诱导多能干细胞（iPSC）产业现状与未来发展蓝皮书.pdf

1 1诱导多能干细胞（iPSC）产业现状与未来发展蓝皮书2 2摘要自2006年山中伸弥课题组首次使用逆转录病毒载体将4个转录因子导入小鼠成纤维细胞中，将其重编程为具有人胚干细胞特性的多能性细胞，即诱导多能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells,iPSC），使iPSC研究迈入新纪元。随着多年来技术不断发展，iPSC在科研及细胞治疗等医学领域的应用价值逐渐突显，成为资本青睐的新兴赛道。沙利文谨此发布诱导多能干细胞（iPSC)产业现状与未来发展蓝皮书。本研究报告旨在对iPSC领域进行深入分析，从技术发展、应用领域、开发现状、临床进展、患者需求、资本热度、行业格局等多维度进行全面阐述，追踪行业和技术发展脉络，挖掘行业发展潜力，分析市场发展背后的驱动因素。iPSC技术发展迅速在短短不足20年的时间里，iPSC技术快速发展，吸引了全球众多公司部署该领域，多款基于iPSC技术的细胞治疗产品进入临床试验阶段。目前，iPSC重编程技术日趋成熟，并与CRISPR基因编辑、人工智能等新技术快速融合发展，有力推动了iPSC的产业化进程。虽然，目前iPSC细胞治疗产品仍存在分化潜能不足、具有成瘤性风险等问题，但随着对iPSC领域深入研究，工艺流程趋于完善，iPSC产业转化将加速。iPSC可解决众多未满足的临床需求作为人口大国，中国拥有庞大的心血管及肿瘤患者人群，加之诸如帕金森病、年龄相关性黄斑变性、型糖尿病等非肿瘤性疾病尚无治愈方法，存在大量未被满足的临床需求，亟待新兴治疗思路。以CAR-T为代表的细胞免疫疗法在肿瘤治疗领域已表现出优异的治疗效果，实现商业化，为细胞治疗的发展奠定了重要基础。iPSC可衍生为各种成体细胞及组织的潜能使其可以应用于多个疾病领域，有望解决众多复杂难治性疾病的临床需求。iPSC具有广阔的市场前景iPSC具有多向分化和强大自我复制的潜能，适用于大规模培养，批次间特性相对稳定；iPSC可以来源于患者身体，故可减小免疫排斥问题，并避免了伦理问题。基于iPSC的特点，其在疾病研究、药物筛选、细胞治疗等领域具有巨大价值。近年来，iPSC技术受到了资本市场的青睐，多家iPSC研发企业获得了多项融资支持，大型MNC企业也积极布局iPSC治疗领域，iPSC未来大有可为。3 3第一章 iPSC概览iPSC的定义及优势-06iPSC的发展历程-07iPSC的潜在应用领域-08第二章 iPSC制备流程及相关技术iPSC的制备-10iPSC制备的关键因素-11iPSC转录因子的筛选及分析-12iPSC重编程方法-13iPSC重编程方法比较-16iPSC技术瓶颈分析-17新技术在iPSC的应用-18第三章 iPSC的监管机制美国干细胞监管现状-20欧盟细胞疗法监管体系-21日本干细胞监管现状-22中国细胞监管发展历程-23第四章 iPSC研发现状与市场潜力全球与中国iPSC在研情况分析-26iPSC在研管线-28iPSC在肿瘤治疗领域应用-29iPSC在眼科治疗领域应用-30iPSC在神经系统治疗领域应用-31iPSC在心血管治疗领域应用-32iPSC在免疫系统治疗领域应用-33目录4 4iPSC市场驱动力分析-34iPSC未来发展趋势分析-35第五章 iPSC公司资本市场表现iPSC细胞治疗公司融资情况分析海外-37iPSC细胞治疗公司融资情况分析中国-39企业iPSC合作开发情况-41iPSC细胞治疗领域收并购事件分析-42第六章 iPSC领域公司介绍艾尔普再生医学-44艾凯生物-46士泽生物-48星奕昂生物-50血霁生物-52泽辉生物-54中源协和-56昂朴生物-58霍德生物-60启函生物-60睿健医药-61瑞臻再生医学-61赛元生物-62中盛溯源-62法律声明-63联系我们-64目录5 501第一章iPSC概览诱导多能干细胞（iPSC）产业现状与未来发展蓝皮书Market Report on Current Perspective and Future Development of Induced Pluripotent Stem Cells(iPSC)6 6iPSC的定义及优势iPSC的定义诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）是指通过人工对体细胞进行重编程，逆分化培养出的一类具有类似人胚干细胞特征的多能干细胞。