流式细胞仪原理和一般用法.ppt

Mastertitelformat bearbeiten,Mastertextformat bearbeiten,Zweite Ebene,Dritte Ebene,Vierte Ebene,Fnfte Ebene,Mastertitelformat bearbeiten,Mastertextformat bearbeiten,Zweite Ebene,Dritte Ebene,Vierte Ebene,Fnfte Ebene,Partec-Excellence in Flow Cytometry,Contributions to New Developments in Medical Diagnosis and Microbiology,德国,Partec,公司中国服务中心,张向阳,超过,41,年的研发经验,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,流式细胞仪的原理,流式细胞仪使用一般方法及技巧,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,流式细胞术,流式细胞分析，又称流式细胞术（,flow cytometry,，,FCM,），是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术。他综合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等各门学科。,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,流式细胞术,流式细胞分析，又称流式细胞术（,flow cytometry,，,FCM,），是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术。他综合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等各门学科。,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,特点：,（,1,）单细胞分析。,（,2,）快速分析。,（,3,）多参数相关测量。,（,4,）定性或定量分析细胞。,（,5,）统计学意义明显。,（,6,）分选。,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,荧 光,有些物质，当用光照射时，它吸收了该种波长的光后还会发射出各种颜色和不同强度的光，而当光停止照射后，这种发射的光也随之消失，这种发射的光称为荧光,(fluorescence),。荧光的波长比吸收光线的波长要长些。由于物质的分子结构不同，所吸收的光和所发射的荧光波长也不同。被这些物质吸收的光称为激发光，产生的发射光即荧光。荧光的颜色多为红、蓝、绿或黄等。,物质的荧光有两种，一种是自发性荧光，即组织在短波长光照射下自行发射出的荧光。如，组织中的蛋白质和脂类在紫外线照射下能发射出微弱的淡蓝色荧光。另一种荧光是诱发荧光，即细胞与荧光色素结合后，经一定波长的光线照射后发出的荧光。常用的是诱发荧光，能产生荧光的生物染色剂称为荧光染料,(,或称荧光色素,),。,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,荧光激发与发射原理,能量级,激发,激发态,发射,激光,能量损失,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,免疫荧光技术,免疫荧光技术是根据抗原,抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗原或抗体，再用这种荧光抗体,(,或抗原,),作为探针检测细胞表面或细胞内的相应抗原,(,或抗体,),。从而使形成的抗原,抗体复合物上含有标记的荧光素，利用流式细胞仪检测标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光,(,如，黄、绿色或红色等,),，通过确定抗原或抗体的性质、定位来推断细胞的信息，以及利用定量技术测定含量。,常用方法：,单抗直接标记,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,嵌入性染料,如,DAPI,、赫斯特、,PI,等，直接与细胞内的,DNA,双螺旋结构中的,A-T,碱基对结合，从而使细胞在激发光的照射下发特定波长的光，通过判断发射光的强弱来推算,A-T,碱基对的多少，从而得知,DNA,的倍性关系。,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,细胞膜电位、离子、脂类探针,现已发现或开发出来了各种细胞膜电位、各类离子、,pH,值、脂类探针，运用这些探针在流式细胞仪上可轻易检测各种细胞功能，可实现一些意想不到的效果。,详细信息，见细胞探针公司网站：,www.molecularP,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,与流式细胞仪相关的荧光术语,MESF,（,Molecules of equivalent soluble fluorochrome,）等量可溶性荧光分子：国际标准单位，用来衡量荧光强度,自发荧光：细胞或颗粒在激发照射下会发出各种波长的荧光。白细胞自发荧光强度为,6501150MESF,，血小板及其他颗粒自发荧光更低,流式细胞仪精度：分析白细胞要求精度在,600MESF,以内，分析其他细胞或颗粒需要更高的精度：,200MESF,以内,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,常见荧光染料列表,染料名称,激发波长,（,nm,）,最大发射,波长,(nm),应用,抗,体,FITC,488,530,一般应用,PEARDI,488/565,575,FITC,及,2,重染色,ECD,488/565,613,多重免疫染色用,PC5/PE-Cy5,488/565/650,670,多重免疫染色用,PC7/PE-Cy7,488/565,767,多重免疫染色用,Cy5,633,670,多重免疫染色用,APC,650,660,多重免疫染色用,D,N,A,/,R,N,A,Pl,488/536,617,1,色染色体、,DNA,细胞周期、除去死细胞,YOYO-l,491,509,DNA,细胞周期、除去死细胞,CPO,488,530/670,DNA(530)/RNA(670),、网织红细胞检测,7-AAD,546,647,G-C,特异性、,DNA,细胞周期、除去死细胞,SYTO16,488,518,活细胞染色,SYTOX