色谱纯化技术—制备型HPLC简介_华运有限公司_184页.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,色,谱纯化技术,华运有限公司,制备型高效液相色谱,主要内容,制备色谱的概况,制备色谱柱,制备色谱流动相,制备色谱进样方式,制备色谱的进样量,制备色谱的检测技术,样品溶解度对制备色谱的影响,制备色谱的馏分收集,阀切换技术在制备色谱中的应用,吉尔森制备色谱系统的特点,吉尔森制备色谱软件的特点,制备液相色谱概况,目,标,化合物,鉴,別,测试,生物活性,多維制,备色谱,保,证样,品的高純度,动物体内,测试,从,目,标,化合物,中,发现潜,在,药,物,制,备色谱分离,出,实验室,量級,的,潜,在,药,物,临床实验,验证药物,的,安全,性及,药,效,制,备色谱分离,純,化公斤級的,药,物,生产前的中试,建立,最经济,的,分,离生产,流程,簡化純化,工艺,大量生产,生,产,大量的,純品,药,物,制,备色谱,是,簡,单,高效的,纯化工艺,在,医药开发,的每,个阶段,制,备色谱,都起到十分重要的作用,制备色谱在国内的需求越来越大,制备色谱的分类,小规模制备制备量 10,mg/,循环,半制备制备量 10 50,mg/,循环,大规模制备制备量 0.5 1.0,g/,循环,工业制备制备量 20,g/,天,根据色谱柱的柱径大小分类：,柱径 100,mm,工业制备柱,分析型,HPLC,进样装置,泵,分析柱,检测器,/,分析池,控制电脑及软件,制备型,HPLC,制备柱,进样装置,泵,检测器,/,制备池,馏分收集器,制备色谱与分析色谱的区别,分析型,HPLC,信息（数据）,制备型,HPLC,纯度高的产物,在分析型,HPLC,中，主要考虑的是柱效。要求信噪比小、检测下限低。在制备型,HPLC,中，要求分离物的纯度要满足一定的条件，样品要回收，进样量和回收量的多少与经济效益直接相关。,进行制备色谱纯化前，首先用分析色谱摸索分离条件。,制备色谱纯化样品时，在产品纯度达到要求后，产品的费用往往是优先考虑的因素，以便节约投入，提高效益。因此，在制备色谱中常常使用的是非线性进样。,制备色谱与分析色谱的区别,线性色谱,组分在固定相和流动相的平衡浓度呈正比关系，吸附（分配）等温线为一条直线。由于分析型色谱进样量很小，样品在流动相和固定相之间的浓度关系都呈线性，因此，分析型色谱基本上是在线性色谱范畴下工作。色谱峰符合高斯分布函数。,固定相中的浓度,流动相中的浓度,线性吸附（分配）等温线,制备色谱与分析色谱的区别,非线性色谱,在制备色谱中通常的进样量都较大。样品在流动相与固定相中的浓度关系不再是一条直线，即样品在流动相中的浓度与样品在固定相中的比例不再是正比关系，其吸附（分配）等温线会发生弯曲。,固定相中的浓度,流动相中的浓度,非线性吸附（分配）等温线,固定相中的浓度,流动相中的浓度,Langmuir,型,Anti-Langmuir,型,制备色谱与分析色谱的区别,非线性色谱的特点,色谱流出峰型不对称,对于,Langmuir,型，色谱峰出现拖尾；对于,Anti-langmuir,型，色谱峰出现伸舌。,信号,Langmuirian,型,Anti-Langmuirian,型,制备色谱与分析色谱的区别,非线性色谱的特点,色谱峰保留时间随样品量的大小而发生变化,当进样量超过一定数值后，保留时间随进样量的大小而变化，峰宽增加。,信号,保留时间,信号,保留时间,Langmuir,型,Anti-Langmuir,型,制备色谱与分析色谱的区别,非线性色谱的特点,色谱峰高与样品量的大小不呈正比关系,在非线性条件下不能用色谱峰高进行定量。,分析型,HPLC,与制备型,HPLC,的区别,分析型,HPLC,制备型,HPLC,分析柱,检测器,自动进样器,高压泵,自动进样器,制备柱,高压泵,检测器,馏分收集器,制,备色谱,的要求,制,备,色,谱,的目的,收集,样,品中指定的一,种,或,多种,成份,所,关,注的是:,纯,度(分,离,的好),数,量(制,备,容量足夠),时间,(分,离,速度快),成本(花,费,低),建立,制,备,方法,建立制,备色谱,方法:以分析柱、分析級流速來,确,定最佳流速和理想的分,离,度。,分析色谱得到的分离度越高，制备色谱的进样量就越大。,让分析柱超载，看符合设定回收率的最大进样量是多少。