iPSC具有多向分化和强大自我复制潜能，在一定条件下可以分化成多种功能细胞，且可以在体外培养获得数百万甚至数十亿的临床相关表型细胞，如心肌细胞、神经元细胞、胰岛细胞等，在临床治疗、药物研发、医疗美容等多个领域具有广阔的应用前景。资料来源：公开资料，沙利文分析iPSC的优势iPSC与人胚干细胞类似，可以在体外无限复制，适用于大规模培养；iPSC可根据需求诱导分化成需要的细胞株，批次间特性相对稳定，可避免临床疗效不一致情况的发生；iPSC可以来源于患者自身，故可减小免疫排斥问题；由于iPSC的细胞来源是成体细胞，避免了伦理问题。iPSC拥有干细胞在体外适宜条件下无限复制的能力，细胞株数量不受限且一致性较高理论上，iPSC携带了全套人类基因，拥有分化为各种组织细胞的潜能iPSC使用患者自己细胞，无需从胚胎提取，来源便捷，避开了伦理道德制约iPSC可来源于患者自身体细胞，可有效避免异体移植免疫排斥带来的风险体外无限复制体外无限复制分化潜能强大分化潜能强大免疫排斥小免疫排斥小避免伦理问题避免伦理问题心肌细胞神经细胞T细胞成骨细胞细胞回输体细胞iPSC细胞衍生分化重编程图 1：iPSC治疗示意图图 2：iPSC的优势7 7iPSC的发展历程发展历程资料来源：公开资料，沙利文分析2008200620182019首次报道诱导产生iPSC：日本京都大学山中伸弥教授团队在Cell杂志上率先报道成功诱导小鼠成纤维细胞为多能干细胞。山中伸弥教授团队通过将Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4四种转录因子借助病毒载体引入小鼠成纤维细胞，在人胚干细胞培养条件下，发现可诱导其转化为一种具有干细胞特征的新细胞，即诱导多能干细胞（iPSC）。去掉c-Myc转录因子仍可诱导iPSC：转录因子c-Myc 是一种原癌基因，诱导产生的iPSC具有肿瘤分化倾向。Nakagawa 等人证实去掉 c-Myc 因子，只用Oct4，Sox2 和 Klf4这3个转录因子也可成功诱导 iPSC。2013首例iPSC治疗试验成功实施：日本RIKEN发育生物学中心的Masayo Takahashi教授团队将iPSC定向诱导为视网膜色素上皮细胞，成功治疗了一名年龄相关性黄斑变性患者，成为历史上第一个将iPSC移植到人体中的细胞治疗。2016首个同种异体iPSC衍生细胞产品获批临床试验：Cynata Therapeutics公司获准开展同种异体iPSC衍生的间充质干细胞（MSC）产品 CYP-001治疗类固醇抗性急性移植物抗宿主病（GVHD）的首个临床试验。iPSC技术在血液系统、神经系统等领域的IIT研究陆续开展：京都大学Eto Koji教授获批使用患者来源的iPSC衍生的血小板进行输注治疗再生障碍性贫血患者。美国的科学家Kwang-Soo Kim团队将iPSC定向诱导为多巴胺能神经元并成功移植到脑部治疗帕金森病，显著改善了其运动症状。京都大学医院的神经外科医生Takayuki Kikuchi在帕金森病患者中，成功移植同种异体iPSC衍生的多巴胺前体细胞。iPSC产业化技术加速储备：Gandhi 等人发现人纤维蛋白原在 iPSC二维和三维分化上可将效率提高 37%。Gagliano 等人使用微流体技术成功地使数百个细胞同时重编程，与传统标准多孔培养相比，可使原料成本降低约100 倍。2017iPSC诱导技术持续发展：Kim 等发现机械牵张刺激成功使体细胞重编程为 iPSC。美国国立人类基因组研究所证实 iPSC的多数突变来自亲代成纤维细胞中罕见遗传突变，细胞重编程过程不会增加遗传突变发生的概率。北京大学与美国 Salk 生物学研究所首次构建出潜能扩展的多能干细胞，获得的细胞同时具有胚内和胚外组织发育潜能。Scripps 研究所开发出一种利用抗体诱导成体细胞重编程为多能干细胞的新方法，避免了转录因子引入的潜在风险。2021首个iPSC-CAR-T细胞疗法的首例患者给药完成：Fate Therapeutics在研产品FT-819完成首例患者给药。FT-819是由iPSC衍生的、靶向CD19+恶性肿瘤的嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法。2022人源iPSC突变图谱绘制完成：剑桥大学Serena Nik-Zainal研究团队在Nature Genetics杂志发表文章，利用大样本测序数据较为全面地绘制了人源iPSC的突变图谱。