曝光盒。,证明外源基因有无表达。,常应用体外肿瘤细胞培养，模拟体内环境或确定单因素多因素研究肿瘤细胞发生发展结局。观察抗癌药物对细胞周期作用点的影响也常应用肿瘤细胞体外培养。若能确定肿瘤细胞各周期时间，选择各期针对性药物进行治疗，则可以提高疗效。,放线菌素,D,作用于,G,1,期抑制,DNA,聚合酶合成，作用于,S,后期与,G,2,期抑制,rRNA,并影响,cAMP,水平。放线菌素,D,不影响非分裂期细胞，因而放线菌素,D,是一种细胞周期特异性药物。,阿糖胞嘧啶，选择性地抑制核苷二磷酸还原酶，阻断核苷酸变为脱氧核苷酸，从而抑制,DNA,合成，是,DNA,合成抑制剂，属于,S,期特异性药物。,秋水仙素能与微管蛋白强烈结合，引起微管解体，纺锤体破坏，结果染色体的移动被阻断，细胞分裂停留在中期，它是属于,M,期的特异性药物。,通过体外细胞培养观察抗癌药物对细胞周期作用点将常用的抗癌药物的细胞周期分类。,数十年来医生们除用手术外只能用放疗和化学疗法来治疗癌症，这些疗法毫无分别地同时杀死健康细胞和癌细胞，直到人类基因组图谱的解密，我们才迎来了适用少数病人的靶向性治疗新时代，医生们首先分析病人肿瘤中的,DNA,（,基因），再开出靶向性复合药物的药方，专门攻击肿瘤细胞发生缺陷的基因，达到治疗癌症的目的。,当前较有前景的靶向治疗,现在发展的基因工程腺病毒（,ONYX-015,）,因删除了,E1B 55KD,蛋白而可以选择性的溶解,P53,突变或缺失的肿瘤细胞，此类肿瘤细胞占,50,，也就是腺病毒,ONYX-015,可达到,50,的靶向治疗药物的效果，目前已在头颈部肿瘤中进行期临床试验。,当前较有前景的靶向治疗,肿瘤对化疗和放疗抗性的一种机制是由于,P,53,突变或,P,53,的缺失，人类癌50,%,P,53,突变,Non small cell lung 60,%,Colon 50,%,Breast 40,%,Head and neck 60,%,Ovarian 60,%,制备单克隆抗体，主要是靶向表皮生长因子,EGF,受体,EGFR,和,HER-2,。,80,年代研究人员发现，在人类的脑部、肺部和胰腺等部位的肿瘤中,EGFR,的含量极高，,Artrazeneca,公司的研究人员于,1998,年率先提出通过开发阻断,EGFR,的药物，可以抑制肿瘤的生长，这种全新的疗法就是现在的靶向性疗法，它没有毒副作用，不会杀死正常细胞，按照这种思路，基因技术公司开发出一种治疗晚期乳腺癌的药物,Herceptin,，,并于,1998,年获准上市。,Herceptin,是一种单克隆抗体药物，靶向,HER-2,，,这种药物能使只有,5,个月寿命的晚期乳腺癌病人继续生存。为什么,Herceptin,成功获准，由于临床试验中没有同时对所有乳腺癌患者进行试验，而是选择了其中的一小部分（大约占,25,）的那些,HER-2,含量异常高的晚期乳腺癌患者。,Astrazeneca,公司的肺癌药,Iressa,等都是靶向药物，靶,EGFR,，,但成功的只有,Herceptin。Iressa,只在,10,肺癌患者中有神奇作用，但在大规模的临床试验中,90,人无效。花,3,亿美元，,10,年时间，未获批准。,肿瘤发生发展结局的机理研究进入分子水平，人类最终认识肿瘤才可以征服肿瘤。若癌变,的始发变化是基因活动的调控失常，癌变就具有潜在的可逆行，就可以为肿瘤治疗开辟一个完全新的途径控制调控机制；若癌变的本质是基因突变，那就意味着癌变不可逆，只有了解其突变的部位，只有通过基因治疗，而所有这种机理的研究，其中一个重要的手段是通过肿瘤细胞的体外培养进行研究。虽然体外培养不能完全反映体内情况，但为单因素、多因素研究提供模型。