样品采集和处理.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,海南省皮肤病医院,*,Click to edit Master title style,样品采集和处理,优选样品采集和处理,2,许多研究者用多种检测方法和不同人群样本的研究结果证实，技术和生物因素对样本RNA水平的影响是持续的和可预测的，大约在0.,代表的是病毒的负荷，即体内复制的病毒的数量,送检血浆2管，每管1ml，冷冻(藏)运输,Plasma HIV Viremia,病毒载量检测样品采集运输保存,常用的淋巴细胞计数检测方法为自动检测方法，包括流式细胞仪（主要有多平台法和单平台法）和专门的细胞计数仪,样品处理对病毒载量结果的影响,采集血液后，立即轻轻上下颠倒抗凝管约10次，使血液与抗凝剂充分混匀，避免剧烈振荡导致溶血,CD4+T淋巴细胞测定的方法,CD4+T-cells,血浆中病毒水平是病毒增殖和免疫清除机制共同作用的结果，CD4+T细胞越少显示病毒载量水平越高,简单来讲是通过测量从而显示每毫升血液里病毒的数量,分离培养：全血、淋巴细胞,CD4细胞计数为HIV感染临床分期、疾病进展监测、机会性感染的风险评估、抗病毒治疗适应症选择及疗效评价的实验室指标,务必在采集全血的4小时内分离血浆，室温下1500-3000r/min离心15分钟,基本知识,HIV检测方法,抗体检测、抗原检测、核酸检测、耐药检测、CD4+和CD8+T淋巴细胞测定、HIV分离培养,样品的种类,全血、血清、血浆、细胞、唾液、尿液、滤纸干血斑,支持性文件:全国艾滋病检测技术规范()、艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴细胞检测质量保证指南(2006)、HIV-1病毒载量测定及质量保证指南()、可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定(卫生部45号令，2006),3,基本知识,step4,step3,step2,step1,检测方法,样品种类,采集处理,保存运输,样品采集处理选择策略,检测方法：依据检验目的选择。,样品种类：实验方法、检测试剂和仪器要求。,采集处理：采血方法、抗凝管的选择、采血量、离心分离、多项检测,保存运输：温度、时限、容器,4,样品种类,HIV,抗体检测：,全血、血清、血浆,、唾液、尿液、,DBS,CD4,+,和,CD8,+,T,淋巴细胞测定：,抗凝全血,病毒载量检测：,血浆,耐药、基因型检测：,血浆、,DBS,核酸定性检测：,全血、血浆、淋巴细胞、,DBS,分离培养：,全血、淋巴细胞,5,抗病毒治疗的目标,病毒学目标：最大程度地减少病毒载量，将其维持在不可检测水平的时间越长越好,免疫学目标：维持免疫功能，获得免疫功能重建和,/,或部分免疫重建,终极目标：延长生命并提高生活质量,6,病毒载量与,CD4,+,T,计数,HIV,infection,J.Coffin,XI International Conf.on AIDS,Vancouver,1996,AIDS,病程：一列迫近悬崖的列车,病毒载量,=,火车的速度,CD4,+,T,计数,=,离悬崖的距离,抗病毒治疗：制动火车的外力,7,病毒载量与,CD4,+,T,计数,8,病毒载量与,CD4,+,T,计数,CD4,细胞,(,cell/mm3,）,800,400,急性感染期,无症状期,艾滋病前期和艾滋病期,CD4,病毒载量,抗,HIV,的,CTL,HIV,抗体,9,HAART的目标,Ultimate Goal of HAART,Relative Levels,Months,Years After HIV Infection,CD4+T-cells,Plasma HIV Viremia,Acute HIV infection Symptom,Limit of detection,10,HIV-1,病毒载量检测,代表的是病毒的负荷，即体内复制的病毒的数量,体内复制的病毒的数量是不能直接测量的，一般用血浆中,RNA,的拷贝数代表,HIV,的病毒载量,简单来讲是通过测量从而显示每毫升血液里病毒的数量,定量机体内游离病毒的含量,11,病毒载量检测的意义,急性,HIV,感染，窗口期复制高峰每毫升血液,RNA,拷贝可达,910,7,，一年以后仍然可达,2-410,4,判定病人疾病的进程和进展。