然后根据公式推算制备柱的进样量。这样求出的制备柱进样量应该是按照分析柱得到的结果线性放大的。最多只需要经过微小的调整。,制备色谱操作条件越简单越好。在制备色谱中不提倡采用梯度分离。因为梯度分离涉及的变量太多。一般尽量在恒溶剂条件下操作。,在进行制备色谱方法建立之前必须确保分析与制备柱来源于同一厂家，填料的规格相同。,建立,制,备,方法,分析柱,制备柱,柱子,超载进样,放大进样,计算,放大进样,计算,制备柱,超载进样,建立,制,备,方法,咖啡因,茶碱,咖啡因,茶碱,通过反相色谱柱分离两个黄嘌呤,类化合物,A-,是分析柱分离情况,B-,是通过计算得到的放大进样量,的分离情况,分析柱,SB-C18,，,150 x 3 mm,5,m,流速：,0.6 mL/min,制备柱,SB-C18,，,150 x 21.2 mm,5,m,流速：,25 mL/min,A,B,混合物的分离,制备色谱的主要目的就是要将目标化合物从混合物中分离出来。色谱过程中的分离情况常常用色谱柱的分离度来表示。分离度又称为分辨率，即,相邻两个色谱峰保留时间之差的,2,倍与这两个色谱峰的峰基宽之和的比值,：,2(T,r2,T,r1,),R,s,=,W,b1,+W,b2,R,s,=,N,4,（,-1,）,（,+1,),分离因子；,N,塔板数；,容量因子,分离度越大，相邻两个色谱峰就分得越开。,分离度与,、,N,、,有关。,上述公式反映了几种因素对分离度的影响。,增加容量因子,增加柱效,N,增加分离因子,两个组分分离峰,几种因素对色谱分离的影响,对于制备色谱而言，上述三个因素中，分离因子最为重要。分离因子越大，进样量越大。对于给定样品，分离因子的大小取决于色谱固定相和流动相的性质。,对于制备色谱而言，分离因子最为重要,一般原则,分离因子,2,，制备分离容易进行,分离因子,1.5,，制备分离可以进行,分离因子,1.3,，制备分离比较困难,分离因子,1.3,，制备分离非常困难,制 备 色 谱 柱,不同尺寸色谱柱典型的操作参数,柱内径,(mm),柱长（,cm,）,4.6 mm,9.4 mm,21.2 mm,30 mm,50 mm,5,1 mg,3-5 mg,30-50 mg,80-100 mg,250-300 mg,10,4-6 mg,15-20 mg,80-90 mg,200-250 mg,500-700 mg,15,8-10 mg,30-40 mg,140-160 mg,300-350,800-900 mg,25,12-15 mg,50-60 mg,200-250 mg,475-525 mg,1200-1400 mg,进样体积（微升）,10-20,50-75,350-400,700-800,2500-2500,流速（毫升,/,分钟）,1.0,4.2,21.2,42.5,118,-,蓝色区域表示相应直径的色谱柱大约的进样量。,-,流速是在线性范围内保持与分析柱相同的分离时间时的流速。,-,本表中的数据仅供参考。,色谱柱的种类及作用机理,GPC,RP,RP ion pair,ion pair distribution,ion exchange,normal phase(ads.),charge-transfer,salting-out,ligand exchange,chelate,affinity,chirale,Van der Waals,repulsion,London dispersion,hydrophobic,dipole-dipole,charge-transfer,H-bonds,Coulomb(ion and ion-dipole),ligand formation,complex formation,sallting-out,sterical effects,very important,significant,only important for not,entirely endcapped,phases,适当的分离方法,SiO2RP,分配,GPC/SEC,尺寸,(+)+,同系物,+(+),异构体,空间,(cis-trans),+,位置,-,+,分支,-,(+)+(+),光学,with additives or special modified phases,具有烃基取代基,(+)+,非极性,(,芳香族,双键,卤素,),+,中等极性,(,硝基,羰基,酯）,+,极性,(,酚,醇,胺,),+(+),preferably IPC,游离基,(,酸、碱,),IPC+,颗粒状态,球形,颗粒,颗粒直径,m,破碎,颗粒,1 m =10000,孔径,颗粒对色谱分离的影响,在线性流速下色谱柱填料颗,粒对分辨率的影响。