,由于机体内环境是复杂的，每个人影响肿瘤细胞形成因素复杂，在应用单克隆抗体治疗肺癌病人过程中发现对每个人的疗效不一致，这就需要开创个体化抗肿瘤治疗的研究，而开展个,t,体化抗肿瘤治疗的基础，首先将每个病人的肿瘤细胞特征（如肿瘤抗原表达）细胞因子的作用，抗癌药物的筛选，进行研究，这是一个巨大的工作，不是一两个人能完成，需要有一个群体共同协作完成，前后期研究人员通力合作才可完成。,二、癌细胞系的建立,癌细胞来源于体内正常上皮细胞。癌细胞在体外和体内一样具有无控制生长和分化不全的特点，因此比正常细胞容易培养和建系。早在20世纪50年代，国外建立宫劲癌的Hela细胞系以来，随着细胞培养和技术的改进，人各种器官组织来源的癌细胞系不断问世，国外已建立很多癌细胞系。,尽管癌细胞在体外较容易存活和建系，但仍存在一定困难。最主要的问题是从体内到体外环境的改变，阻断了癌细胞在体内从周围正常间质组织和血管获取癌细胞生长最适营养（包括生长因子），及间质细胞过度生长，耗竭了培养基中的营养成分。随着组织培养技术的改进，特别是培养基的改进，促进了癌细胞建系的成功。,（一）癌细胞原代培养,癌细胞建系的方法和程序相似于正常细胞，包括标本收集和处理、消化和培养、传代、换液、冻存、复苏等过程。针对癌细胞特点有以下改进内容。,1标本收集和取材,癌细胞是异质性的，因此取癌组织最外层组织最活跃细胞，同时要注意除去标本中混杂的间质组织。,为了克服癌细胞群体的异质性，在原代培养取材时可考虑采用转移灶标本，如转移的淋巴结、癌性胸腹水等。转移组织中的癌细胞已经经过生长优势选择，群体细胞比较均一，增殖细胞群比肿瘤细胞更易于生长。取材后尽快将癌组织进行培养，一般4小时内细胞存活最好。标本在4存放，不要超过24小时。,人癌细胞建系必须要有完整的记录，包括组织来源、病人姓名、住院号、年龄、性别、临床诊断、病理诊断（应明确分类分期）、术前放化疗情况，为细胞建系的重要材料。为了鉴定建立的细胞系来源和生物学特性，最好留有病人正常组织和血标本。,2分散癌组织,癌组织多为较坚实实体（少数例外，如卵巢癌、脑癌），含有丰富的间质细胞，因此用酶消化癌组织，是分散癌细胞的好的方法。,少数含结缔组织不多的癌组织可选用机械分散的方法。机械分散对癌细胞损伤小，但有过多的纤维细胞从结缔组织中离散出来。,胰蛋白酶,(trypsin),是最常应用的酶，但它对结缔组织的消化能力有限，适合含结缔组织较少的肿瘤，并且,trypsin,对细胞膜有损害作用，影响细胞存活。胶原酶消化癌组织证明更有效，可抑制结缔组织细胞的生长。,胶原酶的消化方法：,0.5mg,ml,胶原酶处理，可在显微镜下观察，纤维细胞逐渐被除去为止。用,Hanks,液或培养基洗涤，除去附着细胞的酶，再进行接种和培养。,当肿瘤组织标本很小，不能用酶消化获取癌细胞时，可以用组织块法进行原代培养。体内恶性肿瘤呈外向浸润生长，肿瘤过快，使肿瘤中心组织呈坏死，因此取材时应避开这部分。但癌组织中不可避免有已经耗竭和坏死的细胞，因此在酶消化组织前，应尽可能清除这些细胞，以免接种后很快溶解破坏，释放出影响癌细胞生长的有害物。,3接种肿瘤细胞,trypsin,消化或,collagenase,消化的肿瘤组织制备的癌细胞，应有足够的细胞密度，通常接种细胞浓度为,510,5,ml,，,37,培养，通常,3,周左右可见饲养层上有集落生长。,4成纤维细胞过度生长的去除,上面已介绍了癌组织中成纤维细胞过度生长对癌细胞生长和建系有影响。用选择培养基、饲养层等方法可以克服其过度生长。可应用以下方法：,（,1,）机械排除法：将玻璃吸管前端在火焰上烧弯曲，用作除去成纤维细胞的工具。可在显微镜下直接刮除生长的成纤维细胞，也可事先在显微镜下对有成纤维细胞生长的单层培养瓶上做出标记，然后按标记刮除。刮除后，用培养液洗,12,次后，加入新培养液培养。