2020Nature报告iPSC治疗心衰案例：Nature全球独家报道南京鼓楼医院联合艾尔普再生医学完成的世界首个iPSC技术治疗心力衰竭临床一周年随访案例。2023iPSC治疗晚期心衰临床试验顺利开展：Heartseed与诺和诺德宣布心衰iPSC新药HS-001的I/II期临床试验完成首例晚期心衰患者给药。8 8iPSC的潜在应用领域iPSC的应用iPSC作为一种新兴技术，目前产业化应用尚处于早期发展阶段，但iPSC在临床上已有多种应用尝试，涉及的应用领域主要包括疾病研究、药物筛选、细胞治疗等。将体细胞重编程为具有人胚干细胞特性的诱导多能干细胞（iPSC），在科研及治疗等领域均有重大意义iPSC开辟了多能干细胞研究及治疗的新领域iPSC技术的出现推动了多能干细胞治疗研发领域的发展。iPSC的细胞来源为人类体细胞，取材方便且避免伦理问题。同时，iPSC可使用患者体细胞诱导产生，在后续的移植治疗中发生免疫排斥的几率大幅减小，安全性更高。全球已有多款iPSC细胞治疗产品处于临床研究阶段，最快研发阶段为临床III期，iPSC逐步成为细胞治疗领域的重要临床研发方向。iPSC技术的出现促进再生医学蓬勃发展iPSC携带了人类全套基因，具有分化为各种人体细胞的潜能，在相关诱导技术成培养条件成熟后，iPSC可根据需求分化为相应的细胞、类器官、器官等，可为再生医学相关活动开展提供重要的材料来源。目前，全球多个基于iPSC的再生医学临床试验正在进展中，如应用iPSC技术生成角膜细胞组织来治疗角膜缘干细胞缺乏症、诱导生成神经祖细胞治疗脊髓损伤等。iPSC相关新技术、新专利层出不穷，iPSC将成为再生医学领域的重要组成部分。iPSC的应用疾病研究药物筛选细胞治疗iPSC可以在体外被诱导分化和扩增培养为几乎所有种类的细胞，如心肌细胞，移植给心衰患者后可修复或重建正常组织，以达到治疗疾病的目的。iPSC技术可以将患者的体细胞重编程为患者特异性的iPSC，进一步诱导分化为疾病相关细胞类型，从而构建体外疾病模型。iPSC可应用于药物有效化合物筛选和药物毒性验证。借助于iPSC构建的疾病模型，药物筛选可获得更接近于临床试验的药物数据。资料来源：公开资料，沙利文分析图 3：iPSC的应用领域9 902第二章iPSC制备流程及相关技术诱导多能干细胞（iPSC）产业现状与未来发展蓝皮书Market Report on Current Perspective and Future Development of Induced Pluripotent Stem Cells(iPSC)1010iPSC的制备经过长期发展，重编程方法优化不断取得突破，使iPSC逐渐从实验室走向病床旁，逐实现转化医学的顺利过渡iPSC制备简介制备iPSC主要涉及体细胞分离与培养介导载体的构建诱导因子的导入及细胞培养iPSC的筛选及鉴定四个主要步骤。资料来源：文献检索，沙利文分析体细胞重编程过程人体体细胞重编程为iPSC大约需要2周时间，具体过程可以分为早期、过渡期和晚期三个阶段。早期阶段即基因激活阶段，由“first-wave”基因驱动，涉及外源性转录因子导入体细胞、基因表达启动、重编程或凋亡程序激活。过渡阶段会激活分化相关基因的表达，同时促进糖酵解，但只有小部分细胞会激活晚期阶段的标志基因从而启动晚期阶段。晚期阶段被激活的基因被称为“second-wave”基因，Sox2、Klf4和Oct4（SKO）驱动，其中Sox2的激活会引发一系列细胞信号反应，最终使体细胞重编程为iPSC。早期过渡期晚期特征First-wave基因激活Second-wave基因激活糖酵解基因表达6mm的皮肤组织感染培养扩增筛选扩增图 4：由皮肤成纤维细胞制备iPSC过程皮肤成纤维细胞穿刺取样逆转录病毒介导转录因子Oct4C-MycSox2Klf4hES培养基iPSC集落出现接种iPSC培养Source:Park IH,Lerou PH,Zhao R,Huo H,Daley GQ.Generation of human-induced pluripotent stem cells.Nat Protoc.2008;3(7):1180-6.doi:10.1038/nprot.2008.92.PMID:18600223.图 5：体细胞重编程阶段概览1111理论上，携带人类全套基因组信息的细胞均可作为制备iPSC的原料细胞，材料来源十分广阔。但在实际应用中，不同组织器官来源或不同发育程度的细胞诱导产生的iPSC在效率和安全性上具有较大的差别，应根据后续研究或治疗的需求应选择适合的iPSC原料细胞。