Green,504,523,DNA,细胞周期,TO-PRO-3,642,661,除去死细胞,DAPI,360,DNA,细胞周期,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,常见荧光染料列表,钙,Fluo-3AAMA,506,525,细胞内钙离子的检测,Fura RedAAMA,473,670,细胞内钙离子的检测,pH,BCECF(AM),488,535,细胞内,pH,SNARF-l(AM),488,587A635,细胞内,pH(pH6-9),酶,Fluorecein,495,519,与酶基质结合后使用、检测活细胞内酶活性,Rhodamine-110,497,520,与酶基质结合后使用、检测活细胞内酶活性,其,它,CMFDA,488,530,活细胞内水平检测、,MDR,Rhodamine-123,488,530,活细胞内线粒体、,MDR,EGFP,488,510,基因表达,DiOC2(3),488,530,细胞膜电位,DiBAC4(3),493,516,细胞膜电位,DCFH-DA,488,530,细胞内活性酶,DHR,505,534,细胞内活性酶,FDA,488,530,活细胞染色,Calcein AM,496,517,活细胞染色、乙啡叮 同型二聚体,-1,的双色检测判断细胞死活,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,常用荧光染料种类,488nm,蓝色激光激发：,FITC(,异硫氰酸荧光素）：绿色,530nm,PE,（藻红蛋白）：橙黄色,575nm,PE-Cy5,（,PE,的衍生物）：红色,665nm,PerCP(,多甲藻黄素叶绿素蛋白）：红色,675nm,PI(,碘化丙啶）：橙红色,620nm,637nm,红色激光激发：,APC(,别藻兰蛋白）：红色,665nm,APC-Cy5(,别藻兰蛋白的衍生物）：深红色,710nm,365nm,紫外光激发：,DAPI,（,4,，,6-,咪基,-2,联苯吲哚）：蓝色,455nm,532nm,绿色激光激发：,PE,（藻红蛋白）：橙黄色,575nm,PE-Dy647,（,PE,的衍生物）：红色,647nm,PE-Cy5,（,PE,的衍生物）：红色,665nm,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,流式细胞仪的原理概述,流式细胞仪（,Flow Cytometer,简称,FCM,）是一种自动分析细胞的高端技术设备，其原理是悬浮在液体中的细胞一个个地依次通过测量区，当每个细胞通过测量区并被激发光照射时产生光信号，然后被光电倍增管（,PMT,）转化成电信号，这些信号可以代表荧光、普通光散射、光吸收或细胞的阻抗等。这些信号可以被测量、存贮、显示，于是细胞的一系列重要的物理特征和生化特征就被快速地、大量地测定。上述特征可以是细胞的大小、活性，核酸的数量、酶、抗原等等。仪器还可以根据所规定的参量把指定的细胞亚群从整个群体中分选出来。,废液,检测器,&,计数器,样品,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,流式细胞仪的原理工作原理,待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力下进入流动室。流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，成为细胞液柱。液柱与入射的激光束垂直相交，相交点称为测量区。通过测量区的细胞被激发产生荧光。在与入射光束和液柱垂直的方向放置光学系统（透镜、光阑，滤片和检测器等）用以收集荧光信号。光电倍增管将收集的光信号转化为电信号再传输至计算机，计算机通过相应的软件将电信号模拟成图像。,流动室,(Flow Cuvette,或,Flow Cell),是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为,350,250um,的长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较慢,因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。,流动室内充满了鞘液,鞘液的作用是将样品流环包。鞘液流是一种稳定流动的液体，操作人员无法随意改变其流动的速度,样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦，使样品流不会脱离液流的轴线方向，结合样品喷嘴的特殊结构，从而保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞信息（散射光和荧光）。,超过,41,年的研发经验,激光，,如：,488nm,FL2 PE,SSC,FSC,液路,电子元件部分,计算机,FL3 PerCP,Cy5,FL1 FITC,光学接收器,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,流式细胞仪的构造,流动室及液流驱动系统,激光光源及光束形成系统,光学系统（滤光片组）,信号检测与存储系统,显示、分析系统,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,激 光,提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源，这是因为由于细胞的快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为微秒左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此,要求,细胞必须达到足够的光照强度。,激光光束在到达流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成几何尺寸约即短轴稍大于细胞的直径的光斑。这种椭园形光斑激光能量分布属正态分布,;,为保证样品中细胞是一个一个分别受到光照并且受照强度十分一致,须将样本流与激光束正交且相交于激光能量分布峰值处,台式机,FCM,的光路调节对用户是封闭的，即安装时由工程师调试完毕后,无需用户作任何调节,所以用户操作十分方便。,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,光学系统,流式细胞仪的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。