如需要可多次刮除。,（,2,）反复贴壁：根据肿瘤细胞与成纤维细胞贴壁快慢的差异，可以把两种细胞分开。用消化酶消化细胞，接种到培养瓶后，加入培养基，将培养瓶（,A,）放置,371020,分钟左右，将培养上清倒到另一培养瓶（,B,），加入新培养基，放置,371020,分钟，将,B,瓶上清倒入,C,瓶，置,37,培养。将,A,、,B,、,C,瓶与,37,培养,2448,小时后于显微镜下观察，将含有成纤维细胞的培养瓶弃去，保留含上皮细胞的培养瓶。如果上皮细胞中仍含有成纤维细胞，可按上述方法继续重复处理，直到成纤维细胞去除。,5培养基,在癌细胞建系中，选择性培养基的应用是提高癌细胞体外存活、抑制成纤维细胞生长的关键技术改进。选择培养基是针对特殊细胞生长的营养要求设计的。针对癌细胞的特点，选择性培养基应含少量血清。,血清对上皮细胞有抑制作用有利于成纤维细胞生长。因此用低或无血清培养基为好。改良,RPMI-1640,培养基可提高癌细胞存活。,HITES,选择培养基，加有氢化可的松（,hydrocordisone,）、胰岛素,(insulin),、转铁蛋白,(tramsferrin),、雌激素,(estradiol),、硒,(selenium),等成分。,HITES,培养基适合用于人小细胞肺癌建系。,Insulin,、,tramsferrin,、,selenium,、,hydrocordisone,、,EGF,、,BSA,、和丙酮酸钠（,sodium pyruvate,）。为了抑制成纤维细胞生长，在培养基中加入成纤维细胞的抗体或成纤维细胞代谢抑制成分，也可提高癌细胞系建系率。,6饲养层,在培养器皿底部接种能形成接触性抑制的成纤维细胞饲养层，可以有利于癌细胞贴壁生长和抑制癌组织中正常成纤维细胞过度生长。,可以应用多种组织来源的成纤维细胞如人胎小肠细胞、,FHS741,作为饲养层，培养乳腺癌细胞，小鼠,3T3,细胞或,STO,胚胎成纤维细胞常被应用作饲养层。,将,trypsin,或,collagenase,消化的肿瘤组织细胞制备的单细胞悬液，接种到形成单层的饲养层细胞上，肿瘤细胞可形成集落，成纤维细胞不形成。,饲养层的制备,将经过放射处理的小鼠,3T3,细胞接种到培养瓶。,材料：无菌,3T3,细胞，培养基，丝裂霉素,C 5ug/ml,（无血清培养配制或,BSS,），,X-ray,或,60Co,30Gy,照射。,方法：,trypsin,消化体外传代培养的,3T3,细胞，再以,10,5,/ml,细胞浓度接种。,50%,细胞出现汇合，加入,0.25ug/ml,丝裂霉素,C 2ug/10,6,细胞，过夜（或用放射,60Co,代替）。,24,小时后换液，,trypsin,消化细胞，再接种到新培养瓶，每毫升,510,4,细胞加入培养基，培养,2448,小时作为饲养层。,（二）癌细胞原代培养的换液和传代,1换液,通常细胞产生酸性代谢产物，培养上清呈黄色（培养瓶中含有酚红pH指示剂）时，需要及时换液，癌细胞在对数期增殖迅速，每天均需换液，倍增时间较长的细胞可以隔日换一次。,2传代,原代培养的癌细胞应掌握合适的第二代传代时间。一般不需要等细胞长到,100%,汇合才传代。肿瘤细胞与正常细胞生长特点不同，表现为重叠生长。当在显微镜下观察到上皮样细胞汇合达,50%,左右，可见细胞层上堆积有圆形的细胞，指示细胞增殖活跃时就可以传代。,常规传代：原代培养物第一次传代后，需要常规传代维持细胞在体外正常生长。细胞象正常细胞一样在体外 生长可分为潜伏期、对数期和平坦期。尽管各种来源的癌细胞系倍增时间快慢不同，每种细胞系传代时间有所不同。通常在细胞接种后,5,天左右传代一次。一瓶原癌细胞传到,15,瓶。如果计数细胞浓度，每瓶可接种（,24,）,10,5,细胞。