,填料：,LiChrosorb Si100,n-heptane,流速：,2 mL/min,190 x 3,mm,30 m,5 m,1,2,3,t min,色谱柱填料及柱尺寸,在分析型,HPLC,中，色谱柱填料的颗粒大小是一个十分重要的参数。颗粒越小，分离效率越高。这样，就可以使用较短的柱子以提高分离速度。,在制备型,HPLC,中，颗粒的的大小同样重要。但是由于制备型,HPLC,经常使用超载进样，所以分析色谱常用的,3-5,m,的颗粒在制备色谱柱中不经常使用。其中一个原因是填料的颗粒越小，价格越高。在制备色谱中常用的填料颗粒尺寸为,7-,，,10-,，,12,m,。,色谱柱的内径和长度正比于进样量。内径越大，长度越长，可承受的进样量越大。,RP18,不等同于,RP18!,RP18,没有好坏之分,每个,RP18,固定相都有自己特定的,应用范围,Bondapak C18,Nucleosil C18,Spherisorb ODS-II,YMC ODS,Zorbax RX-C18,Supelcosil LC18,Supelcosil LC18-DB,Hypersil ODS,不对称因子,乙苯胺在不同,C18,柱上的不对称因子,由于乙苯胺的碱性特征，使之与填料上的,Si-OH,集团作用造成拖尾,RP18,不等同于,RP18!,左边,乙苯及甲苯在不同厂家,C8,固定相上的容量因子,右边,乙苯及甲苯在不同厂家,C18,固定相上的容量因子,toluene,ethyl-,benzene,制备色谱流动相,ACN,与,MeOH,比较,ACN,与,MeOH,的比较,(70%,的反相,HPLC,是使用,ACN),A,CN,的优点,-,低粘度,低压力，峰形好,-,强洗脱剂,-,空气的溶解度低,-,低,UV-,吸收,(195-200 nm),-pH,变化小,-,溶解性好,-,与水的化学结构相差较大,缺点,-,毒性,-,盐溶解度差,(,缓冲溶液,),-,旧乙腈中的杂质,(propionitrile,methacrylnitrile),如果你希望用甲醇代替乙,腈,%,甲醇,=%,乙腈,+15%,反相液相色谱中的三元流动相,MeOH/H,2,O +5-25%,ACN,选择性地加快醚类的流出,THF,选择性地加快含甲氧基化合物的流出,ACN,保留含甲氧基化合物,CH,2,Cl,2,选择性地加快含氯化合物的流出,THF,与环形化合物比较，加快含有直链化合物的流出,DMF,加快碱性化合物（芳胺，含氮杂环化合物）,+,减少拖尾,H,2,O,用于调节极性,流动相,弱流动相,强极性或溶解性差的化合物不能流出,强流动相,分辨率差，峰不能很好的分离，不能识别,混和溶剂,部分色谱得到优化,梯度洗脱,优化色谱分离，提高了分辨率并且减少了色谱时间,保 留 时 间,梯度洗脱,凸形梯度,化合物得到很好的分离,(,同样,:,凹形梯度有力于早流出化合物的分离,),线性梯度,后流出的化合物不能分离,理想的线性梯度,t,m,=,死时间,Dead time t,m,is the time at which a,non-,retarded compound is eluted.It can easily,be,determined by injecting urea,acetone or similiar compounds,.,分析色谱分离,Graph 1:Example of an analytical scout for a synthesized compound,the black chromatogram is 254 nm,and blue represents the ELSD trace under analytical conditions,the ELSD although less specific is more universal and can see peaks that may not be observed by UV or MS,4.6 x 150 mm Luna C18,2 mL/min,50 ul injection.,感兴趣化合物,Setting Collection via UV would be compromised by stronger absorbing interferents,分析系统梯度,%Organic,Minutes,制备纯化,虽然在分析色谱中得到了需要优化制备色谱的参数，在制备色谱中我们可以根据目标化合物在分析梯度条件下的流出情况重新设定制备色谱的梯度，以便得到目标化合物。