,在流式细胞仪的光学系统中主要光学原件是滤光片，主要分为三类：,长通滤片,LP,短通滤片,SP,带通滤片,BP,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,长通滤片,长通滤片使特定波长以上的光通过，特定波长以下的不通过。如,LP500,滤片，将允许,500 nm,以上的光通过，而,500 nm,以下的光吸收或返回。,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,短通滤片,与长通滤片相反，特定波长以下的光通过，特定波长以上的光吸收或返回。,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,带通滤片,带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光波段的范围。如,BP 500/50,表示其允许通过波长范围为,475nm525nm,。,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,信号检测与分析,当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射区时，受激光激发，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间,360,度立体角发射，产生散射光和荧光信号,下图是以激发光光源波长,488nm,为例的示意图：,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,1.,散射光信号,：散射光分为前向角散射,(FSC,，,Forward Scatter),和侧向角散射,(SSC,，,Side Scatter),，散射光不依赖任何细胞样品的制备技术,(,如染色,),，因此被称为细胞的物理参数（或称固有参数）。,(1),前向角散射,：,代表细胞体积大小，,前向角散射与被测细胞的大小有关，确切说与细胞直径的平方密切相关，通常在,FCM,应用中，选取,FSC,作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。,(2),侧向角散射,：,代表细胞内容物多少（或称为密度），,侧向角散射是指与激光束正交,90,0,方向的散射光信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。,2.,荧光信号：,当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析就能了解所研究细胞参数的存在与定量。,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,光电倍增管如何产生电压脉冲信号,电压脉冲,激光,激光,激光,t,t,t,电压脉冲,电压脉冲,1.,2.,3.,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,高度、宽度和面积,时间,(s),电压,脉冲面积,(A),脉冲高度,(H),脉冲宽度,(W),40,0,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,脉冲信号的宽度和面积通常用来辨别双粘体细胞,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,阈 值,阈值用来定义能够被光电倍增管识别的最小或最大信号强度，低于阈值下限或高于阈值上限的信号将不被光电倍增管识别，也不在图形中显示。,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,荧光信号的线性测量和对数测量,线性放大：,即放大器的输出与输入是线性关系，细胞,DNA,含量、,RNA,含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。,对数放大：,即放大器的输出成,10,倍关系，如果原来输出是,1,，当输入增大到原来,10,倍时，输出为,2,；当输入增大到原来,100,倍时输出是,3,等等。,在免疫学样品中，细胞膜表面抗原的分布有时要差几十倍甚至几万倍。如果用线性放大将无法在一张图上清晰地将细胞阳性群、阴性群同时显示出来。,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,流式细胞仪数据格式,FCS,：帧校验序列（,FCS,）字段，通常为,16,位（,2,个字节长），也可以为,4,个字节。软件执行中可以通过预先协议采用,32,位,FCS,来提高差错检测效果。,FCS 1.0,研发于,1984,年,FCS 2.0,研发于,1990,年，兼容,1.0,格式,FCS 3.0,研发于,1997,年，兼容前两者,支持,UNICODE,文本,处理单个数据文件大于,100MB,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,FCS,文件结构,存储于,3,或,4,个片段中,文件头信息：用于鉴别,FCS,文件，包含鉴别文本文件片段的数值。,文本信息：描述样品信息和状态的某些数值。,数据：在文本信息中存储的数值的特殊格式。,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,文件头信息：,文本信息：,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,参 数,FSC/SSC/,荧光：,第一个细胞,第二个细胞,最后一个细胞,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,数据显示的种类,直方图 散点图 三维图,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,直方图,（用于单参数分析）,横坐标，,X,轴,表示光强度，强度高的光信号靠右侧显示。,纵坐标，,Y,轴,表示数量累计，相同强度的光信号在同一横坐标点（通道）内向,Y,轴方向累计。,FITC,FITC,FITC,FITC,FITC,FITC,FITC,FITC,FL1-FITC,FITC,FITC,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,散点图,（用于双参数分析）,横坐标，,X,轴,表示光强度，强度高的光信号靠右侧显示。,纵坐标，,Y,轴,表示光强度，强度高的光信号靠上侧显示。