为建成永久性细胞系需长期传代达,50,次以上。,3冻存和复苏,建立癌细胞系需要在体外进行长期培养和传代，传代,50,次以上才能被认做是永久性细胞系。因此，建系过程需要不断冻存细胞以防止细胞系中断。冻存不同传代次数的细胞液为了提供各种代数的癌细胞为科研应用。体外长期传代可能引起基因不稳定，在细胞表型上发生改变，影响研究结果。因此，从第一代传代后，就应尽早地冻存培养物。冻存细胞和复苏方法与正常细胞相同，可参照正常细胞。,（三）人肺癌细胞建系,人肺癌细胞系的建立。从外科切除的人肺癌标本取材，用胰酶消化组织成单细胞悬液，接种细胞于培养瓶，加入含,10%,灭活胎牛血清的,RPMI1640,生长培养基，,CO,2,暖箱,37,培养。,1、材料,无菌组织培养皿、组织培养瓶、吸管等。眼科剪刀、镊子、含搅拌磁棒的玻璃烧瓶。生长培养基：RPMI1640+10%灭活胎牛血清。消化液：0.5%胰蛋白酶（trypsin）+0.04%乙二胺四乙酸二钠溶液（EDTA），PBS。小型磁力搅拌器。,2、方法,从手术切除的肺鳞癌、腺癌、肺泡细胞癌和小细胞癌等标本无菌取肿瘤组织，放入无菌玻璃瓶，立即送实验室（不需灭菌），每例癌标本有明确记录，包括患者姓名、性别、年龄、手术时间、病理诊断等。,将每种肿瘤组织各放入无菌平皿，去除血块和坏死组织，用无菌,PBS,冲洗多次，直到无血迹。转移各标本到另一平皿中，用无菌小型刀剪从肿瘤组织切下外层（细胞活性好）癌块，放于另一无菌平皿中。,用剪刀将平皿中癌组织剪成,12mm,小块，放入有磁力搅拌棒的小玻璃三角烧瓶中。,加入消化液（,0.5%trypsin+0.04%EDTA,）覆盖组织块。烧瓶放在磁力搅拌器上，缓慢搅拌,15,分钟。,重复步骤,4,，直到细胞组织块完全消化，收集消化液于瓶中。,吸出收集的消化液到另一个灭菌玻瓶中。,离心,3000rpm,，,15,分钟，弃上清。用含血清培养基悬浮沉淀。,计数细胞。制备,510,5,/ml,细胞悬液，接种到培养瓶（细胞悬液所占空间为培养瓶的,1/3,）。置,37,，,CO,2,温箱培养。,接种细胞,48,小时后，于倒置显微镜下观察细胞，如细胞已大部分贴壁，可换液一次，清除上清中的死细胞，加入新的培养基。,3、结果,接种细胞后,319,天（鳞癌、腺癌、小细胞癌），细胞开始生长。细胞为上皮样（鳞腺癌）和圆形小细胞（小细胞癌）。细胞贴壁生长，增殖速度不同，分别从,23112,天传第一代，细胞失去接触性抑制，重叠生长。从低代开始冻存细胞，建立了 肺鳞癌细胞系，命名为,LTEP-S,（,lung trmor epithelial pulmonary-squamous,）；,2,个肺腺癌细胞系，为,LTEP-al,（,adenocarcinoma-l,）,LTEP-a2,；肺泡细胞癌细胞系，,LTEP-a3,；小细胞肺癌，为,LTEP-Sm(small cell line lung cancer),。,（四）注意事项,尽快培养肿瘤组织是获得癌细胞建系重要的因素。及时去除生长的成纤维细胞（用刮除的方法较为简便），有利于癌细胞的生长。掌握好第一次传代时间，扩增均匀生长优势的癌细胞，使其在体外能够成为细胞系。精心传代、换液、避免污染，需经半年以上的细胞培养，方能够达到建立细胞系的目的。,三、转化细胞系建立,转化是指细胞发生了不可逆转的遗传改变而引起恒定表型改变的事件。转化细胞系可由于细胞本身基因不稳定（啮齿类）在传代中自发发生，也可用放射、致突变剂、病毒以及外源基因等因素处理，引起细胞产生遗传改变。,转化细胞系主要有,3,个类型改变：,有限分裂的细胞变为无限增殖的细胞，获得不死性，成为永久性细胞系。,细胞不正常自主性生长，丧失细胞接触性抑制、过饱和密度、无停泊依赖等正常细胞生长特点。,致瘤性。