,Graph 3:Based on the analytical data acquired from the scout chromatographic run,a 30-40%organic mobile phase would facilitate the optimum separation,for our compound of interest,activating a shallow gradient for the specific compound relative to all other compounds within our chromatogram allows for an easy and complete fraction collection of our compound within minimal fractions,21.5 x 50 mm Luna C18,25 mL/min,500 ul injection.,选择制备色谱梯度,流动相的纯度,进行制备型液相色谱分离时，所用溶剂的纯度很重要。即使含纯化合物的流动相溶剂中含有微量的不挥发性杂质，当大量溶剂经蒸发后，其杂质浓度就会增高。制备型液相色谱往往需消耗大量溶剂，因此应在溶剂纯度,(,和价格,!),与所用数量之间进行权衡。,流动相的纯度,1 ppm,杂质,=,1 mg,杂质,/,立升流动相,例如,:,流动相中,1 ppm,杂质,及,20 mL,馏分中有,1,mg,化合物,1/50 mg,杂质 ,98%,纯度,对于纯度要求很高的制备色谱，要求溶剂的纯度也要高,(p.a.,溶剂可能会成为主要的污染源,),制备色谱中流动相的选择,选择制备色谱流动相要考虑的几个因素,流动相有利于分析物达到最佳的选择性,流动相的光谱特征（,UV/,荧光,/,质谱）,容易从最后馏分中除去,粘度低以降低柱反压,流动相中难挥发性杂质的含量,对样品有好的溶解性,溶剂的成本,制备色谱中流动相的选择,正相色谱所使用的溶剂是符合上述要求的,反相色谱依然是许多人使用的方法,在反相制备色谱中，建议采用挥发性的缓冲溶液来调节,pH,，而不是分析色谱中的盐缓冲溶液体系。这点在使用分析色谱摸索制备色谱的分离条件时就要注意。,制备色谱中流动相的选择,缓冲溶液,pH,范围,三氟乙酸,xx 1.5,甲酸铵,3.0 5.0,甲酸吡啶,3.0 5.0,乙酸铵,3.8 5.8,碳酸铵,5.5 7.5 9.3 11.3,氢氧化铵,8.3 10.3,制备色谱中常用的挥发性缓冲溶液,制备色谱的样品进样方式,进样方式,在制备色谱中样品的进样并不只是将样品打入流动相中这么简单。,需要考虑的因素包括：,进样器的位置及峰的加宽,样品残留的产生,进样速度及容量,进样方式,部分充满样品环,全充满样品环,样品溶解性,进样针的选择,load,标准,819,841,直接进样,ZIM,进样器,进样周期短，能够收集保留时间短的组分。节省时间,没有进样口，交叉污染。对于分析、制备色谱交叉污染,n,小于,样品扩散小,标准进样模件,全充满,/,部分充满样品环进样,进样口及导管,(,连接进样口及进样阀的管路,),可能产生残留,不同的进样口用不同的进样针,(,如穿刺针等,.),进样针有弹簧确保进样针能够准确进入,能够,进样口,直接将样品注射入进样阀，没有连接导管,用于小体积样品的精确就进样,低残留量,必须使用专用进样针,(probe has to fit tightly into PEEK injection port),HPLC,进样装置,-819,优点,最常用的进样技术,.,可使用各种不同的进样针，包括穿刺针。可用 于分析及制备色谱系统。可采用全充满或半充满进样方式。进样器到色谱住的管路可以较短。,局限性,进样针的外壁与样品接触，这部分样品会残留在进样口的,O,型环上。