目前，iPSC领域多选择便于获取的细胞，如血细胞、皮肤成纤维细胞、尿液细胞等，作为原料细胞。最初，山中伸弥教授团队用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4成功诱导小鼠成纤维细胞恢复多能性状态，但c-Myc是一种原癌基因，具有潜在成瘤风险。Nakagawa等人尝试去掉c-Myc 因子，只用Oct4，Sox2和Klf4这3个转录因子进行iPSC诱导并获得成功，证实了c-Myc不是iPSC逆转化必需的因子，同年Kim等人仅用Oct4、Klf4成功地使神经干细胞实现逆转。随着对iPSC研究的持续深入，Tert、Nanog、Lin28、SV40 large T-antigen等更多基因被发现可以用于iPSC的诱导，可供iPSC诱导选择的转录因子库持续丰富。大分子外源物质进入细胞通常需借助物理或生物学方法，其中病毒介导是一种十分有效的生物学手段，其他介导载体还包括质粒、转座子、RNA、蛋白等。现有的重编程方法根据外源基因是否整合进宿主细胞和是否由病毒作为载体可分为四种：整合病毒载体转移系统、整合非病毒载体转移系统、非整合病毒载体转移系统以及非整合非病毒载体转移系统。人源iPSC通常在饲养细胞中产生和维持，但用于临床的iPSC需要无饲养层（Ff）和无异源（Xf）培养条件。常见的Ff-Xf体系iPSC培养方法包括TeSR1、E8、StemFit、rLN511E8联合StemFit等。在培养过程中，可根据需要加入相应的小分子物质以促进重编程。iPSC制备的关键因素作用于表观遗传学的小分子可以通过修饰DNA甲基化5-aza-cytidine和RG108、组蛋白乙酰化丁酸钠和trichostatin A或组蛋白甲基化Neplanocin A来提高重编程效率。此外，对小化学物质的筛选发现了能够促进或取代重编程基因的化合物。例如，8-br-cAMPcAMP依赖的蛋白激酶激活剂，可促进人成纤维细胞重编程。转化生长因子(TGF)-1型受体抑制剂ALK5可以通过激活Nanog表达来促进iPSC重编程而不是Sox2。iPSC制备关键因素iPSC的制备受多种因素影响，其中体细胞的选择、介导因子和介导载体的选择及优化、iPSC细胞培养、iPSC筛选鉴定、重编程效率等均为影响制备的关键因素。体细胞选择应考虑后续治疗或研究需求体细胞选择应考虑后续治疗或研究需求诱导诱导iPSCiPSC的介导因子需选择和优化的介导因子需选择和优化iPSCiPSC细胞培养需根据研究目的选择细胞培养需根据研究目的选择重编程载体选择多样重编程载体选择多样小分子化合物可提高重编程效率小分子化合物可提高重编程效率资料来源：公开资料，沙利文分析iPSC的多能性通过基因表达、畸胎瘤形成和注入囊胚后嵌合体的产生来评估。鉴定方法包括流式细胞仪、碱性磷酸酶染色、细胞增殖测定、多能性标志物表达检测、干细胞相关基因检测、细胞染色体核型分析、动物实验等。在适宜时间对在适宜时间对iPSCiPSC进行筛选和鉴定进行筛选和鉴定1234561212iPSC转录因子的筛选及分析OSKM转录因子在OSKM中，Oct3/4、Sox2和Klf4是维持干细胞多能性基因的正向调节因子，同时它们还抑制促进分化基因的表达。第四个因子c-Myc已被证明对于重编程是不必要的，但它的加入可显著提高重编程效率。在重编程过程中，c-Myc转录因子会对细胞增殖产生影响，但并不影响多能性。c-Myc转录因子在激活多能调节因子前发挥作用，作用机制为通过下调细胞识别基因并促进细胞代谢转化为一种多能干细胞。资料来源：文献检索，沙利文分析随着研究发展，更多的转录因子被发现，保证诱导效率和安全性成为转录因子选择的核心转录因子机制作用GLIS1抑制体细胞基因表达，促进糖酵解基因表达可替代c-Myc，提高效率，降低成瘤性cyclin D1调控细胞周期蛋白依赖性激酶CDKs可替代c-Myc，降低成瘤性TP53调控细胞周期的启动可替代c-MycNR5A2促进染色质开放，作为先锋转录因子启动合子基因组激活可替代Oct3/4，提高效率SALL4与Sox2共同结合于Oct3/4的启动子区域，调控其转录活性显著提高效率miR-302调控细胞周期调节因子CDKN1A和RBL2、TGF-信号负调控因子Lefty1/2、多能性因子Oct4和Sox2，帮助维持多能性提高效率miR-372调节细胞周期提高效率Suv39h表观基因组修饰因子提高效率Wrd5表观基因组修饰因子提高效率Jhdm1a表观基因组修饰因子提高效率图 6：部分其他转录因子概览Oct3/4、Sox2、NANOG和LIN28组合NANOG和LIN28的组合与Oct3/4、Sox2也可共同完成诱导过程。