分子生物学常用技术上.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,分子生物学常用技术,PCR,产物,A-T,克隆,测序,重组表达载体,重 组 蛋 白,制备抗体,转 染 细 胞,原核表达载体,真核表达载体,病毒表达载体,昆虫表达载体,酵母表达载体,检测活性,体内、体外,作用机制,应用,(1),PCR,(2),核酸的纯化：凝胶回收,Kit,(3),连接反应：,16,过夜,/22 2h,(4)CaCl,2,法制备感受态细胞：,Kit,(5),宿主菌的转化及蓝白筛选,(6),挑克隆：,2ml,含抗生素的,LB,(7),提质粒：,Kit,(8),重组质粒的鉴定：双酶切反应,、菌落,PCR,(9),测序：生物技术服务公司,(10),菌种保存,:2030%,甘油,-LB,，,-20/-70,步骤：,(11),外源基因在哺乳动物细胞中的表达：质粒转染、电转染,(12),目的基因表达的鉴定：,RT-PCR,、,Northern Blot,、,原位杂交、,Southern Blot,(13),目的蛋白表达的检测：,原核表达,：,SDS-PAGE(,重组蛋白诱导表达的,诱导剂浓度,、,诱导时间和温度、,重组蛋白表达的形式,),、,WB,真核表达：,Western Blot,、,ELISA,、免疫组化,(14),重组蛋白的纯化：亲和层析，,His-tag/GST-tag,(15),制备抗体：多抗和单抗,(16),基因功能检测：提高,/,降低表达水平,细胞周期检测：流式细胞仪,细胞增殖检测：,MTT,细胞凋亡检测,:,流式细胞仪、,TUNEL,、,DNA Ladder,抑瘤活性检测：体外、体内,对血管化的影响,。,(17),作用机制,1.PCR,：,Pfu,加,A,尾；,1208/8:00,2.Agarose,电泳：,Goldview,染色,;,1208,3.,核酸纯化：凝胶回收,Kit;1208,4.Agarose,电泳：检测回收条带,;1208,4.,连接反应：,pGMT,22,2h;1208,5.,转化：,Top10,热激法,，蓝白筛选。,1208,实验一,1.,挑克隆：,2ml,含抗生素的,LB+1,个克隆；,1209/9:00,2.,提质粒：,Kit,；,1210/8:00,3.,重组质粒的鉴定：双酶切反应，,37,2h,；,1210,4.Agarose,电泳：,Goldview,染色；,1210,5.,测序和序列比对：生物技术服务公司；,1213,6.,菌种保存,:2030%,甘油,-LB,，,-20/-70,。,1215,实验二,实验三,转化：,BL21,热激法；,1208,挑克隆：,2ml,含抗生素的,LB+1,个克隆；,1209/9:00,转接：,1%,过夜菌,+2ml,含抗生素的,LB,2,管,;1210/8:00,诱导：,0.5mM,和,0.1mM,的,IPTG,（终浓度）,;1210,碎菌：超声处理,;,1215/8:00,SDS-PAGE,：,10%,分离胶,，考兰染色，脱色。,1215,实验四,SDS-PAGE,：,10%,分离胶,；,1215,转膜：湿转；,1215,封闭：,RT 1h,；,1215,Ab1,：,4,过夜；,1215,Ab2,：,RT 40min,；,1216/8:00,ECL,：,RT 5min,；,1216,实验,XXX,设备：,加样器,耗材,试剂和配制方法：详细,步骤：详细,1.,核酸的分离纯化和鉴定,:,基因组,DNA,、总,RNA,、质粒,2.,基因的克隆与鉴定方法,3.,外源基因转移技术和表达体系,4.,检测方法：电泳技术：,agarose,、,SDS-PAGE,分子杂交,:SB,、,NB,、,WB,、基因芯片技术,DNA,序列测定,生物信息学分析技术,5.,基因功能研究的方法,6.,组学研究技术：基因组学、蛋白质组学,内容,核酸的基本组成,Albrecht Kossel,1910,年诺贝尔生理或医学奖,揭示核酸的化学成分,“,其对蛋白质，包括核物质的研究工作为我们了解细胞化学作出了贡献,”,Lord(Alexander R.)Todd,核苷酸的基本结构,1957,年诺贝尔化学奖,“,核苷和核苷辅酶,”,1962,年诺贝尔生理或医学奖,Francis Harry Compton Crick,James Dewey Watson,Maurice Hugh Frederick Wilkins,“,发现核酸的分子结构及其对于生命物质信息传递的重要意义”,DNA,分子的二级结构,5,末端,(,游离磷酸基,),3,末端,(,游离羟基,),数量庞大,dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP),3,，,5-,磷酸二酯键,(,共价键,),直线形多聚体,方向,:5-3,，,5 CAG.3,特点,DNA,半保留复制,变性与复性,变性：指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，,不涉及共价键断裂，不引起分子量降低。