可以通过清洗密封圈,减少残留。进样针毛刺可能会刮损密封圈。,吉尔森,231,232,233,234,SP235,849,889,进样器采用的都是相同的技术,。,ZIM,819,841,HPLC,进样装置,-841,优点,最大的优点是减少死体积。这种直接进样方式无需进样导管，直接将样品注入进样阀。这样就大大降低了残留。唯一接触到进样口的只有针尖部分。在完成进样之后，清洗上层的密封圈以除去进样口上的少量样品残留。,局限,由于,RV700-100,阀体内的管路较小，这种进样方式只是适用于分析样品的进样。同时，由于针尖与密封圈接触，这种进样方式不能使用斜口进样针及穿刺进样针。只能使用平口进样针。,这种进样技术能够用于,235,235P,SP235,及,SP235P,ZIM,819,841,HPLC,进样装置,845-Z,优点,无论是标准的还是制备型,ZIM,都是吉尔森最好的进样器。由于没有进样口，大大降低了进样残留。同时，由于机械臂无需移动到进样口进样，大大缩短了两次进样所需的时间。,局限,由于进样器是固定在,Z,臂上，进样器与色谱柱之间的管路比到检测器的管路要长。但是，这对于一般色谱分离没有明显影响。,吉尔森同时提供制备型的无进样口进样器,ZIM,。,ZIM,819,841,无进样口进样器,由于样品的溶解性差，进样口至进样阀之间的管路是产生堵塞的主要位置。,吉尔森的,845-Z,无进样口进样器由于没有进样口，样品直接吸入进样阀。,吉尔森的一个用户（礼莱）有,5,台,215-845-Z,的,HPLC,系统，连续进样,100,000,次都没有发生管路堵塞。,半充满及全充满进样方式,进样,载样,载样,进样,全充满样品环,样品量要比样品环的体积多出许多,(5,倍于样品环体积,),高精度,进样体积不能改变,部分充满样品环,精确的小体积样品量,过量的样品量小,:,进样体积,=,样品体积,+,冲洗体积,最大进样量,=,样品环的,1/2,体积,进样方式,全充满进样,在分析,HPLC,中，全充满进样是十分流行的进样技术。主要原因是进样体积可以保持很好的重现性。进样量取决于样品环的体积。但是由于内壁的摩擦力，液体流呈抛物线状。为了将样品环内的残留全部洗出，实际进样量应该是样品环的,3-5,倍。,如：如果要用,100,L,样品环进样,100,L,，你就应该进样,300-500,L,。,抛物线型流体轮廓,进样方式,半充满进样,半充满进样方式没有全充满方式精确及准确。这种进样技术的精确度及准确度取决于注射泵的精确度。然而，如果设定适当，半充满进样方式可以将几乎全部吸取的样品注入。为了达到最好的回收率，有几点需要特别注意：,保证进样程序将样品全部注入样品环，没有任何样品残留在样品输送管中。,进样体积必须小于样品环的,50%,。如果进样量大于样品环的,50%,，由于抛物线型的流体状态，样品会流出样品环。这流失的部分可以高达,30-40%,。,制备色谱进样量应该是多少,?,制备色谱的柱容量,在分析色谱中，柱容量一般定义为使柱效降低,10%,时的进样样品质量。,在制备色谱中，对柱容量的定义无需定义的十分精确。因为在制备色谱中，实际进样量可以高出其线性进样量很多。常常是数量级的差别。,制备色谱超载进样的超载程度是当无法达到预期的纯度及回收率时的进样量。,制备色谱柱的质量容量,M =,最大样品质量,C,1,、,C,2,=,常数,r =,柱半径,l =,柱长,K =,分配系数,d =,装填密度,A,s,=,填料表面积,d,p,=,填料颗粒直径,d,p,2,M=C,1,r,2,KdA,s,C,2,l,色谱柱的线性容量与色谱柱的长度及填料的颗粒大小有关。,增加色谱柱的长度及填料颗粒直径可,以增加柱容量。,制备色谱柱的质量容量,柱容量随着塔板数的增加而降低。,样品进样量,根据样品在进样溶液中的溶解度不同，进样量也会有很大的不同。,如果相对于流动相而言，进样溶液的强度太强，色谱柱就会体积超载。在进样时样品就会纵向扩散。,最佳的情况是进样溶液比流动相相对弱一些。这样，样品在进样时可以集中在柱头部分。,有许多条件会影响进样量：如样品的,k,值较高、采用梯度洗脱、样品组成成分简单则可以增加进样量；反之则要减少进样量。