Oct4、Sox2 和 NANOG 位于干细胞自我更新和自身多能性的维持网络调控的中心环节，它们组成一个转录调控复合体，通过前馈系统和自身调节网络来实现对大量靶基因及其自身编码基因的转录调控。其他转录因子随着对iPSC重编程的深入研究，更多的转录因子被发现，iPSC的重编程得到不断优化。GLIS1、cyclin D1和TP53可替代c-Myc作用，解决c-Myc存在潜在成瘤性问题；NR5A2可替代Oct3/4的作用,提高重编程效率；SALL4与Sox2共同作用可调节Oct3/4转录活性，从而显著提重编程高效率。此外，miRNA或控制miRNA合成的基因miR-302,miR-372和Lin28和表观基因组修饰因子Suv39h,Wrd5和Jhdm1a也能有效地进行重编程。1313iPSC重编程方法（一）iPSC重编程方法目前，iPSC重编程方法根据是否将转录因子整合到细胞基因中，可分为整合重编程技术（慢病毒、逆转录病毒等）和非整合重编程技术（游离型载体、仙台病毒、mRNA、miRNA、蛋白质、其他小分子等）。不同重编程技术因使用的技术路线不同，在重编程效率、材料制备、递送过程及安全性等方面各具特点。资料来源：公开资料，沙利文分析逆转录病毒与慢病毒介导的整合基因组重编程法由逆转录病毒等为载体的重编程方法因将转录因子稳定整合进宿主基因中，有利于转录因子高表达和持续表达，iPSC诱导成功率更高。尽管该方法对细胞重编程相关科学研究具有重要作用，但是，因为存在重编程后转基因被重新激活的风险，该方法不适用于细胞移植等临床治疗活动。逆转录病毒（Retrovirus，RV）一种RNA病毒，可感染分裂期细胞。逆转录病毒在吸附到细胞表面后，该载体将转录因子引入受感染的细胞，并将其整合到宿主基因中。山中伸弥教授首次成功诱导iPSC使用的载体为逆转录病毒，该团队将Klf4、Oct3/4、Sox2、c-Myc这四种转录因子通过逆转录病毒整合至小鼠成纤维细胞，令其重编程，诱导成iPSC细胞。慢病毒（Lentivirus）逆转录病毒家族的一种，可以感染非分裂期的细胞。在诱导iPSC中使用慢病毒载体，可以利用分裂细胞和非分裂细胞，以实现提高重编程效率的目的，同时变异性减少。图 8：逆转录病毒或慢病毒转导OSKM因子重编程iPSC细胞Oct4C-MycSox2Klf4iPSC成纤维细胞病毒整合重编程法逆转录病毒、慢病毒等病毒非整合重编程法仙台病毒、腺病毒等非病毒整合重编程法质粒、转座子等非病毒非整合重编程法游离型质粒、RNA、蛋白等图 7：iPSC重编程方法分类1414iPSC重编程方法（二）资料来源：公开资料，沙利文分析病毒介导的非整合基因重编程法由于整合型基因重编程法存诱导生成的iPSC存在转基因重激活的风险，非整合重编程方法应运而生。非整合型重编程法的介导载体因在细胞核外复制，有效避免了转录因子的潜在成瘤性，提高了安全性。非病毒介导的整合基因组重编程法以质粒、转座子为代表的一类由DNA介导的基因重编程方法也需要将介导载体与宿主基因组进行结合才能进行iPSC诱导，是一类常用的基因重编程方法。质粒（Plasmid）是一类不能在染色体外进行自主复制的遗传单位，需要整合到宿主染色体上才能进行复制。整合型质粒具有易制备的优势，但存在诱导iPSC效率较低下且将外源性遗传信息整合进宿主染色体等问题。转座子（Transposon）是一类能在基因组上移动位置的DNA序列，可诱导iPSC的转座子包括PiggyBac转座子、Sleeping Beauty转座子等，其中PiggyBac转座子是一种常用的方法。PiggyBac转座子具有安全性高、操作方便、载体容量大、基因整合率高、精确切离等特点。PiggyBac转座子可携带目标转录因子，在催化酶转座酶的作用下整合到宿主基因中，通过“剪贴-粘贴”机制移动，在完成iPSC诱导后，可利用转座子PiggyBac编码的转座酶将外源基因准确切除，不留痕迹，使诱导多能干细胞临床应用的风险大大减小。仙台病毒（Sendai virus）一种有包膜的单链RNA分子，通过附着在多种细胞表面均存在的唾液酸来感染细胞，适用于多种类型的细胞。仙台病毒在细胞质中复制，外源基因不会被整合入宿主细胞基因中。同时，通过对仙台病毒进行删除F基因并引入温度敏感性突变进行修饰，可阻止基因传递并减少重编程载体的传播，包含在细胞质中的病毒载体最终会被稀释掉，从而留下无印迹的iPSC。