,一、核酸的分离、纯化和鉴定,基因组,DNA,的分离、纯化：,PCR,、,Southern-blot,、构建基因组文库,实验材料：哺乳动物组织,(50100mg),哺乳动物细胞,(5x10,5,10,7,),六孔板,/T25,实验步骤：,RT,匀浆：,TE pH8.0,组织,(,液氮冻存、研磨,),消化：,EDTA,、,SDS,、蛋白酶,K,、,RNase,、,37/55,抽提：酚、氯仿、异戊醇,沉淀：异丙醇,/NaAc+,无水乙醇,洗涤：,75,乙醇,干燥：风干,溶解：,TE/H,2,O,注意事项：,(1),试剂：,pH,值准确,(2),蛋白酶,K,：,20mg/ml,，分装，,-20,，避免反复冻融,(3),抽提：完全，不要触及蛋白层,(4),干燥：避免过分,(5),操作,：,小心，机械,剪,切作用，,80100kb,2.,总,RNA,的分离纯化,:,略,3.,质粒：,细菌等微生物细胞,染色体以外,，能,独立,进行,复制和遗传，赋予宿主细胞一定生物学,性状,的共价,闭环双链,DNA,分子。,合格质粒的组成要素,复制起始位点：原核,1,个，真核多个,抗性基因,多克隆位点,启动子,增强子,终止信号,加,polyA,信号,第二步：筛选标记：如抗性，决定使用什么筛选标记：（,1,）,Amp,r,：水解,-,内酰胺环，解除氨苄的毒性。（,2,）,tet,r,：可以阻止四环素进入细胞。（,3,）,cam,r,：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。（,4,）,neo,r,：氨基糖苷磷酸转移酶 使,G418,（长那霉素衍生物）失活。（,5,）,hyg,r,：,使潮霉素,失活。,如何阅读质粒？,第一步：质粒类型：,Ori,位置，原核,/,真核,/,穿梭质粒；,第三步：多克隆位点，内切酶位点,第四步：外源基因插入片段大小，,10kb,，大选大小找小,第五步：表达系统元件：启动子,-,核糖体结合位点,-,克隆位点,-,转录终止信号。,克隆载体,/,表达载体,碱裂解法,收菌,重悬：,T E-,葡萄糖,裂解：变性，,NaOH-SDS 5min,中和：复性，,KAc,抽提：酚,:,氯仿,:,异戊醇,(25:24:1),沉淀：异丙醇,洗涤：,70,乙醇,溶解：,TE-RNase A,Kit:DNA,介质,(,硅胶、玻璃奶,),Omega,：,Plasmid Mini KitI D6943-01,？,纯化：,氯化铯,-,溴化乙锭梯度平衡离心 聚乙二醇分级沉淀法,4,、核酸纯度的鉴定,OD,260,和,OD,280,应大于,0.05,OD,260,：,DNA,RNA;OD,280,：蛋白质,浓度：,1OD,260,：,50g/ml,双链,DNA,40g/ml,单链,DNA,，总,RNA,35g/ml,单链,RNA,20g/ml,单链寡核苷酸,纯度,:OD,260,/OD,280,：蛋白质污染程度，,DNA 1.8,，,RNA 1.72.1,OD,260,/OD,230,：碳水化合物污染程度，,2.0,二、基因的克隆与鉴定方法,基因的化学合成,目的基因的克隆策略,(1),根据已知碱基或氨基酸序列克隆基因,(2),根据表型变异克隆基因,(3),基于图谱的基因克隆方法,3.,文库的构建与目的基因的克隆,4.PCR,反应与目的基因的克隆,5.,目的基因克隆的鉴别与分析,基因的化学合成,前提条件：已知基因的核苷酸序列或蛋白质的氨基酸序列,适用：分子量较小、价值极高的目的基因,历史：,1979,年，,Khorana,等首次合成,E