荧光定量PCR.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,北京康为世纪生物科技有限公司,实时荧光定量,PCR,Real Time Quantitative PCR,内 容,miRNA,的特点及检测,荧光定量,PCR,检测,microRNA,长度,2024nt,单链小分子,RNA,与目标基因,3,端非编码区的识别位点相结合,导致目标基因,mRNA,分子稳定性下降，半衰期变短，或,mRNA,分子结构变化（,5,脱帽），从而表达水平下降。,3,AAAAAAAA,5cap,miRNA,作用靶点,编码区,mRNA,microRNA,分子功能,microRNA,的来源,miRNA,前体与成熟体,靶点识别,不严格互补配对,一个,miRNA,可调节多个基因,一个基因可受多个,miRNA,调控,60%,人类蛋白基因受,miRNA,调控,miRNA,与,siRNA,的异同,分子形式无区别，都是由,Dicer,产生的,22nt,小分子,分子功能近似，都导致目标基因表达水平下降，但通常,siRNA,效果更剧烈,产生来源不同,miRNA,有其基因，内源性表达,siRNA,多数情况下为人工外源导入,miRNA,siRNA,miRNA,与,siRNA,的异同,miRNA,检测与定量,经典方法,:,放射标记,Northern,杂交,miRNA,芯片,基因表达谱,基本原理：某物种全部已知,miRNA,集中于一张芯片，点杂交检测各,miRNA,丰度,所回答的问题：哪些,miRNA,是你所应该关注的,优点：高通量，全景观察,缺点：敏感度、特异性均有限，适用于初筛,需后续验证：荧光定量,PCR,Pre-,miRNA,检测,必要性：,不排除,miRNA,从前体到,成熟体，从核内转运到,核外的过程中存在调控,机制的可能。,Specific,miRNA,quantification by real time PCR way to go,关键难点,丰度低,解决办法,:,小,RNA,提取,太短,解决办法,:,加长,序列高度相似,miRNA,之间难以区分,解决办法,:,特殊设计的检测方法；小心设计引物与反应优化,解决,miRNA,丰度难题,基本原理,影响,RNA,分子与硅胶柱结合的因素,离液剂,chaotropic,agent,，如盐酸胍,离子强度，如,NaCl,小分子有机溶剂，如乙醇,精心调整各组份配比，达成大、小,RNA,与,硅胶柱结合的区分条件，分离去除大分子量,RNA,，富集小分子量,RNA,小,RNA,提取,M 1 2 3,M,：,Marker,#1,：康为柱式分离的小片段,RNA,#2,：康为柱式分离的总,RNA,#3,：沉淀法得到的总,RNA,提取小分子量,RNA,成熟,miRNA,qPCR,检测,-,Poly(A,),加尾法,优点：,简单直接，高效。一次逆转,录获得的,cDNA,可用于多个,目标分子的检测。,成熟,miRNA,qPCR,检测,茎环法,优点：特异引物逆转录，理论上效率更高，检测更灵敏,缺点：茎环引物设计复杂；特异引物逆转录不便多基因检测,检测方法选择,依样本特性，检测目标多寡而定,康为技术服务经验举例：,复旦大学某客户,miRNA,芯片提示,10,个,miRNA,在病人与正常人之间有显著差异表达,要求从,66,个外周血,RNA,样本中检测这,10,个,miRNA,加尾法，,5,个目标获得良好检测,茎环法，,4,个目标获得良好检测,1,个目标的检测很难，尝试多种引物设计，调整反应体系,康为,miRNA,产品,小,RNA,提取试剂盒,加尾法,miRNA,cDNA,第一链合成试剂盒,miRNA,荧光定量,PCR,检测试剂盒,CW0627,CW2141,CW2142,康为,miRNA,检测服务,全套,miRNA,检测：从生物样本到数据,茎环法,miRNA,检测引物：定制,(Real time Quantitative PCR),miRNA,的特点及检测,荧光定量,PCR,检测,内 容,PCR,：伟大的天才发明,Use of LSD,Synthesis and,self-testing of novel psychoactive substances,Belief in astrology,PCR,：理想与现实,起点定量,终点定量,起点定量检测,：,-,起点量是样本中未经,PCR,放大,之前的模板量,-,具有重现性，误差小,-,“,加入了,500,个拷贝,”,终点定量检测,：,-,终点产物量经过,PCR,放大的,DNA,量,-,不恒定，误差大,-,“,生成了,500,，,0000,，,0000,个拷贝,”,扩增曲线,-Ct,值：,模板,DNA,量越多，,荧光强度达到检测域值所需的循环数,越少，,即,Ct,值越小。