Lowry’s法(Folin-酚试剂法).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Lowrys,法（,Folin,-,酚试剂法）测定蛋白质含量,Determination of protein content by Lowrys method,怎样测定血清中,蛋白质,的含量,蛋白质含量测定的常用方法比较,方 法,灵敏度,优点,缺点,凯氏定氮法,0.2 1.0mg,氮,干扰少，准确,操作复杂，费时,紫外吸收法,50,100mg,快速简便,无损样品,灵敏度低,干扰物较多,考马斯亮蓝法,（,Bradford,）法,1,5ug,灵敏、简便、快速,不同蛋白质测定时有较大的偏差,双缩脲法,1,20mg,干扰相对少，较快,灵敏度低,Lowry,法,20,250ug,灵敏度高,干扰物质多、费时、操作严格计时,选择测定方法时应考虑,1,、实验对测定所要求的灵敏度和精确度；,2,、蛋白质的性质；,3,、溶液中存在的干扰物质；,4,、测定所花费的时间等。,蛋白质含量测定的常用方法比较,方 法,灵敏度,优点,缺点,凯氏定氮法,0.2 1.0mg,氮,干扰少，准确,操作复杂，费时,紫外吸收法,50,100mg,快速简便,无损样品,灵敏度低,干扰物较多,考马斯亮蓝法,（,Bradford,）法,1,5ug,灵敏、简便、快速,不同蛋白质测定时有较大的偏差,双缩脲法,1,20mg,干扰相对少，较快,灵敏度低,Lowry,法,20,250ug,灵敏度高,干扰物质多、费时、操作严格计时,实验目的,1,、掌握,Folin,-,酚试剂法测定蛋白质含量的原理,及其实验操作技术。,2,、掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线,求样品溶液中待测定物质含量的方法。,原理,1921,年，,Folin,首创，利用蛋白质分子中酪氨酸,和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸,-,磷钼酸）起蓝色反应。,1951,年，,Lowry,对此法进行了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。,原理,第一步：双缩脲反应,在碱性溶液中,双缩脲,(H,2,NOC,NH,CONH,2,),能与,Cu,2+,作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做,双缩脲反应,。由于蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键,因此有双缩脲反应。,即,在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的,Cu,2+,作用生成紫红色的,蛋白质,-Cu,2+,复合物。,原理,第二步：,Folin,-,酚显色反应,Folin,-,酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐,-,磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈,蓝色反应,(,钼蓝和钨蓝的混合物,),。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸,(Tyr),，故有此显色反应。,即,蛋白质,-Cu,2+,复合物,中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成,蓝色的化合物,。,在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量。,即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。,原理,样品,健康人血清,正常人血清蛋白质含量：,6080g/L,试剂,1,、牛血清白蛋白标准液（,200g/ml,）,2,、碱性硫酸铜溶液（当日有效）,3,、,Folin,-,酚试剂,仪器和器材,1,、,722,型分光光度计,2,、恒温水浴箱,3,、试管,6,支、试管架,4,、加样枪、加样枪架,5,、坐标纸,操作,试剂（,ml),1,2,3,4,5,6,牛血清白蛋白,标准液,-,0.20,0.40,0.60,0.80,-,样品液,（稀释,300,倍）,-,-,-,-,-,0.50,蒸馏水,1.0,0.80,0.60,0.40,0.20,0.50,碱性硫酸铜,2.0,2.0,2.0,2.0,2.0,2.0,各管混匀，室温放置,10min,。,向各管内加入,Folin,-,酚试剂,0.20mL,2s,内迅速混匀,！,40,放置,10min,。,冷却至室温后，以,500nm,波长比色，用,1,号管,作空白，读取各管吸光度。,蛋白质浓度（,g,/ml,）,0,40,80,120,160,未知,注意事项,Folin,-,酚试剂,在酸性条件下较稳定,，而碱性硫酸铜试剂是在,碱性条件,下与蛋白质作用生成碱性的铜,-,蛋白质溶液。,故当,Folin,-,酚试剂加到碱性的铜,-,蛋白质溶液中后，,必须立即混匀,（加一管混匀一管），使还原反应发生在磷钼酸,-,磷钨酸试剂被破坏之前。,注意事项,因,Lowry,反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。,即第,1,支试管加入,2.0mL,碱性硫酸铜试剂,后，开始计时，,1,分钟后，第,2,支试管加入,2.0mL,碱性硫酸铜试剂,，,2,分钟后加第,3,支试管，以此类推。,如试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到,10,分钟，则第,1,支试管可立即加入,0.20mL,Folin,-,酚试剂,，,1,分钟后第,2,支试管加入,0.20mL,Folin,-,酚试剂,，,2,分钟后加第,3,支试管，以此类推。,水浴,10min,，冷却后，每一分钟测一管。,蛋白样品,碱性铜试剂,混匀，,放,10min,加酚试剂,2s,混匀,水浴,10min,放至室温,比色,数据处理,2,3,4,5,测定次数,1,2,3,6,各管平均,A,值,各 管,A,值,绘制标准曲线步骤,1,、选择合适的坐标纸,2,、画坐标轴,3,、根据测得的数据描点,4,、连线,5,、求实验结果,绘制标准曲线,以,A,500,值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液浓度为横坐标，用铅笔绘制标准曲线。,吸光度,A,蛋白质浓度,C,（,g,/ml,）,0.2,0.4,0.6,.,.,.,.,40,80,120,160,绘制标准曲线,根据所描点的分布情况，作直线或光滑连续的曲线，该线表示实验点的平均变动情况，因此该线不需全部通过各点，但应尽量使未经过线上的实验点均匀分布在曲线或直线两侧。,计算,根据未知样品溶液的吸光度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。,然后乘以稀释倍数（,300,），,得出每毫升未稀释血清含蛋白质的微克数，即每毫升血清中蛋白质的微克数,(,g,/ml),。,血清蛋白浓度,(,g,/ml)=,样品蛋白质浓度,2300,本方法的特点：,优点：,1.,灵敏度高，比双缩脲法灵敏约,100,倍。,2.,操作简单，不需特殊仪器设备。,缺点：,1.,费时间较长，要精确控制操作时间,2.,标准曲线也不是严格的直线形式,3.,专一性较差，干扰物质较多。,722,型分光光度计操作步骤,1.,灵敏度旋钮调至,”,1”,档,选择开关置于,”,T”,旋转波长调节旋钮,(),至所需波长,;,2.,接通电源,打开电源开关,预热,510,分钟,;,3.,打开样品室盖,调节旋钮,”,0”,使透光度,(T),读数为,0;,4.,装有空白溶液和待测试样溶液的比色杯依次入比色槽架中,置入样品室,;,5.,拉动比色架拉杆,装空白溶液的比色杯移入光路中,盖上样品室盖,调节旋钮,”,100”,使透光度,(T),读数为,100.,若达不到,100,可适当增加灵敏度的档数,;,6.,调节开关拨到,”,A”,选择旋钮,”,消光零”,使数字显示为,0;,7.,重复,”,3”,”5”,和,”,6”,步骤,12,次,;,7.,装待测试样溶液的比色杯移入光路中,读取吸光度,A,值,.,8.,读数后,取出比色杯,将参比液倒回原试管中,清洗比色杯并晾干,复习思考题,1,、试述,Folin,-,酚试剂法的优点？,2,、应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应如何注意？,请将答案附在实验报告上！,