coli,酪氨酸,tRNA,基因,方法：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法,方式：固相合成法和自动合成法,2.,目的基因的克隆策略,(1),根据已知碱基或氨基酸序列克隆基因,a.,一个基因的序列已知：,PCR,技术，目的,DNA,片段,b.,一个基因的一段碱基序列已知：,反向,PCR,/RACE,，,cDNA,全长；,探针：筛选,cDNA,文库，,cDNA,全长,c.,一个或多个物种的某种基因序列已知：同源性比较，,保守序列，探针,/,引物，文库筛选,/,PCR,，从新物种中,分离功能相似的基因,d.,已知蛋白质的氨基酸序列：密码子的兼并性，可能的,核苷酸序列，探针，筛选基因组,/cDNA,文库，基因序列,(2),根据表型变异克隆基因：未知序列基因的克隆,转座子示踪技术：又称转座子标签法，酵母和植物,转座子,DNA,显性目的基因的纯合亲本,隐性纯合亲本,F1,：理论上全部为目的基因编码的显性特征,筛选因转座子插入而表现出隐性性状的个体,构建基因组文库,带有目的基因的阳性克隆,探针：转座子,DNA,构建基因组文库,转座子两侧的目的基因序列,筛选,编码显性特征的目的基因,a.,提总,RNA:,具有对比意义的两组,，,注意痕量,DNA,的污染,b.,反转录：得到细胞内所有基因的,c,D,N,A,库,下游引物：12组，,T,12,MN(M:A,、,C,、,G;N:A,、,C,、,G,、,T),c.PCR,扩增：,32,P，,35,S,上游引物：2426组，10mer,下游引物：同反转录,共计,288,312,种,PCR,反应,mRNA,差异显示：,D,D-,P,C,R,，,1992,，只能分离与某种,处理或特征有关的基因,步骤：,d.,电泳：测序胶或非变性聚丙烯酰胺凝胶，放射自显影,e.,克隆：,PCR,差异带的回收、扩增和克隆,f.N,o,r,t,h,e,r,n,bl,ot,t,i,n,g,鉴定：排除假阳性,g,.,序列分析：,Blast，递交新序列,h.,全长基因：,R,A,C,E,或,筛选,c,DN,A,文库,i.,基因功能研究：生物信息学,扩增条件：前,14,个循环采用不严格扩增条件,(,降低退火温度，,增加引物与,M,g2,+,浓度,),，促使引物与模板的错配；,后续,PCR,循环则采用严格的扩增条件。,基因片段的开放读框,www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html,氨基酸序列的功能结构域分析,www.smart.embl-heidelberg.de,www.ebi.ac.uk/interproscan/ipsearch.html,注意：,a.,与常规,PCR,不同，该方法可以保持样品中不同模板的相对比例;,b,.由于某一刺激因素常常影响数十,、,甚至数百基因的表达变化，但并不是每个基因的表达变化在此过程都起着重要的作用;,c,.电泳显示的单一扩增带并不表明它只含有单一的基因。,优点：操作简单、敏感、快速、重复性好、要求的起始,RNA,量,少、可同时检测某因素作用下表达升高与降低的基因。,缺点：,大规模地筛选，假阳性率高，得到的多为短片段，,且都靠近,3,端,发展：,EDD,、,ODD,、,GDD,、,LDD,、,FDD,(,增强、有序、基因组、长程、荧光,),消减杂交：又称扣除杂交，克隆差异表达的基因,(3),基于图谱的基因克隆方法：依赖于遗传图谱和物理图谱，,可以用来分离与已知分子标记紧密连锁的基因。,方法：染色体跳查：速度快，,200kb,片段,染色体步查：,40kb,片段,举例：囊性纤维化跨膜传导调节蛋白,(CFTR)-,囊性纤维化,(,常隐,),亨廷顿病基因,(HD)-,亨廷顿病,(,常显,),肌营养不良基因,(MD)-,肌营养不良症,(X,隐,),3.,文库的构建与目的基因的克隆,分类：按组成基因文库的重组,DNA,片段的供体来源分为两类,cDNA,文库：重组,DNA,片段来源于细胞表达出的,mRNA,，,用于某类特定细胞中基因组的表达状态以及,表达基因的功能鉴定的研究。,基因组文库：重组片段供体是某种特定生物个体的基因组,DNA,，,主要用于基因组物理图谱构建、基因组序列分析、,基因在染色体上的定位、基因组中基因的结构和,组织形式分析等方面的研究。,基因文库：指采用体外克隆技术得到的一个重组,DNA,分子群体。,噬菌体载体系统：最早使用，装载容量大，适合于全长,cDNA,克隆，,易于长期保存，可采用的文库筛选的方法有限。,质粒载体系统：体外操作简便，载体的可塑性强，可进行功能性筛选，,插入片段的载体容量小，含有长片段的重组克隆易丢失，,保存条件严格。,噬菌体载体系统：可进行功能性筛选,哺乳类细胞表达载体：反转录病毒载体是最常用的系统,类型：表达型：采用表达型载体，插入的,cDNA,片段可表达,成融合蛋白，具有抗原或生物学活性，可用,抗体或某种化合物作为探针进行筛选。