,确定模板初始数量？,Real-time PCR:,检测原理,非特异性荧光标记：,SYBR Green I,特异性荧光标记：,水解探针：,TaqMan,非水解探针：,Molecular beacon,R,Q,Reporter,Quencher,R,Q,5,3,5,3,SG,SG,SG,SG,5,3,5,3,SG,SG,SG,SG,Emission,Excitation,SYBR Green I,是一种与双链,DNA,小沟结合的荧光染料。,SYBR Green I,只与双链,DNA,结合才能发出荧光。,荧光信号的强度与反应体系中所有双链,DNA,分子成正比。,SYBR Green I,工作原理,Taqman,工作原理,在退火过程中，探针与靶序列结合,探针被,Taq,酶的,5,-3,外切酶活性剪切成片断,游离报告基团发出荧光,在延伸过程中，探针部分与靶序列分离,荧光信号强度与结合探针的,DNA,分子成正比。,染料法与探针法 对比,探针法,特异性高,-,与探针与特异靶序列结合,对模板有选择性,-,可进行多重,PCR,反应,成本高,-,不同靶基因需要合成不同探针,染料法,通用性好,-,对,DNA,模板没有选择性,使用方便，成本低,-,仅需设计两个引物,有假阳性现象,-,通过融解曲线判断,Real-time PCR,应用,基因表达分析,-,相对定量：,基因表达量的差异,-,绝对定量：,样本中核酸的量（拷贝数、微克）,基因型分析,-SNP,检测 等位基因检测 甲基化检测,基因表达分析检测,test sample,处理样本,target gene,目的基因,reference gene,内参基因,total RNA,cDNA,calibrator sample,对照样本,target gene,目的基因,reference gene,内参基因,qPCR,以各自样本中内参基因为标杆，,比较两样本中目的基因的相对丰度。,数据分析,qPCR,cDNA,total RNA,内参基因的选择,特点,选择内参基因,内参基因,beta-,actin,、,GAPDH,、,18S,rRNA,、,28S,rRNA,等,-,文献检索,-,实验筛选,选择多个备选内参基因，以备选内参基因的几何平均数作为均一化标准,内参基因,Housekeeping Gene,-RNA,抽提、反转录为,cDNA,的效率不同，用于定量分析的样本初始浓度不同。,对样本初始浓度差异进行均一化校正。,不同环境，不同器官、组织、细胞类型之间，表达量相对恒定。,Housekeeping Gene,康为产品,不同丰度：,高丰度,ACTB,、,GAPDH,中等丰度,beta2M,低丰度,HPRT1,不同物种：,人、大鼠、小鼠、猪、牛、羊、鸡、斑马鱼、甘蔗 等,基因表达分析检测,样本处理与,RNA,提取,cDNA,qPCR,内参基因,(housekeeping gene),选择,样本处理与,RNA,提取,外界刺激,10,分钟,可检测的表达改变,样品离开定义环境,2,分钟内,固定、裂解细胞,RNA,样本保存液,Trizol,超纯,RNA,提取试剂盒,RNA,的评价与鉴定,-,完整性,-,纯度,小心,DNA,污染！,-,使用,DNase,-,引物设计,-,以,RNA,作,PCR,阴性对照,CW0580,CW0592,CW0581,CW2090A,RT-,qPCR,一步法还是两步法？,两步法：,步骤多但灵活多样。,cDNA,可长期保留，检测多个基因，便于反应条件的优化。,推荐：工作的初期阶段，以及单个样本多个靶基因检测。,一步法：,简单、灵敏度高，有效减少实验操作误差和污染。每次只能做一个基因。,推荐：工作的成熟阶段，以及多个样本单个靶基因检测。,逆转录,逆转录引物选择,下游应用：是否检测其它基因？,Abundant RNA,的干扰：,mRNA or total RNA,？,检测灵敏度是否足够？,逆转录酶,SuperRT,逆转录酶（,RNase,H,-,）,HiFi,-MMLV,逆转录酶（,RNase,H,-,）,引物,特异性,反应效率,Oligo,dT,中,低,Random,hexmer,低,中,Specific primer,高,高,CW0741,CW0743,总原则与普通,PCR,相同：,避免引物二聚体，避免二级结构,扩增片段长度（,80,300,bp,),推荐做跨,intron,设计,引物设计原则,EXON 1,EXON 2,INTRON 2,DNA,EXON 1,EXON 2,RNA,反应条件优化,内参基因,目的基因,-,融解曲线：,单一特异性产物,-,扩增曲线：,Ct,值,-,标准曲线：,扩增效率尽量高，目的基因,尽可能接近内参基因,反应条件优化,融解曲线分析,-,单一特异性产物,将温度对荧光强度的变化求导,图,2,Effciency,slope,内参基因,100%,-3.32,目的基因,Primer 