细胞可在免疫缺陷小鼠体内浸润生长，形成肿瘤。,判断恶性转化或一般转化细胞系最主要的指标。恶性转化细胞系已具有恶性表型。一般转化细胞系也可能在体外有不正常的生长表型，但在体内不能形成肿瘤。,1诱变转化细胞的方法,（1）转化细胞的选择：可从原代培养的正常细胞、传代的正常细胞选择。成纤维细胞易于转化，上皮细胞较难。,（,2,）转化因素：,化学致突变剂，常用的甲基硝基亚硝基胍（,N-methy-N-nitro-Nnitrosoguanidine,MNNG,）；,物理方法：射线照射；,病毒转化：用,EB,病毒传染淋巴细胞引起转化，,SV40,病毒转化正常细胞成为恶性细胞；,用外源基因转染细胞，诱发细胞转化，已获得较高的转染率，转化的外源基因包括癌基因如,ras,、,mye,，病毒基因，如,SV40LT,抗原基因、端粒酶基因等。,2外源基因转化细胞，建立转化细胞系，包括以下程序：,选择合适的外源基因，如,SV40LT,抗原基因传染人成纤维细胞有效。构建外源基因表达载体（质粒），含有合适的标记基因作为阳性传染细胞的选择（质粒上有新霉素耐受基因，可用,G418,选择）。,选择合适的转基因方法：化学方法最常用磷酸钙、脂质体（,lipfectin,）、基因枪、电转移等。,选择合适的转染细胞。,用转基因方法转染细胞获阳性集落。,证明外源基因有无表达。,证明转染细胞的表型是否改变和有无致瘤性。,（1）SV40LT抗原基因转化人的成纤维细胞：,虽然鼠来源的成纤维细胞可以经培养后成为长期培养的细胞系，但人的成纤维细胞在体外培养很难成为永久细胞系。用SV40LT抗原基因转化人成纤维细胞是最成功的方法。,材料,HEPES缓冲液，10CaHEPES，2CaHEPES磷酸缓冲液，NaAc,Tris-EDTA缓冲液，无水乙醇，Eagles MEM/15%FCS，G418。均为无菌液。,方法,1,）制备转化所需,DNA,：制备,DNA-,磷酸钙溶液：,DNA20ug/ml,，,CaCl2 0.125M,，,NaPO4 0.75mM,，,NaCl 140mM,，,HEPES 12.5Mm,，,pH 7012,。,2,）转化细胞的制备：对数生长的成纤维细胞，稀薄啊达,7080%,汇合，转化前一天换液，用无血清培养基。,3,）转化细胞：将,1mlDNA,磷酸钙沉淀加入到培养皿（,3ml,）覆盖细胞，处理,6,小时或更长，于,37 CO2,暖箱。,4,）去除和洗涤培养液，加入生长培养基（,EMEM,，,15%FCS,）培养,48,小时后，加入,G418 200ug/ml,。,5,）更换培养基，含,G418,浓度可降低或不变，鉴定耐受集落生长，直到大多数细胞死亡。,6,）可利用克隆环，挑选集落，用,trypsin,消化单个集落，继续培养，直到细胞继续生长。,7,）尽早冻存细胞，传代中多次冻存。,8,）持续传代细胞，直到细胞死亡，不能再传代。,结果,可建立永久传代的恶性转化细胞系。但有可能用此方法建立的转化细胞系不一定具有恶性特征，可能与所转染细胞的基因稳定有关。,【注意事项】,永久细胞系的建立，细胞具有过度生长的“危相”，大多数细胞死亡，仅少数集落出现。通过及时换液，保持培养液pH恒定和补充营养。,（2）转染端粒酶基因，可诱导转化细胞系的建立：,端粒酶在细胞内表达，抵消细胞分裂所致端粒缩短，是癌细胞获得不死性的重要分子机制。转染外源端粒酶基因于有限期传代的正常细胞系，包括人上皮细胞和成纤维细胞、血管内皮细胞等，均可诱导产生永久性细胞系，并证明了转染细胞中，端粒酶表达和端粒缩短受到了控制。,最近有报告证明了用猿,SV40,病毒基因和人端粒逆转录酶基因（,HTERT gene,）两种转化方法转染人的上皮细胞，均可获得不死性细胞系，在转化细胞内可检测到端粒酶活性和控制了端粒缩短。