腺病毒（Adenovirus）一种无包膜、有衣壳的双链DNA分子，是经典的非整合型载体。由腺病毒介导的转录因子可以在宿主细胞能瞬时表达，诱导细胞产生多潜能性，获得无病毒整合的iPSC。但是，由腺病毒介导的基因重编程效率低，产生的iPSC不能达到与临床应用相适应水平。图 9：质粒介导的OSKM因子重编程iPSC细胞图 10：PiggyBac转座子311-bp minimum 5 end3-bp gap31-bp gap235-bp minimum 3 endPiggyBac 转座子13-bp TIR19-bp sub-TIRiPSC成纤维细胞C-MycSox2Klf4Oct41515iPSC重编程方法（三）资料来源：文献检索，沙利文分析非病毒介导的非整合基因重编程法由游离型质粒、RNA、重组蛋白及化学小分子为代表的非病毒介导的非整合基因重编程法也是诱导iPSC产生的重要技术手段。1是染色体外的环形DNA分子，可用于引入和表达外源遗传物质，来自EB病毒的游离型质粒是一种常用的诱导iPSC的方法。该游离型质粒含有EBNA-1和OriP两种DNA序列，感染人细胞后表达EBNA-1蛋白，然后识别OriP序列以诱导质粒的游离扩增。OriP和EBNA-1可确保在每次细胞分裂期间重编程载体的复制和保留，从而驱动重编程基因的高表达并允许单次转染后的iPSC衍生。但由于游离型质粒是DNA分子，因而仍具有整合到宿主染色体中的可能性。游离型质粒直接导入RNA的方法也可以诱导多能干细胞。由被修饰过的核苷酸合成的RNA拥有编码重编程的因子，实践发现通过反复将这些被修饰过的RNA转入人成纤维细胞和外周血细胞，可成功诱导iPSC。RNA介导的重编程方法被认为较DNA介导的方法具有更低的致突变风险。2RNA3重组蛋白重组蛋白转录因子与细胞穿透肽融合以促进它们在细胞中的转导。2008年，Huangfu等人发现在逆转化过程中，组蛋白乙酰化后可使细胞染色体松散，从而易于与外源性转录因子结合，提高了细胞的转录活性，最终实现提高细胞重编程效率。基于该发现，研究团队通过通过联合使用Oct4、Sox2和组蛋白去乙酰化酶抑制剂，成功将人成纤维细胞逆转为iPSC。目前已发现的组蛋白去乙酰化酶抑制剂的小分子化合物包括丙戊酸（valproic acid,VPA）、苯丁酸钠（sodium phenylbutyrate,SPB）、曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA）和丁酸盐（Butyrate）。随着对iPSC重编程技术研究的深入，有科学家发现将体细胞暴露于化学小分子环境亦可使体细胞重编程为iPSC。2022年，JingyangGuan等人在Nature发表文章发现去除CHIR99021、616452、TTNPB可显著降低LIN28A活性，JNKIN8是使体细胞处于可塑状态的关键小分子，进而发现小分子具有化学协同作用，可操纵内源性细胞通路和表观遗传靶点，有效地将人类体细胞从紧密锁定的分化状态中解放出来。使用化学小分子对体细胞进行重编程具有简单、可控性高等优势。4化学小分子1616iPSC重编程方法分析比较iPSC重编程方法的比较iPSC重编程方法众多，不同方法在重编程效率、技术难度、基因组整合等方面具有差异。临床应用中应根据iPSC的目的，基于不同技术的效率和安全性选择适宜的重编程方法。资料来源：文献检索，沙利文分析类型效率高低制备难易递送难易外源基因移除难易逆转录病毒病毒仙台病毒仙台病毒病毒腺病毒病毒质粒DNA游离型质粒DNAPiggyBac转座子DNA微环DNADNA合成RNARNA重组蛋白蛋白质备注：备注：高低图 11：不同iPSC重编程方法的对比分析1717iPSC技术瓶颈分析iPSC应用场景快速发展，但保证安全、优化效率等方面仍存在瓶颈亟待突破分化效率不同于普通细胞产品的简单扩增或活化，iPSC向各类人体终端细胞的分化具有较高的技术壁垒，其对生产工艺和质量控制要求更为严格。为保障iPSC有效分化为目标细胞，需要充分把握发育生物学、目标细胞生物学特点、起始细胞质量等众多环节。运用计算机算法，可以推导iPSC从当下的转录组学和表观组学状态转变到目标细胞的状态，后续加以实验室验证，可有效改善和提高iPSC的分化效率，最终建立起GMP细胞库，为iPSC的应用提供稳定细胞供应。