,非表达型：只能用核酸探针筛选包含目的基因的克隆。,(1)cDNA,文库,步骤：,cDNA,合成，连接到质粒,/,噬菌体载体上，,转化或感染大肠杆菌，产生,cDNA,文库。,cDNA =copy DNA,cDNA,文库的筛选：,a.,基于核酸相互杂交分离目的基因,同源探针：,mRNA,差异显示,利用种属间基因同源性，从,EST,数据库中搜寻,兼并性寡核苷酸探针,cDNA,探针,b.,基于基因编码蛋白的检测筛选,cDNA,表达文库,噬菌体表面展示系统,酵母双杂交系统,酵母单杂交系统,(2),基因组文库,概念：是由大量独立克隆形成的群体，指能够代表某种,有机体整个基因组的一套克隆。,步骤：,DNA,样品的制备用限制性内切酶酶切基因组,DNA,电泳分离回收约,20kb,的大片段与限制性内切酶处理,的载体连接在体外包装成噬菌体颗粒，侵染大肠杆,菌文库的扩增,载体：,噬菌体载体：可容纳,20kb,的插入片段，易于操作，,筛选体系完整，容量偏小。,黏粒载体：载体容量大，可容纳,45kb,的,DNA,片段，,不易操作。,4.PCR,反应与目的基因的克隆,发展历史,基本原理,反应体系,常见类型,建立,PCR,实验室,Kary B.Mullis,Michael Smith,PCR,和定点突变突变,1993,年诺贝尔化学奖,“发明了聚合酶链反应,(PCR),的方法”,“,开创了基于寡聚核苷酸的定点突变,方法及其在蛋白质研究中的发展,”,(1)PCR,发展史,1.1983,年春，,Mullis,提出,PCR,的概念；,2.1983,年,9,月，,Mullis,用大肠杆菌,DNA,聚合酶做第一个,PCR,实验，只一个循环；,3.1983,年,12,月，同位素标记的,10,个循环后的,49 bp,长度的第一个,PCR,片断；,4.1985,年,12,月,20,日，,Mullis,的同事,Saiki,在,Science,上发了一篇论文，方法中用了,PCR,技术，导致,Mullis,的文章到处被拒；,5.1985,年,10,月,25,日申请,PCR,专利，,1987,年,7,月,28,日批准,(,专利号,4,683,202,），这次,Mullis,是第一发明人。,6.1986,年,5,月，,Mullis,在冷泉港实验室做专题报告，全世界开始学习,PCR,方法；,7.1986,年,6,月，,Cetus,公司纯化了第一种高温菌,DNA,聚合酶，,Taq DNA polymerase,，这是,1985,年春天,Mullis,建议做的；,8.1988,年，第一台,PCR,仪问世；,9.1991,年，,Hoffman LaRoche,以,3,亿美元代价从,Cetus,公司获得全权开发权。,10.1993,年，,Mullis,获得诺贝尔化学奖，,PCR,和,DNA,重组技术一样意义深远。,PCR,仪的变迁,1.,三个水浴锅，用手移动（,Mullis,等人当时用的）,2.,电加热块 自来水冷却（,PE,，,1988,）,3.,电加热块 内置循环液冷却（,PE,，,1989,）,4.,三个加热块 机械手（,Stratagene,，,1994,）,5.,半导体制冷和加热（,MJ,PE,BioMetra,Eppendrof,）,6.,温度梯度,荧光检测,(,如,Roche,的,Lightcycler),7.,风加热,8.Lab-on-chip,式的,PCR,仪,(,所谓的芯片,PCR),中国的状况,1.1991,年出现三个水浴锅,+,机械手原始,PCR,仪,(,华美，复日等,),；,2.,现在以半导体（,Peltier,板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈,厦门安普利等）。,PCR,相关的术语和产品,T-vector,HotStart Taq,RT-PCR,RAPD-PCR,DDRT-PCR,LM-PCR,Inverse PCR,Nested PCR,Real-time PCR,RACE,Flow chip PCR,TAS,Multiplex PCR,Immuno PCR,Asymmetric PCR,LP-PCR,NASBA,Recombinant PCR,AFLP,SSCP,In situ,PCR,TaqMan/SYBR green,(2),原理,:,模板变性、引物退火、,DNA,聚合酶进行,DNA,链延伸,第二轮扩增,第一轮扩增,引物与模板结合,模板,第三轮扩增,PCR,产物呈指数方式增加，,2530,个循环，理论,10,9,分子，实际,10,5,10,7,上游引物,下游引物,PCR,产物生成曲线,logDNA,Cycles,PCR,琼脂糖凝胶电泳,最终产物,3-4,小时,紫外灯观察,特点：特异性、有效性、忠实性,1.,操作简便省时；,2.,灵敏度高；,3.,特异性较强，但有一定的假阳性率。