,SV40,诱导的不死性细胞，伴有细胞不正常分化和核型不稳定，表现出对动物一定程度的致瘤性。而端粒酶传染的细胞很少有核型的改变和上皮细胞分化的特点，保持更多正常细胞的表型。说明用,SV40LT,抗原基因和,HTERT gene,转化细胞存在一定差异，,SV40LT,多引起细胞恶性转化，而,HTERT gene,主要诱导细胞获得不死性。,（3）转基因小鼠：,利用转基因小鼠可以建立转化细胞系，基本方法是设计有某种基因突变、缺失、嵌入病毒基因的,DNA,，植入小鼠的卵母细胞。发育的转基因小鼠将携带有表达某种基因的组织，从小鼠组织取材，可以获得转化细胞系。例如,H2kbtsA58,转基因小鼠，含有,SV40LT,抗原，从小鼠各种组织取材，可以建立多种永久转化细胞系。因此，利用转基因小鼠是建立细胞系快速有效的方法。,（4）EB病毒感染B细胞建立转化细胞系,EB病毒感染人外周血B淋巴细胞后，B细胞便能够被转化，并在体外继代生长，建立细胞系，长期储存的液氮，解决研究中大量细胞的来源。,材料和方法：,取健康人外周血5ml，加肝素（10u/ml）抗凝常规免疫方法分离淋巴细胞，用RPMI-1640含10%新生牛血清培养液，洗涤一次 1000rpm 10min离心，沉淀细胞悬浮于RPMI-1640 20%胎牛血清 调整细胞浓度。,EB,病毒 标准株,B95-8,细胞系可产生高浓度,EB,病毒上清（,510,5,/ml,），用,0.22um,微孔滤膜过滤获细胞培养上清分装储存备用。,淋巴细胞特征：取淋巴细胞悬液,1ml,，,EB,病毒,1ml,加至培养瓶混匀，,371h,，吸附后，加入,34ml,含,20%,胎牛血清的,RPMI-1640,培养液，,375%CO2,孵育,35,天后用倒镜观察淋巴细胞程度，补加培养液 当细胞浓度达,110,6,/ml,，离心收集悬浮细胞，冻存液氮，同时采用合成黄染检测细胞活性，以细胞存率来评估细胞冻存前后的活性，一般冻存前的细胞活性约,95%,，冻存后为,90%,。,在转化过程中，淋巴细胞的浓度（,210,5,/ml,）和,EB,病毒的滴度、用量、新鲜程度,-70,储存,9,个月内,EB,病毒,1ml,均对淋巴细胞的转化为适合，转化成功率达,85100%,。但在,EB,病毒转化,B,细胞的同时，又能刺激,T,细胞亚群的活性，细胞毒,T,细胞作用,B,细胞使转化失败，克服这一作用可通过控制淋巴细胞接种密度和加入环胞素,A,来消除毒性,T,细胞作用。（参考郑从义等报导）,四、癌细胞系和转化细胞系注意事项,针对癌细胞建系存在的问题，进行细胞培养技术的改进，包括：,采用无血清或低血清培养基，可以抑制成纤维细胞的生长和降低其对癌胞生长不利的影响。同时补充癌细胞生长必要的成分。如上皮生长因子、转铁蛋白、胰岛素等。事实上仅少数建立的癌细胞系使采用无血清培养基。这可能与无血清培养需加入的其他成分价格昂贵和制备不便有关。,接种癌细胞成纤维细胞饲养层，有利癌细胞的生长。,除去生长的成纤维细胞。,由于组织培养技术的改进，国外癌细胞建系率已很高。国内癌细胞的建系还较少，就组织培养方法仍待改进。,建立转化细胞系，通常用已建成的正常细胞系进行转化，所以不存在上述癌细胞建系原代培养所存在的问题。能否建成转化细胞，除要选择合适的细胞系外（遗传形状过于稳定的细胞不易转化）对转化方法的选择也很关键。转染外源病毒基因，如,SV40LT,，有较高的转化率。该方法在国内已能很好应用。从转基因小鼠组织取材建立细胞系在国外已有一些报告，该方法的应用，不仅提高了建系率，而且使那些常规细胞培养方法不能建立的细胞系，通过转基因动物可以建立携带某种靶基因的细胞系，为细胞培养和建立细胞系开拓了新的局面。