,制备色谱进样,Scale up,放大,Overload,超载,通过增加柱径提高样品的通量,通过超量进样提高样品通量,降低分辨率,放大制备,流速,(F),进样量,(M),进样体积,(V),分析柱,制备柱,L,ana,l,L,prep,超载进样,分析,体积超载,浓度超载,体积与浓度超载,体积超载（,Volume overload),增加进样体积将导致峰变宽，并且渐渐趋近于矩形，但是色谱峰依然保持对称。,当体积不断增大时，色谱峰会出现重叠甚至变形。,如果被分离化合物的溶解度很低，超载一般都是以增加进样体积来实现的。这种超载进样称之为体积超载：,质量超载（,Mass overload),散射效应,样品在流动相的作用下会沿着柱子散布直至与固定相充分的接触达到平衡。这种现象会导致色谱带增宽。,填料的失活,由于大量的样品进入色谱柱导致填料的活性基团被占据。从而改变了流动相的极性作用。其结果是保留时间减少。,非线性吸附等温线,由于样品浓度高，色谱峰产生拖尾,当进样的样品质量超过一定量，样品在色谱柱的浓度会很高，以至色谱平衡被破坏。这种情况称为质量超载。质量超载的情况比体积超载要复杂的多。在质量超载情况下会出现三种效应,：,填料的容量,色谱柱内经,mm,L=25 cm,填料重量,g,样品量,mg,2,0.7,ca.1.4,3,1.5,ca.3,4,2.6,ca.5,4.6,3.3,ca.6.6,8,10.5,ca.20,10,16.2,ca.30,填料的容量,进样量与分离的难易关系,a,进样量,mg/g,难分离,1.1,1,较难分离,1.2,10,易分离,2.0,100,制备色谱中的检测技术,检测器在制备色谱中的作用,绝大多数商品检测器都用于分析性工作，它们存在容易饱和的问题，并不适用于制备型分离,(,尤其是中压液相色谱分离,),。,制备型检测器监视从色谱柱分离出来的化合物并将信号传给软件及馏分收集器启动或终止馏分的收集。,液相色谱常用的检测器,UV/Vis,DAD,MS,ELSD,UV/Vis,在制备色谱中最常用的检测手段,在一至两个波长下给出化合物的相对吸光率,信号是基于比尔定律,A=,BC,A=,吸光率,=,分子在指定波长下的吸光率,B=,光程长度,C=,浓度,色谱信号取决于样品浓度及分子吸光率。,较为便宜,二极管阵列检测器,(DAD),基于紫外检测，所不同的是,DAD,可以检测全光谱,色谱信号取决于样品浓度及分子吸光率。,根据数据采集点的多少可以得到更多的色谱数据。,全光谱导致产生大量的数据需要储存及处理。,数据档案的大小取决于数据采集的速率，光谱范围及光谱的分辨率。,一般每个样品的数据大小在,3MB,至,20MB,在许多时候下，用户只使用单波长或双波长检测,比,UV/Vis,检测器贵很多,质谱检测器,提供样品的离子数据,如果样品可以离子化，就可以有效地定量分析信号的强弱取决于离子碎片的浓度,分析型,LC-MS,简单的流路,简单的系统,MS,检测器,UV,HPLC,在线离子导向纯化,直接将,MS,连接在色谱流路上进行实时检测。,可以按照指定质量数选择性地收集馏分,需要十分复杂的系统流路及十分精确的分流方案,在线离子导向纯化采用非理想的流路设计,如果分流器管路堵塞，将没有信号给馏分收集器,MS,收集 触发器,UV,FC,延滞管路,在线离子导向纯化采用理想的流路设计,MS Trigger,UV,FC,延滞管路,在线,MS,数据,每个点有一个质谱图,非在线制备,LC-MS,更加稳定的检测,将标准的分析,MS,系统加入到标准的制备系统中。,LC,软件自动将少量收集到的馏分进样到分析,MS,系统中进行分析。,非在线,LC/MS,MS,UV,收集馏分完整的质谱数据,非在线,LC/MS,没有分流器管路堵塞问题。,没有复杂的流路管道。,可以使用各种,MS,或其他分析手段,分析型,LC-MS,系统,NMR,UV/Vis,光谱,MS,质谱是真实馏分的数据，而不是有限采集点的数据,不用质谱信号收集馏分，用质谱确认收集的馏分,非在线,MS,系统示意图,制备,UV,导向馏分收集,ELSD,导向馏分收集,自动,MS,确认收集的馏分,分析,分析进样得到,UV&Mass,数据,1.,制备,UV/ELSD,导向馏分收集,322+GX281/ZIM+Valvemate#2+156UV/VIS+PrepELSD+GX281/FC,2.MS,确认制备收集馏分,322+GX281/ZIM+Valvemate#2+156UV/VIS+PrepELSD+GX281/FC,3.,分析,LC/MS+UVVIS,Surveyor LC Pump+GX281 DIM+ValveMate#1+VM#2+156UV+MSQ+,ELSD,近乎通用型检测手段，取代示差折光检测器,分析物的挥发性必须低于洗脱液,与分子吸光度及离子化无关,信号只取决于分析物的质量或浓度,没有定性数据，只有定量数据,PREPELS,TM,检测器的特点,采用热分流技术,两种设定,低位用于制备色谱样品,正常用于检测一般样品，检测限可达纳克级,目前市场上除了吉尔森,prepELSD,没有其他,ELSD,能够检测,5mg,量的样品。