提高退火温度可以提高特异性；,4.,对原始材料的质量要求较低；,5.,有一定程度的单核苷酸错误掺入。因为,Taq DNA,聚合酶缺乏,35,核酸外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入。,a.,模板,DNA,：,单链或双链,DNA,避免,DNA,聚合酶抑制剂和能结合,DNA,的蛋白质污染。,b.,引物：,人工合成的两段与待扩增靶,DNA,侧翼片段互补的寡核苷酸。,0.10.5,m,o,l/,L,c.M,g,2+,的浓度,：,反应产物的特异性和产量，,1.5m,m,o,l/,L,。,d.,d,N,T,P,：,50200,m,o,l/,L,，四种,dNTP,浓度相同。,e.,T,a,q,酶,：,K,l,e,n,o,w,/,T,a,q,酶,/,高保真,T,a,q,酶,2.5U/100l。,f.,参数：,94 5min-30(94 30sec-55 30sec-721 min),-72 7min,(3),组成,10Taq Buffer 2.5l,引物,(10mol/L)21l,H,2,O,：管内总,nmol,数,/10(ml),dNTP(2.5mmol/L)2.0l,H,2,O 16,.2l,Taq,酶,(0.5U/l)1.3l 4,模板,1l,25l PCR,体系,PCR mix:,：,存于,-20,2.5mM dNTP 80l,10Taq buffer 100l,H,2,O 648l,25l,体系：,20l,反应,15l,体系：,12l,反应,55,调整温度,(23),温度高，特异性高,2XMaster Mix=,dNTP+,Taq,酶,+,Taq buffer+loading buffer,H,2,O 7l,引物,(10mol/L)21l,Master Mix 10ul,模板,1l,Kit:,天根生化，,2XPfu Master Mix,，加,A,尾？,影响因素,模板：,ng,级的质粒,DNA,，,g,级基因组,DNA,。,引物：引物浓度不宜偏高，否则易形成引物二聚体。特异性,Mg,2+,浓度：特异性及产量,dNTPs,浓度：正确性和产量,Taq,酶用量：非特异性,循环参数：常规为,2530,个循环,底物：四种,dNTP,模板：,DNA,引物：,DNA/RNA,方向：新生链,5 3,产物：与模板性质相同,DNA,聚合酶催化,DNA,链的延伸,DNA,聚合酶的活性,5 3,聚合作用：将,dNTP,加到,DNA,单链,3,端，延长,DNA,链,；,5 3,外切酶活性：催化,DNA,双链从,5,端水解，切除修复。,3 5,外切酶活性：催化单链,DNA,从,3,端水解，复制校正；,大肠杆菌的,DNA,聚合酶,聚合酶,：,5 3,外切酶活性，切除,RNA,引物；,5 3,聚合酶活性，填补引物切除后形成的空隙,3 5,外切酶活性，校正作用,聚合酶,：,修复合成，不参与,DNA,复制,聚合酶,：,5 3,聚合酶活性，,DNA,链的延长,3 5,外切酶活性，校正作用,真核细胞的,DNA,聚合酶：,DNA,聚合酶,、,、,、,mt,Klenow,片段：指,DNA,聚合酶,被蛋白酶有限水解所,得到的,68kD,的大片段，具有,3 5,核,酸外切酶活性和,5 3,聚合酶活性。,应用：双链,DNA,的,3,末端标记,5 3,核酸外切酶,3 5,核酸外切酶,聚合酶,N,C,35kD,小片段,68kD,大片段,(Klenow,片段,),Taq,DNA,聚合酶,(,T,hermus,aq,uaticus,，,Cetus/Roche),Tth,DNA,聚合酶,(Thermus thermophilus,，,Toyobo),Pfu,DNA,聚合酶,(,P,yrococcus,fu,riosus,，,Stratagene),Deep,Vent,DNA,聚合酶,(Bio-labs),Tfl,DNA,聚合酶,(,Thermus flavus,，,Promega),Tli,DNA,聚合酶,(Thermococcus litoralis,，,Promega),Vent,DNA,聚合酶,(Bio-labs,）,Pwo,DNA,聚合酶,(Pyrococcus woesei,，,Roche),Pfx,DNA,聚合酶,(Thermococcus kodakaraensis,Invitrogen),Dyna,zyme DNA,聚合酶,（,Thermus brockianus,，,Finnazyme),FD,DNA,聚合酶,(Thermus sterophilus,？