,五、癌细胞系和转化细胞系的鉴定,癌细胞有染色体,DNA,、,RNA,已经蛋白质水平的分子异常和恶性表型，癌细胞系应反映来源癌组织的分子异常和恶性表型。因此，癌细胞系的鉴定主要包括细胞组织来源和恶性特征。随着细胞分子生物学的进步，对癌细胞认识的深入，反映在鉴定癌细胞系恶性特征的指标也越来越多。转化细胞如果是正常细胞系转化而来，不需再进行组织来源鉴定，仅明确是否已获得了不死性，已经确定是恶性转化或一般转化。,五、癌细胞系和转化细胞系的鉴定,癌细胞有染色体,DNA,、,RNA,已经蛋白质水平的分子异常和恶性表型，癌细胞系应反映来源癌组织的分子异常和恶性表型。因此，癌细胞系的鉴定主要包括细胞组织来源和恶性特征。随着细胞分子生物学的进步，对癌细胞认识的深入，反映在鉴定癌细胞系恶性特征的指标也越来越多。转化细胞如果是正常细胞系转化而来，不需再进行组织来源鉴定，仅明确是否已获得了不死性，已经确定是恶性转化或一般转化。,（一）细胞形态学,1,光镜直接检查,结果癌细胞呈多边形上皮样细胞，易于和正常成纤维细胞区分。癌细胞正失支正常细胞间接触性抑制，呈现重叠生长。可见细胞重叠层上有折光度强的圆形细胞。这些特点可与正常上皮细胞区分，转化细胞可出现与癌细胞重叠生长相似的特点。,2、细胞染色检查,见正常细胞鉴定，除,Giemsa,染色外，可用瑞氏结晶紫等染色,结果,癌细胞呈多边形，排列不规则，细胞重叠。细胞核大，核浆比例增大，深染突出、不规则，可见异常分裂象。有的上皮样转化细胞有相同特点。,3、细胞超微结构的检查,结果,细胞核大，不规则。胞浆内如观察到桥粒、张力原纤维等可上皮细胞的特点，观察到分泌颗粒是腺细胞特点，如有神经分流颗粒是神经内分泌细胞特点。细胞超微结构检查对于鉴定细胞系的组织来源和细胞恶性特点有重要意义。,（二）染色体异常,癌细胞存在多种染色体水平的异常。癌细胞是异倍体，存在染色体缺失、重排和移位等异常，染色体显带技术可用于检查和鉴别正常细胞和恶性细胞染色体差异。检查染色体异常除用普通方法外，还可用染色体分带技术来检查染色体细微改变。染色体分带技术是用特殊技术将染色单体上着色出深浅带（,band,），显示染色体的结构。,1,、,trypsin-G,带染色,材料：,细胞中期染色体标本（见正常细胞染色体分析部分），,trysin-Giemsa,混合染液，水浴箱。,方法,（,1,）预处理：癌细胞系中期染色体标本置,6080,水浴,30,分钟左右或,37,过夜，取出玻片放入,0.025M,磷酸缓冲液（,pH6.8,）,5610,分钟,（,2,）用新配置的,trypsin-Giemsa,混合显带液处理,10-30,分钟,（,3,）封片：染色后用自来水冲洗（冲洗标本背后，以色冲洗过分，使细胞脱落），封片,结果,可见到清晰的每条染色体和上面的分带。癌细胞核型异常为异倍体，多在亚二倍体和三倍体之间，与正常细胞二倍体不同，每条染色体数目有增多或减少。在每条染色体上带型与正常标准相比，有缺失和增加的带以及移位等异常表现。通常转化为异倍体。,2、Giemsa显带法,材料,细胞中期染色体标本，,trypsin,消化液，,Giemsa,染液，水浴箱。,方法,（,1,）预处理：标本置入,6080,温箱,20-30,分，,37,烤箱过夜。,（,2,）,trypsin,消化：,3-5,分钟，冲洗多余的酶,（,3,）将标本放入,Giemsa,染液中染色,10,分钟,（,4,）封片：自来水冲洗，晾干后二甲苯透明,2-3,分钟，封入树胶,（4）每日取3个平皿trypsin消化，将细胞悬液用血球计数器计数活细胞（0.,1、生长曲线和倍增时间,若癌变的本质是基因突变，那就意味着癌变不可逆，只有了解其突变的部位，只有通过基因治疗，而所有这种机理的研究，其中一个重要的手段是通过肿瘤细胞的体外培养进行研究。