成瘤性iPSC的多能性能够使其分化成不同类型的人体细胞，但细胞移植后若继续过度增殖，则可能导致肿瘤形成，例如分化细胞中错误复制、转录因子在iPSC中依然保持活性、其它iPSC培养过程中基因突变等。当前丰富的遗传稳定性检测手段（如WGS、WES等）虽然为质量评价提供便利，但检测到的遗传变异所代表的生物学意义尚不清楚，生物学表征仍远落后于检出能力。ISSCR正致力于制定一套hPSC细胞系标准，包括遗传稳定性评价标准，有望在一定程度上提高本领域评价方法的严谨性和检测稳健性。异质性iPSC在培养后不同细胞系之间的形态、生长曲线、基因表达和分化等方面会有差异，出现异质性。异质性是限制iPSC从实验室到放大生产的核心阻碍，需要建立适当的质控方法。部分科研人员尝试利用生长因子与化学抑制剂组合等方式将iPSC的“启动”状态转变为“初始”状态，但技术目前仍不成熟，获得的初始iPSC可能发生过速增殖、染色体异常、印记丢失等问题。iPSC的异质性问题有待科学技术进一步发展后解决。免疫原性免疫排斥是细胞治疗的关键，这也是iPSC从实验室到临床核心壁垒之一。目前，受制备成本和临床急迫性的限制，在iPSC的应用项目中多使用异体细胞，免疫原性问题不可忽视。建立iPSC干细胞库是一种有效解决该问题的方法。人体白细胞抗原（HLA）的特异性是免疫排斥产生的主要原因，但人群种存在一类“超级供体”，其HLA基因5位点是高频单倍体纯合子，基于这些供体制备的细胞可覆盖高数量的受体人群。目前，多个国家及地区已建立了iPSC超级供体库，我国也在2018年制备完成首例由“超级供体”诱导的多能干细胞株。此外，由HLA单倍体匹配技术发展而来的HLA隐藏技术也是解决该问题的一种免疫抑制方法。HLA隐藏技术可通过删除通用组件B2M基因并引入HLA-E和B2M等基因编辑，制备适用于所有受体人群的通用细胞系。资料来源：公开资料，沙利文分析2022年，Stem Cells and Development杂志刊登一篇病例报告，云南省肿瘤医院接诊了一例在其他医疗机构接受iPSC衍生细胞治疗后出现不成熟畸胎瘤的患者。该名患者为治疗糖尿病，在左上臂三角肌接种了iPSC来源的胰岛细胞注射液，两个月后注射区出现一个肿块并伴腋窝淋巴结肿大。患者在云南省肿瘤医院影像学检查结果显示：影像学：较典型的未成熟畸胎瘤，该肿瘤具有生长速度快、局部淋巴结转移的特点；组织病理学：该肿瘤可见未成熟的内胚层、中胚层和外胚层，由骨、软骨、血管和腺样组织组成，细胞异型性较典型畸胎瘤更多；免疫荧光法检测：OCT4和SOX2染色为阳性，胰岛素染色为阴性；基因测序：存在较多错义突变，但没有观察到异常的基因重排、缺陷或拷贝数的改变。该违规iPSC治疗致瘤案例警示，应加强对iPSC临床应用的规范指导和监管，通过建立有效的定向分化方法、iPSC筛选检测方法，严格遵循质量管理标准，可降低成瘤风险。违规iPSC治疗成瘤事件1818新技术在iPSC的应用CRISPR等基因编辑技术为同种异体的“现货”iPSC提供了有利途径CRISPR技术是一种基因编辑技术，在20世纪90年代被发现，并于2012年开始逐步应用于人类生物学、农业和微生物学等领域。该技术可将目标基因序列替换为所需的供体序列，实现基因敲除或敲入基因组的目标。2019年，加州大学旧金山分校与NIH联合在Neuron杂志发表了“CRISPR Interference-Based Platform for Multimodal Genetic Screens in Human iPSC-Derived Neurons”文章，首次成功将CRISPR筛选技术与干细胞衍生细胞类型结合，系统性地改变由人类iPSC衍生的神经元的基因活性。CRISPR已成为iPSC研究的重要工具，有效提升了iPSC相关基因编辑技术，在iPSC衍生的缺失类HLA血小板、营养不良性大疱性表皮松解症、肢带性肌营养不良症2A型等领域探索应用，推动了信号通路、药物发现、药物反应、肿瘤研究、细胞治疗等研究的发展。机器学习和人工智能加速iPSC在药物筛选中的应用由iPSC构建的疾病模型可以最大程度模拟药物在人体中的表现，对药物筛选具有重要意义。应用iPSC进行药物筛查时，由于备选药物数量多、鉴定方法复杂等原因，筛选过程会产生海量数据，提高对这些数据的分析效率是推动iPSC在药物筛选领域应用及发展的重要途径。机器学习是一种通过算法解析数据、基于大数据学习、对事件进行判断和预测的技术。机器学习在药物研发领域已有众多探索和应用，包括靶标识别、生物标志物鉴定、数字病理学数据分析、小分子设计和优化等。