2,78%,-4.00,图,1,Effciency,slope,内参基因,100%,-3.32,目的基因,Primer 1,95.36%,-3.43,标准曲线分析,-,扩增效率尽量高,-,目的基因尽可能接近内参基因,10%,以内,反应条件优化,反应条件优化,扩增曲线分析,-Ct,值,Master Mix,的应用,-,热启动酶,化学修饰，,常温下完全没有聚合酶活性，热复活需,95,10,分钟,-,GoldStar,、,HotStar,非化学修饰,（,Oligo,修饰、抗体修饰、,Mg,2+,螯合物）,热复活仅需,95,几十秒,-,FastStar,-Buffer,反应增强剂,-,减少引物二聚体，进一步提高反应特异性,-,对于复杂模板，提高反应效率,稳定剂,-,dNTP,Master Mix,的应用,ROX Passive Reference,不参与、不干扰,PCR,反应,恒定发射荧光信号,用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致的系统误差。,需参照仪器要求选择。,误差控制,使用,Master mix,配置预混体系,设置生物学重复,（不同个体）,技术性重复（复孔）,阴性对照,荧光定量,PCR,体系,2,-,Ct,法,满足条件：,1,）内参基因和目标基因的扩增效率接近,-,正负,10%,2,）内参基因和目标基因的扩增效率基本为,90%-110%,相对定量数据分析,1,、目标基因的,CT,值,-,内参基因的,CT,值,2,、待测样本的,CT,值,-,对照样本的,CT,值,3,、计算表达水平比率：,2,CT,=,表达量的比值,2,-Ct,法,目的,基因,内参,基因,目的基因,-,内参基因,Ct,待测样本,-,对照样本,Ct,倍数值,fold,2,-Ct,对照样本,30.485,23.625,6.86,0,1,待测样本,27.025,22.66,4.365,-2.495,5.63728,Trouble shooting,常见问题,可能原因,解决方法,Housekeeping gene,无信号,RNA,降解,用新鲜组织提取,RNA,Housekeeping gene,有信号,而目标基因无信号,1.,目的基因表达低。,逆转录效率不高,2.PCR,引物不良,1.,富集,mRNA,2.,在逆转录中尝试不同引物，如特异引物。,3.,尝试不同,PCR,引物。减小产物大小，改换目标,区段，考虑不同剪接体。,4.,尝试不同热循程序，降低复性温度。,Housekeeping gene,反应效率正常,但,目标基因放大效率不高,PCR,引物不良,重新设计引物，减小产物大小，改换目标区段，,考虑不同剪接体,目标基因表达丰度在,样本之间异常一致,RNA,被基因组,DNA,污染,使用跨,intron,引物,用,DNase,处理,RNA,确保,RNA,阴性对照表现阴性,溶解曲线出现杂峰,出现非特异,PCR,产物,出现引物二聚体,尝试不同,PCR,引物,尝试不同热循程序，升高复性温度,修改仪器设置，将检测温度设定在在引物二聚体解链温度与,PCR,特异产物解链温度之间。,阴性对照在,30,个循环,以内出现信号,试剂被污染,注意区分信号是来自引物二聚体还是,PCR,产物,查找，替换污染试剂,2.,使用,UNG,系统。,荧光定量产品,-,染料法,FastSYBR,Mixture,UltraSYBR,Mixture,GoldStar,Taq,特异性强,灵敏度高,Ct,值更低,线性范围更广,定量更准确,反应速度快,比普通反应可节省约,40,分钟,适合于普通和快速定量,PCR,程序,荧光定量产品,-,染料法,某其它品牌,康为,UltraSYBR,-,cDNA,用内参,actin,引物进行扩增，产物片段,100bp,。,-,模板浓度进行,10,倍稀释，稀释,6,个梯度。,康为世纪产品,RNA,-,Trizol,-,超纯,RNA,提取试剂盒,-,动物组织,RNA -,植物,RNA -,血液,RNA-,病毒,RNA,逆转录,-,SuperRT,/,HiFi,-MMLV,逆转录酶,-,cDNA,第一链合成试剂盒,-RT-PCR,一步法、两步法试剂盒,荧光定量,PCR,-,UltraSYBR,Mixture -,FastSYBR,Mixture,-,GoldStar,Taqman,Mixture,PCR,-,GoldStar,DNA Polymerase,-,Taq,/Es,Taq,DNA Polymerase -,Taq,/Es,Taq,Master Mix,