,HEPES缓冲液，10CaHEPES，2CaHEPES磷酸缓冲液，NaAc,Tris-EDTA缓冲液，无水乙醇，Eagles MEM/15%FCS，G418。,选择培养基是针对特殊细胞生长的营养要求设计的。,常应用体外肿瘤细胞培养，模拟体内环境或确定单因素多因素研究肿瘤细胞发生发展结局。,癌细胞或转化细胞标记指数高于正常细胞，显示过饱和生长，转化细胞与母系相比有明显差异。,可在显微镜下直接刮除生长的成纤维细胞，也可事先在显微镜下对有成纤维细胞生长的单层培养瓶上做出标记，然后按标记刮除。,（3）制备细胞悬液：取对数生长期的转化细胞，实验前一天换液，trypsin消化成单个细胞，制备105/ml细胞悬液。,（2）用新配置的trypsin-Giemsa混合显带液处理10-30分钟,如20世纪50年代，国外建立了宫颈癌的Hela细胞系。,8）持续传代细胞，直到细胞死亡，不能再传代。,染色和封片：用水洗2分钟，用去离子水洗1次，用Giemsa染色，将盖玻片黑覆盖在玻片上封片。,改良RPMI-1640培养基可提高癌细胞存活。,为了鉴定建立的细胞系来源和生物学特性，最好留有病人正常组织和血标本。,结果,可见到清晰的每条染色体和染色体上的分带。癌细胞核型为异倍体，多在来二倍体和三部体之间，与正常细胞二倍体不同，每条染色体数目有增多或减少。在每条染色体上的带型与正常标准相比，可以显示染色体带区细微结构改变，如移位、倒置、缺换等异常这些异常是细胞系的遗传标记。如几乎在,100%,的小细胞肺癌和肾癌有三号染色体短臂缺失发生，为鉴定细胞系的组织来源提供了依据。从染色体核型分析可以辨别是人或鼠来源（见正常细胞系鉴定）。,（三）体外生长异常,癌细胞（或转化细胞）体内外无控制增殖是恶性细胞的特征。癌细胞丧失正常细胞接触性抑制、停泊依赖等生长特点，表现为增殖加速，生长呈过程和密度，在软琼脂上形成集落等不正常生长特点，通过以下实验，对于鉴定恶性生长有重要意义。,1、生长曲线和倍增时间,培养细胞经历一代（从上一代传代到下一次传代的时间，通常,7,天左右），包括潜伏期、对数期、平坦期三个阶段。通过计数,7,天细胞，可以记录出生长阶段，绘制出生长曲线，计算出细胞倍增时间。可鉴定癌细胞和正常细胞群体生长增殖速度的差异。,材料,0.25%trypsin+0.04%EDTA消化液，含10%灭活胎牛血清的DMEM培养基，0.1%台酚蓝溶液，平皿，培养皿，血球计数器，半对数纸。,方法,（,1,）对数期生长的细胞于试验前一天换液。如检测转化细胞，可同时接种转化前细胞，以便比较。,（,2,）用,trypsin,消化细胞制备细胞悬液，用生长培养基制备,3X10,4,/ml,细胞悬液，每种细胞接种于,25,个直径,35mm,塑料培养皿中，每皿,3ml,，于,CO2,暖箱,37,培养。,方法,（,3,）次日于显微镜下挑选细胞生长均匀的培养皿，共,21,皿。,（,4,）每日取,3,个平皿,trypsin,消化，将细胞悬液用血球计数器计数活细胞（,0.1%,台酚蓝溶液,0.9ml,加入,0.ml,细胞悬液），计算活细胞平均数，连续,7,天。,（,5,）以细胞数为纵坐标，培养天数为横坐标，在半对数纸上绘制生长曲线，并计算细胞倍增时间。,结果,癌细胞潜伏期短，对数期生长明显，转化细胞与转化前细胞相比较，可见转化细胞对数期生长速度明显增加。依据生长曲线，计算出细胞倍增时间。倍增时间短，反映了细胞恶性生长。,注意事项,为了制备准确的细胞生长曲线，接种的细胞数要合适，对于癌细胞和转化细胞，通常接种,3X10,4,/ml,细胞。但在不同细胞系生长速度差异较大，可以根据情况调整。为了防止每皿细胞的实验误差，可以在开始时多接种几皿细胞，以便挑选细胞生长更均一的平皿进行实验，每日计数至少,3,皿，减少皿间差异。,2、克隆效应（clo