血浆中病毒水平是病毒增殖和免疫清除机制共同作用的结果，,CD4,+,T,细胞越少显示病毒载量水平越高,12,Years After HIV Infection,单平台法最大程度地减少了多个仪器检测带来的检测误差，细胞绝对计数结果的重复性和准确性都得到了良好的保证。,进行性且选择性地消耗CD4细胞是HIV感染的特征。,CD4+T淋巴细胞测定,一般地讲，血浆中病毒载量水平比血清中的要高出3080,单平台法最大程度地减少了多个仪器检测带来的检测误差，细胞绝对计数结果的重复性和准确性都得到了良好的保证。,免疫学目标：维持免疫功能，获得免疫功能重建和/或部分免疫重建,最大的缺点在于操作步骤复杂，操作人员多、费时，因此很难将变异水平减小到最低。,血浆样本3天内送检可在2-8暂时保存，1个月以内应冻存于-20以下，1年以内应置于-70以下,Plasma HIV Viremia,准确及时地对残留CD4细胞计数，不仅是评价性试验，也是对存活的HIV感染者实施治疗与关怀的一部分,免疫学目标：维持免疫功能，获得免疫功能重建和/或部分免疫重建,病毒载量与CD4+T计数,1小时以内，EDTA抗凝管RNA丢失约10，ACD抗凝管丢失约20；,FALS Sensor,病毒载量检测的意义,监测与指导抗病毒治疗过程，,ART,早期,HIV RNA,水平快速下降，并在相当长的一段时间维持在一个比较平缓的水平，大部分患者可以下降到检测不出的水平,观察耐药性,13,HIV-1病毒载量检测方法,病毒载量检测主要有三种方法：,bDNA,、,RT-PCR,及,NASBA,NASBA,检测是通过核酸释放、提取、核酸扩增,(NASBA,扩增,),及核酸检测来完成对血浆中,HIV,病毒,RNA,的定量测定,生物梅里埃公司将,NASBA,核酸扩增技术与实验时,(real-time),检测技术结合起来，“分子信标实时扩增检测技术”，能够对检测进行实时监控，即称为“,EasyQ”,14,病毒载量检测样品采集运输保存,HIV-1,，血浆样品,EDTA,抗凝真空无菌采血管,全血,5ml,或,3ml*2,采集的样品量应尽可能与定量采血管的刻度一致，采集量过多或不足，会造成血液凝固或被稀释。采集血液后，立即轻轻上下颠倒抗凝管约,10,次，使血液与抗凝剂充分混匀，避免剧烈振荡导致溶血,15,病毒载量检测样品采集运输保存,务必在采集全血的,4,小时内分离血浆，室温下,1500-3000r/min,离心,15,分钟,送检血浆,2,管，每管,1ml,，冷冻,(,藏,),运输,血浆样本,3,天内送检可在,2-8,暂时保存，,1,个月以内应冻存于,-20,以下，,1,年以内应置于,-70,以下,血浆样品冻融不应超过,3,次,16,病毒载量检测结果的解释,单位：,copies/ml,检测限：,20 cps/ml(0.5ml),；,10 cps/ml(1ml);100 cps/ml(0.1ml),结果举例：,20copies/ml(,检测到,HIV,核酸，但是低于方法检测下限，无法定量,),TND(,未检出，使用现有的检测方法对本次样本未检测到,HIV,核酸,),17,样品处理对病毒载量结果的影响,一般地讲，血浆中病毒载量水平比血清中的要高出,30,80,用,EDTA,抗凝剂的采血管采集全血后分离血浆样本，其,HIV RNA,含量比,ACD,和肝素抗凝管相应含量多,10,15,及,20,25,18,样品处理对病毒载量结果的影响,采集全血后的,3-6,小时,RNA,丢失量最大，血浆样本,RNA,丢失低于全血样本。,1,小时以内，,EDTA,抗凝管,RNA,丢失约,10,，,ACD,抗凝管丢失约,20,；,6,小时以内，肝素抗凝管,RNA,丢失约,30,。