将机器学习与iPSC结合进行药物筛选，将显著提高筛选效率，将为新药的研发开辟一条高效路径。资料来源：公开资料，沙利文分析基因组引导RNA心肌细胞神经细胞T细胞成骨细胞iPSC训练数据预测结果iPSC药物筛选历史数据模型最佳iPSC药物筛选模型算法学习药物筛选训练模型药物筛选模型评估未来iPSC药物筛选数据测试数据图 12：CRISPR基因编辑技术在iPSC领域应用图 13：机器学习在iPSC药物筛选模型中的应用191903第三章iPSC的监管机制诱导多能干细胞（iPSC）产业现状与未来发展蓝皮书Market Report on Current Perspective and Future Development of Induced Pluripotent Stem Cells(iPSC)2020美国干细胞监管现状表1：美国干细胞相关监管政策政策名称发布时间发布主体主要内容人体细胞治疗和基因治疗的考量Points to Consider(PTC)in Human Somatic Cell and Gene Therapy1991FDA首次提出使用细胞和基因治疗应思考和注意的方向人体细胞治疗和基因治疗指南Guidance for Human Somatic Cell Therapy and Gene Therapy1998FDA更新并替换了1991年的PTC，旨在为制造商提供有关生产，质量控制测试、基因治疗用重组载体和临床前试验管理方面的最新监管信息NIH人类干细胞研究指南2009NIH为NIH资助的干细胞研究提供政策依据细胞和基因治疗产品效能测试指导原则Potency Tests for Cellular and Gene Therapy Products2011FDA此指南为细胞和基因治疗产品的制造商等提供有关效能测试的建议，以支持IND或BLA申请细胞与基因治疗产品临床前评估指导原则Preclinical Assessment of Investigational Cellular and Gene Therapy Products2013FDA规定了细胞治疗与基因治疗产品都适用的临床前研究需要考虑的问题，包括临床前研究目标、对临床前研究设计的总体建议、试验动物物种选择等21世纪治愈法案21stcentury cures bill2016FDA针对再生医学先进疗法（RMAT）引入加快审批程序，对于治疗危急重病的再生医学疗法，若初步临床证据提示可解决未满足的临床需求，可获RMAT资格认定并加速审批归属“公共卫生服务法”第361条和21 CFR第1271部分监管的人类细胞、组织以及基于细胞和组织产品的偏差报告Deviation Reportingfor Human Cells,Tissues,and Cellular and Tissue-Based Products RegulatedSolely Under Section 361 of the Public Health Service Act and 21 CFR Part 1271;Guidance for Industry2017FDA该报告调查和报告了HCT/P偏差，为生产非生殖人类细胞、组织、细胞和组织产品（HCT/Ps）的机构提供指导。这些产品仅受公共卫生服务法（PHS法）第361条和联邦法规（CFR）第1271部分第21篇的规定监管，以及符合21 CFR 1271.350（b）要求的建议和相关示例。人类细胞、组织以及基于细胞和组织的产品最小操作和同源使用监管考虑Regulatory Considerations for Human Cells,Tissues,and Cellular and Tissue-Based Products:Minimal Manipulation and Homologous Use;Guidance for Industry and Food and Drug Administration Staff2017FDA向人体细胞、组织以及基于细胞和组织的产品的制造商、医疗保健提供者以及FDA的工作人员提供的监管注意事项针对严重疾病再生医学疗法快速审评计划Expedited Programs for Regenerative Medicine Therapies for Serious Conditions2019FDA加速再生医学疗法在严重疾病治疗领域研发的建议，明确了再生医学先进疗法含义及加速审批的信息在早期临床试验中研究同时研发多个版本细胞或基因治疗产品S