，复旦大学,),Tma,Tne,KOD,耐高温,DNA,聚合酶种类,1),长度一般为,18,-,25,个碱基；,2),尽可能择碱基随机分布的序列；,3),两条引物的,G+C,的百分比应尽量相似，多为4555%；,4),避免引物内部形成二级结构；,5),两引物之间不应发生互补，特别是在3端;,6),引物,3,末端碱基可以影响,T,aq,酶,的延伸效率，最好选,T,、,G,或,C,，,而非,A,；,7),引物5端允许有一段序列不与模板配对,内切酶，保护碱基,。,引物设计,原则,软件,/,网站：？,第一步：查找目的基因序列：,mRNA,序列,(NCBI,GenBank),第二步：核酸内切酶位点分析,www.in-pET,pRSET,GST:pGEX,真核表达载体：,pcDNA3,pcDNA3.1,myc:pCMV-myc,pcDNAmyc/His,pSecTag2,HA:pcMV-HA,Flag,GFP:pEGGFP-N,pEGFP-C,pIRES,2,-EGFP,RFP,病毒表达载体：,pAdEasy,。,His-tag,GST-tag,GGA,GA,A,1 atg aat ttt caa cag agg ctg caa agc ctg tgg act tta gcc aga 45,1 M N F Q Q R L Q S L W T L A R 15,46 ccc ttc tgc cct cct ttg ctg gcg aca gcc tct caa atg cag atg 90,16 P F C P P L L A T A S Q M Q M 30,541 gac gta gaa gca gct ctg acc aaa gcc ctt ggg gaa gtg gac att 585,181 D V E A A L T K A L G E V D I 195,586 ctt ctg acc tgg atg cag aaa ttc tac aag ctc tga 621,196 L L T W M Q K F Y K L *,。,5,保护碱基,+,酶切位点,+,起始密码,+,目的基因,5,末端序列,3,1,atg aat ttt caa cag agg ctg,caa agc ctg tgg act tta gcc aga 45,1 M N F Q Q R L Q S L W T L A R 15,上游引物,5,cg,gga tcc,atg aat ttt caa cag agg ctg,3,Bam,HI,上游有标签 读框,586 ctt ctg acc tgg atg,cag aaa ttc tac aag ctc,tga 621,196 L L T W M Q K F Y K L *,下游引物,:,反向互补,5,保护碱基,+,酶切位点,+,终止密码,+,目的基因,3,末端反向互补序列,3,5,ccg,ctc gag,tca,gag ctt gta gaa ttt ctg,3,Xho,I,下游有标签 读框,1),T=2(A+T)+4(G+C)-35,2)T=22+1.46 ln35,ln=2(G or C)+(A or T)2035nt,3)T=81.5+16.6lgJ,+,+0.41(G+C%)-(600/l)-0.63(FA%),J,+,=,m,o,n,o,v,a,l,e,n,t,c,a,t,i,o,n,s,l=,o,li,g,o,n,u,c,l,e,o,t,i,d,e,l,e,n,g,t,h,F,A=,f,o,r,m,a,m,i,d,e,1470nt,55,调整温度,(23),温度高，特异性高,退火温度,图,PCR,产物电泳结果,(1.5%Agarose),1.DNA,相对分子质量,DL2000;,2.PCR,产物,;,3.PCR,空白对照。,a.,样品准备区：提取核酸,在没有,DNA,的干净环境中进行,PCR,实验室,b.,前,PCR,区：加样区，配制所用的试剂。,c.,后,PCR,区：反应后处理样品,这一区域的所有试剂和仪器不能用于任何前,PCR,活动,a.,阴性,(,无模板,),、阳性对照,(,阳性模板,),b.,配制,PCR,混合物：,PCR buffer+dNTP+H,2,O,c.,控制污染,:,靶序列污染，气溶胶,注意事项,实验室分区；,紫外线,(,距离,1m,，,400W/cm,2,),照射；,更换试剂；,换仪器；,换实验室；,用另一套引物；,用化学法修饰,DNA,；,停试验。