,吉尔森,ELSD,对于分析应用同样优秀，可以检测,25ng,的分析物。,优秀的过滤技术使得使用者可以在不影响峰高及峰形的情况下除去基线噪音。,目前市场上的其他,ELSD,也可以降低基线噪音，但是同时也降低了原有的峰高，同时会改变由来的峰形。,简单的、低维修率的分流装置适用的流速可达,75 mL/min,。,雾化管的保养维修十分方便。,倍增部件的可调校性使得每次的读数可以完全一致。,吉尔森,PrepELS,专利热分流技术得到最好的信噪比，样品量从,25ng-5mg,。,相同条件下的比较,SEDEX 75 100 ng,安息香酸钠,100%Water,Filter=2,Gain=12(maximum setting),3 injections,Gilson ELSD 100 ng,安息香酸钠,100%Water,Filter=6,Gain=Normal,3 injections,相同条件下的比较,Gilson ELSD 100 ng,安息香酸钠,100%Water,Filter Off,3-injections,ALLTECH 2000ES 100 ng,安息香酸钠,100%Water,RC Filter Off,Poor signal-to-noise and baseline drift,样品溶解性的问题,低溶解度样品,在水溶液中显低溶解度的样品在色谱中经常遇到问题。,进样器堵塞,低分辨率，低进样量,色谱柱及管路堵塞,样品的溶解度对分离的影响,如果可能，样品应该尽可能用流动相溶液或弱洗,脱强度的溶剂溶解,如果样品溶解在太强的溶剂中，就会造成色谱峰的混乱,H,2,O/CH,3,CN,100:0,H,2,O/CH,3,CN,70:30,H,2,O/CH,3,CN,50:50,H,2,O/CH,3,CN,30:70,0,4,8,min,0,4,8,min,0,4,8,min,0,4,8,min,可行的解决方法,采用无进样口进样装置,排出常见的管路堵塞,通过进样泵在样品送到色谱柱前在稀释,采用正相色谱,改变系统流动液,进样器的流动液必须与样品兼容,如果系统用与清洗进样口、管路、进样针的液体与样品不能很好兼溶，就可能造成进样口、管路、进样针的堵塞。,吉尔森新,GX-281,GX-281,无注射泵的溶液输送系统可以切换,5,种溶剂。,可以选择与样品兼溶的溶剂,无进样口进样器,由于样品的溶解度低连接进样口及及进样阀的细管路很容易堵塞。,采用吉尔森,845-Z,或,GX-281 ZIM,无进样阀,无需进样口，样品被直接吸入到进样阀的样品环中。,吉尔森用户连续进样,50,000,样品无堵塞。,GX-281 ZIM,柱前稀释,(,O,CD),流动相,柱前稀释泵,(,例如,:DMSO),排放,进样口,色谱柱,柱前稀释,(,O,CD),样品的柱前稀释,强溶剂,初始梯度混和点,样品,色谱柱,经典进样,A,B,C,D,经典进样,A,:,样品（被强有机溶剂包围）被初始梯度流动相推进，进入色谱柱。,B,:,由于洗脱强度大的有机溶剂作用，样品带在柱头扩散变宽,。,C,+,D,:,部分样品就会与样品主体分离，跟随强有机溶剂一起被冲走。,由于强溶剂的影响，导致样品的分离十分不理想，峰形会变得不好，因此进样量就会降低。,样品的柱前稀释,梯度开始的混和溶剂起点,强溶剂,样品,柱前稀释,A,+,B:,样品溶解在强溶剂中（如,:DMSO,），通过一个辅助泵经过,T,型接口进入,HPLC,柱。,T,型接口在柱子的前部，样品在这里与初始流动相（弱溶剂）混合。,C,:,混合后的溶剂的洗脱强度大大降低，因此，样品在柱头聚集。也就是说样品在柱头浓缩。,由此产生的色谱峰的峰形就会很好，这样就可以增加进样量。