,与,X,轴,/Y,轴平面,90,0,垂直相交，,Z,轴,表示数量累计，相同强度的光信号在同一横,/,纵坐标点（,X/Y,轴通道）内向,Z,轴方向累计。,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,什么是,Region,？,用户在显示的图形中限定一个区域或范围作为靶区域或范围叫做,Region,。,在同一张图中可以设置多个,Region,。,使感兴趣的簇独立。,对,Region,使用颜色可更好地描述该范围或区域。,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,什么是,Gate,？,1.,使用布尔数学体系的操作方法（逻辑学）定义一个或将多个,Region,进行联合叫做,Gate,。,2.,被定义的子集数据将被显示。,3.,被选定的子集将被计算机计算数据和显示状态。,4.,解除噪音信号并可以最终被存储在硬盘上。,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,什么是,Mean,？,1.,算术定义的平均值。,2.,几何定义的平均值。,假设样品为,V,，数量为,n,，则：,算术定义的平均值,=,（,V,1,+V,2,+V,3,+V,n,)/n,几何定义的平均值,=,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,如何取平均值？,线性放大 对数放大 对数放大,算术平均值 算术平均值 几何平均值,（,4*64+6*128+2*192+1*256,）,/13,（,4*10+6*100+2*1000+1*10000,）,/13,=128 =972.3 =100,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,光谱交叉重叠与补偿？,当一种激光束激发两种荧光染料而发射出两种不同波长的荧光时，这两种发射光会出现光谱部分重叠的现象，从而造成检测的准确性下降，必须使用适当的滤片或进行电子补偿来尽量减少光重叠对,实验的影响。,FL-1,PMT,FL-2,PMT,FL-1 -%FL-2,FL-2-%FL-1,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,未做补偿,R4/R1=41%R3/R1=24.21%R2/R1=34.3%,做补偿后,R4/R1=41.04%R3/R1=24.75%R2/R1=34.22%,补偿，我们通常按照细胞聚集区的中心点来计算，但实际的原理是按细胞团的位置来定的，也就是纯粹按照计算得出的，比如上图的,R4,细胞团，它在,X,轴上的位置是,0.3,到,1,之间，在,Y,轴的位置是,2,到,6,之间，这团细胞平均值在,FL1,FL2,中的分部坐标为,0.68,3.9;,因此斜率为,0.68/3.9=17.43,，因此,FL1,的补偿后平均值为,FL1-17.43%FL2=0.68-17.43%*3.9=0.0023,，它的右侧区域应该在,1-17.43%*3.9=0.32,，左侧区域应该在,0.3-17.43%*3.9=-3.79,，因为是负数，就自动归为,0.1,了，如果是完全按照计算来做补偿，图形将很大一部分跑出了双参数图，也就是说无法得到我们满意的图形，但由于我们勾选了“,Random Bias”,，所有的图形将重新被分配，就像上图的,Q1,门中的显示一样。，我们通常按照细胞聚集区的中心点来计算，但实际的原理是按细胞团的平均值来计算。,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,FL1-,未染色,FL2-,未染色,FL1-,染色,FL2-,未染色,FL1-FITC CD3,补偿后,平均值,=2.0,FL1-,染色,FL2-,未染色,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,上机检测,样本染色及溶血过程处理完后应立即上机检测,打开流式细胞仪,(,选择进行质控程序）,打开应用软件并选择相应的方案或新建方案,加载或重新调节各参数,上样检测,流式细胞仪使用一般方法及技巧,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,技巧一：定位目标细胞群体,寻找细胞群：如标本为外周血白细胞，在,FSC/SSC,散点图中信号最强的为粒细胞，依次为单核、淋巴、红细胞碎片。如寻找淋巴细胞，可首先调低,FSC/SSC,电压定位粒细胞后逐步调高电压依次寻找各细胞群。,如标本中无明显特征细胞群，可使用已建淋巴细胞检测方案根据相对位置定位目标细胞群,流式细胞仪使用一般方法及技巧,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,技巧二：阴性或阳性对照,阴性对照作用：调节,PMT,电压；设立阴、阳性界线,使用抗体相应同型荧光免疫球蛋白作为阴性对照，注对照及抗体需出自同一厂家（检测一过性样本中的某些指标）,使用对照组样本作阴性对照（与其他实验中对照组含意相同，但此时仍需使阴性对照初始化仪器）,对与非抗体染色，如各类核酸染料或探针：,PI,、,ANNEXIN-V,。使用空白标本作为阴性对照，或设立阳性对照。,流式细胞仪使用一般方法及技巧,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,技巧三：检测指标,检测前要清楚地知道：除阳性百分比指标外，还有荧光强度指标。后者往往比前者更有意义,检测时，灵活应用放大模式：线性或对数（如指标相差不大，使用线性放大，如：,SSC,、,FSC,；一般荧光参数使用对数放大）,灵活运用设门（,Region,和,Gate,）的逻辑关系及颜色示踪功能，可使检测结果更为明了,合理选择不同的荧光素标记试剂，以最少的投入获取最多的信息,流式细胞仪使用一般方法及技巧,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,例：检测正常成人外周血淋巴细胞,CD4/CD8/CD3,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,复杂方案分析,了解流式仪胞仪各参数的意义,熟悉设门操作,开扩思路，灵活设计各种检测方案,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,www.,www.,partec.de,我,们,的,网,站,Partec-Excellence in Flow Cytometry,超过,41,年的研发经验,谢谢大家！,