,限制性核酸内切酶：,识别,DNA,的特异序列,并在识别位点或其周围,切割双链,DNA,的一类核酸内切酶。,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,命名原则,E,co,R,I,属的缩写,种的缩写,不同变种和品系的缩写,同一种微生物中分离多种限制酶的顺序,“发现限制性内切酶及其在分子遗传学方面的应用”,1978,年诺贝尔生理或医学奖,Werner Arber Daniel Nathans Hamilton O Smith,反转重复序列：,迴文序列,，由反向互,补序列相同的两个片段组成。,按组织特点分类：,正向重复序列：由方向相同、序列完全,相同的两个片段组成，最常见。,反向重复序列：由方向相反、反向,序列完全相同的两个片段组成。,GGCA,酶活性单位,一个活性单位：在适当的反应条件，,1,小时，,完全酶解,1g DNA,底物，限制性内切酶的量。,标准的酶解反应：,50l,反应体系，,1U,内切酶，,最适反应条件，,1,小时，,1g DNA,完全降解。,单酶切,/,双酶切反应：,30 l,37 24h,DNA 3g,10buffer 3l,E,1l(2),H,2,O,补足体积,1.,质粒,2,5.,质粒,2,种内切酶,3.DNA/Hind,4.DL2000,迁移率：同样大小分子,超螺旋,线性分子,缺口或松弛,环状 线性,/,缺口,影响因素,DNA,：纯度、甲基化程度、分子结构,缓冲液：,pH,值,溶液：离子种类及浓度,消化反应的温度,反应体系中甘油浓度,星号活力：,Star,活力，,改变酶反应条件，识别特异性降低，共性，,(*),甘油含量高：酶量不超过反应体积的,10%,；,1/30,内切酶用量过大：,100U/gDNA,；,210U/g DNA,离子强度低：,25mmol/L,；,推荐,Buffer,pH,值高：,pH7.58.5,EcoRI,出现*；,pH7.0,含有机溶剂：,DMSO,，乙酸等,;,DNA,纯度,二价阳离子：,Mn,+,Co,+,Zn,+,等；,Mg,+,诱发因素：,Bam,H,GTC,CAG,G,CCTAG,GATCC,G,+,GGATCC,CCTAGG,Hin,d,GTCGAC,CAGCTG,GAC,CTG,+,平端切口,粘端切口,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割,DNA,后，产生相同的粘性末端，称为,同尾酶,。这两个相同的粘性末端称为,配伍未端,(compatible end),。,Bam,H,Bg,l,GGATCC,CCTAGG,AGATCT,TCTAGA,G,CCTAG,GATCC,G,+,+,A,TCTAG,GATCT,A,T4DNA,连接酶,16 12h,4 12h,室温,15min,连接,Bam,H,切割反应,GGATCC,CCTAGG,T4,DNA,连接酶,GATCC,G,G,CCTAG,+,目的基因用,Bam,H,切割,载体,DNA,用,Bam,H,切割,重组体,载体自连,目的基因自连,同一限制酶切位点连接,Eco,R,切割位点,Bg,l,切割位点,+,Eco,R+,Bg,l,双酶切,Eco,R+,Bg,l,双酶切,T4,DNA,连接酶,15,C,重组体,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,不同限制酶切位点的连接,目的基因,载体,限制性内切酶,限制性内切酶,T4 DNA,连接酶,15,C,重组体,载体自连,目的基因,自连,平端连接,Eco,R,Eco,R,Eco,R,CCGAATTCG,GGCTTAAGC,5,-,3-,Eco,R,人工接头,互补现象,pUC,系列质粒,(lac,操纵子,),-,半乳糖苷酶氨基端,细菌,(-,半乳糖苷酶氨基端缺陷型,),蓝色菌落,外源,DNA,插入,白色菌落,-,半乳糖苷酶,诱导物,IPTG,生色底物,X-gal,缺陷型,蓝白筛选,a.,大量扩增目的核酸片段,b.,检测基因的整合、表达情况,c.,在核酸中引入突变,d.,核酸测序,e.,克隆新基因,f.,生物多态性的研究,应用,医学领域,a.,疾病基因检测,/,遗传病的产前诊断,b.,致病病原体的检测,c.,肿瘤治疗中癌基因的检测,会推广到大部分疾病治疗前的检测,d.DNA,指纹、个体识别、亲子关系鉴别、法医物证,e.,其他：动、植物检疫（转基因动植物检测）,长片段,PCR,Taq,酶：,LA Taq,酶,(,5U/50l,反应,),dNTP:2.5mM 8 l,延伸：,5min,循环：,25,-Hind,第一轮,PCR,巢式,PCR:,模板数低，,增加特异性扩增，提高扩增效率。