,19,样品处理对病毒载量结果的影响,血浆样本在,-20,冰柜保存,3-14,个月，与起始病毒载量水平值,(0,月,),相比，,3,个月时变化没有显著性差异；,6,个月后下降值明显，有随着保存时间延长病毒载量水平下降幅度越大的趋势。在,-20,冰柜内保存,6,个月，样本病毒载量水平已不能真实反映样本采集之初的水平，对疾病进展和疗效评价，尤其对回顾性研究已无指导意义。,20,样品处理对病毒载量结果的影响,-20,条件下冻融,3,次比冻融,1,次,HIV RNA,降低约,20,。,许多研究者用多种检测方法和不同人群样本的研究结果证实，技术和生物因素对样本,RNA,水平的影响是持续的和可预测的，大约在,0.3-0.6 log/ml,之间。,21,CD4,+,T,淋巴细胞测定,进行性且选择性地消耗,CD4,细胞是,HIV,感染的特征。,CD4,细胞减少与机会感染增高相结合并且在个体感染,HIV,后病情呈进行性。,CD4,细胞残余数在临床预后治疗监测和新型抗逆转录病毒以及疫苗的临床试验入选标准工作中是最经常利用的实验室测量项目,22,CD4,+,T,淋巴细胞测定,准确及时地对残留,CD4,细胞计数，不仅是评价性试验，也是对存活的,HIV,感染者实施治疗与关怀的一部分,CD4,细胞减少与机会感染增加和病情发展相联系,CD4,细胞计数为,HIV,感染临床分期、疾病进展监测、机会性感染的风险评估、抗病毒治疗适应症选择及疗效评价的实验室指标,23,流式细胞术(FCM),FCM,是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。,FALS Sensor,Laser,24,流式细胞术特点,单细胞的流动的,活细胞的,定量的,多参数的,高统计学精度的,分选细胞,25,CD4,+,T,淋巴细胞测定的方法,CD4+,和,CD8+T,淋巴细胞计数的方法分为两大类，一类是应用流式细胞仪测定法，另一类是非流式细胞仪测定法,常用的淋巴细胞计数检测方法为自动检测方法，包括流式细胞仪（主要有多平台法和单平台法）和专门的细胞计数仪,26,抗体检测、抗原检测、核酸检测、耐药检测、CD4+和CD8+T淋巴细胞测定、HIV分离培养,样品处理对病毒载量结果的影响,双平台法需要两种仪器，由于仪器有系统误差，计算结果的重复性和准确性影响因素较多，导致不同实验室计数结果差异很大。,一般地讲，血浆中病毒载量水平比血清中的要高出3080,Relative Levels,CD4细胞计数样品的采集运输,代表的是病毒的负荷，即体内复制的病毒的数量,保存运输：温度、时限、容器,核酸定性检测：全血、血浆、淋巴细胞、DBS,单平台法最大程度地减少了多个仪器检测带来的检测误差，细胞绝对计数结果的重复性和准确性都得到了良好的保证。,全血、血清、血浆、细胞、唾液、尿液、滤纸干血斑,样品处理对病毒载量结果的影响,病毒学目标：最大程度地减少病毒载量，将其维持在不可检测水平的时间越长越好,样品处理对病毒载量结果的影响,FALS Sensor,双平台法,双平台方法是一种细胞群体的绝对计数方法，利用血球计数仪检测淋巴细胞数量，再根据流式细胞仪得到的细胞群体百分比，计算得到每微升的淋巴细胞数量。,双平台法需要两种仪器，由于仪器有系统误差，计算结果的重复性和准确性影响因素较多，导致不同实验室计数结果差异很大。,最大的缺点在于操作步骤复杂，操作人员多、费时，因此很难将变异水平减小到最低。,27,单平台法,应用三色、四色流式试剂配以内参绝对计数微球，加上流式细胞仪淋巴细胞亚群获取和分析软件，一步即可获得,T,细胞亚群的相对数,(,百分比,),和绝对数。,单平台法最大程度地减少了多个仪器检测带来的检测误差，细胞绝对计数结果的重复性和准确性都得到了良好的保证。,28,CD4细胞计数样品的采集运输,抗凝全血,K,2,EDTA/K,3,EDTA,抗凝真空无菌采血管,采样量：成人采集静脉血,5ml,，采集儿童静脉血样品建议用儿童型注射器和小试管,(2ml),，采集婴儿样品较为困难，用小试管采集,0.5-1ml,即可,样品混匀：采集的静脉血注入抗凝管后，立即轻轻颠倒抗凝管,6-8,次，使血液与抗凝剂充分混匀，防止血液凝固，避免剧烈振荡导致溶血,29,