,需要两到三对引物,1,2,第二轮,PCR,3,4,3,2,1,4,反转录,PCR,：,RE-PCR,，略,b.,当突变位于基因的中间部位时，可以采用以下方法,。,研究蛋白质结构与功能之间复杂关系的重要工具。,定点,突变,：,a.,突变位点位于基因两侧，,在,引物,中,加突变碱基；,2,1,1,3,第一轮,PCR,第二轮,PCR,方法一,1,2,3,4,1,4,方法二,第一轮分步,PCR,PCR,产物互补,Taq,酶,第二轮,PCR,定量,PCR,普通,PCR,：对,终产物,进行定性和半定量分析；,PCR,产物的长度从,100bp,数,kb,。,定量,PCR,：实时检测每个循环扩增产物量的变化；,通过,Ct,值和标准曲线对,起始模板,定量分析；,PCR,产物长度一般在,60,150 bps,。,logDNA,不同样品有不同的生成曲线,非特异性：,SYBR Green,：与,DNA,双链的小沟结合，双链时,有荧光，单链时无荧光。,特异性：,Taq man,：水解型杂交探针，,5,端有报告基团,R,，,3,端,有荧光淬灭基团,Q,，,R,和,Q,分开时有荧光。,Molecular Beacon,：分子信标，一端有荧光素，另一,端有淬灭剂的发夹探针，环与目标序列互,补，颈由互补配对序列组成。,荧光标记试剂,SYBR green,Cycle 1,Cycle 3,Cycle,2,SYBR green,优点：对,DNA,模板没有选择性，适用于任何,DNA,；,使用方便，不必设计复杂探针；,非常便宜，,$1/PCR,反应,缺点：容易与非特异性双链结合，产生假阳性，需要努力,优化反应条件；,对引物特异性要求较高。,应用范围：起始模板测定；基因型分析；溶解曲线分析。,Taq Man,ABI,公司,1995,年,11,月申请专利。,应用范围：起始模板定量，基因型分析，目的基因定量，,产物鉴定，,SNP,分析。,优点：对目标序列的特异性高，阴性结果确定；,设计相对简单，与目标序列某一区域互补；,重复性比较好。,缺点：只适合一个特定的目标；,委托公司标记，价格较高；,不易找到本底低的探针。,Taq Man,Molecular Beacon,Molecular Beacon,应用范围：起始模板定量，基因型分析，产物鉴定，,SNP,分析。,优点：高特异性，是对目标序列检测,SNP,最敏感的试剂之一；,荧光背景低。,缺点：只能用于一个特定目标；,设计困难；,价格较高。,方法比较,方法,优点,缺点,适用范围,SYBR Green,适用性广，,灵敏，,方便，,便宜,引物要求高，,易出现非特异性带,科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量和转基因重组动植物的研究。,Taq Man,特异性高，,重复性好,价格高，,只适合特定目标,病原体检测，,疾病耐药基因研究，药物疗效考核，,遗传病诊断,Molecular,Beacon,高特异性，,荧光背景低,只适合特定目标，,设计困难，,价格高,特定基因分析，,SNP,分析,。,(2),核酸杂交筛选：又称鸟枪法途径，使用已经定性的探针对文库进行筛 选，,可以找到目的克隆。,探针：,cDNA,、基因组,DNA,、寡核苷酸片段和,RNA,(3),表达文库的免疫学筛选：即通过对目的基因表达产生的蛋白质产物进行,免疫学筛选，先将合成的,cDNA,连接到带有启动子的载体上构建表达文,库，用特定蛋白的抗体作为探针进行筛选，通过表达产物与抗体的特异,性结合在文库中寻找目的,cDNA,克隆。,(4),目的基因的定性分析：最确切的基因分析方法是序列分析。,思考题：,做,PCR,实验之前，你应该做哪些准备工作？,设计引物时，需要注意哪些问题？,一位同学未能将,PCR,产物连入表达载体，请分析可能是哪些环节出问题？,你是如何理解质粒的？,如果你做某个实验，三次都未得到你想要的结果，你准备下一步怎么办？,1.,王镜岩等主编，生物化学，第三版，高等教育出版社，,2002,年。,2.,张迺蘅主编，医学分子生物学，北京医科大学出版社，,1999,年。,3.,徐钤主编，基因的分子生物学，中国科学技术出版社，,1