,column,柱前样品稀释,A,B,C,样品的柱前稀释,优点,在相同的色谱柱及流速条件下比经典进样量高,3 10,倍,样品可以完全用,DMSO,溶解,在,2 cm,色谱柱进样,1 mL DMSO,对分离没有影响,大大减少了样品在色谱柱上产生沉淀,制备色谱的馏分收集,制备色谱分离纯化的三种主要收集,主组分分离,多组分分离,微量组分分离,收集馏分方式,84,分辨率,0.4 0.5 0.6 0.7,0.8 1.0 1.25,88,92,95,98,99.4,从两个峰中间切割时得到的馏分纯度,相邻两个峰峰面积比为,1:1,时的分辨率,L.R.Snyder,J.Chromatogr.Sci.10(1972)200,中心切割收集法,中心切割收集,:,仅收集峰的中间部分，峰的开始部分及结尾部分不要。,这种收集方式的特点是组分的纯度大大提高。,进样,保留体积,中心切割收集,馏分收集方式,不要中间的混合部分收集的,A,、,B,组分的纯度大大提高。,88%,98%,在图中，大约,70%,的单一组分可以得到分离,discarded,88%,88%B,12%A,88%A,12%B,98%A,2%B,98%B,2%A,门槛（,level,）方式收集,level,开始收集,停止收集,缺点,损失组分,不能分离部分重叠的峰,level,level,在同一个峰内通过体积切割收集,在同一个峰内通过体积收集,+,收集非峰部分,+,设定每个非峰收集体积,新的馏分收集,吉尔森新的,Trilution LC,软件在确保安全可靠的收集相关组分,同时满足高纯度的要求。,峰宽,峰灵敏度,峰灵敏度及峰宽,峰,3,没有被收集，因为峰的斜率与设定三角形比较斜率太小,增加峰宽,降低峰灵敏度,增加峰宽或降低峰灵敏度，这样即便峰的斜率较小也可以被收集到,Trilution LC,的新的收集参数,前斜率,-45,灵敏度,15,后斜率,-10,灵敏度,15,共收集,yes,全部区域,从前斜率,到峰顶点,峰顶到,后斜率,前斜率,正切角度,简单,收集区域,前斜率到峰顶,从峰起点开始收集到峰顶,共收集,确定是否要检测共收集部分,收集区域,收集共流出的部分,收集区域,峰顶至峰尾,收集从峰顶至峰尾部分,后斜率,正切的角度,灵敏度,根据斜率及数据采集率自动计算,在前一个色谱图精确设定收集参数,优化馏分收集,馏,份收集器,功能,齐,全，通用性強,多,种,收集模式,适,合各,种应用,时间,模式,滴,数,模式,峰模式,手,动,模式,信,号,模式,多,种,模式,组,合,收集任何峰或任何需要收集的部分,馏,份收集器,203,B,204,PREPFC,215自,动进样,/,馏,份收集器,同一平台上,自,动,完成,样品进样,及,馏,份收集,馏分收集,样品,馏,份,制备色谱中的阀切换技术,Valvemate,II,切换阀,Trilution LC,软件控制,具有多种自动化的可能性,例如：处理故障,:,当工作色谱柱堵塞时自动切换到另一根柱,例如：色谱柱堵塞时进行反冲洗,色谱柱同时平衡,双柱选择,1,2,3,4,5,6,7000,进样器,检测器,A,B,1,2,3,4,5,6,7000,进样器,检测器,A,B,五柱选择,-,加辅路,1,2,3,4,5,6,7060,1,2,3,4,5,6,7060,进样器,检测器,辅路,/,冲洗,色谱柱,C18,C8,硅胶,SEC/GPC,多肽分离柱,或五种相同的柱,优点,无需停机更换色谱柱,增加重现性,提高色谱柱适用寿命,柱反冲洗,1,2,3,4,5,6,7000,泵,A,进样器,分离,检测器,1,2,3,4,5,6,7000,泵,A,进样器,反冲洗,检测器,反冲洗对柱子的寿命十分不利,因此较佳的方法是使用预柱，对预柱进行反冲洗,预柱反冲洗,1,2,3,4,5,6,7000,泵,A,进样器,分离,检测器,预柱,分离柱,1,2,3,4,5,6,7000,泵,A,进样器,预柱冲洗,检测器,预柱,分离柱,反冲洗对柱子的寿命十分不利,因此较佳的方法是使用预柱，对预柱进行反冲洗,预柱反冲洗的改进,1,2,3,4,5,6,7000,HPLC,色谱分离同时对预柱进行反冲洗,(,在样品通过预柱后,),分离柱,预柱,样品进样,waste,1,2,3,4,5,6,7000,HPLC,检测器,分离柱,预柱,反冲洗,(,外置泵作为进样泵,),waste,检测器,反冲洗,(,外置泵作为进样泵,),同步平衡,without SE,only 1 column,进样,进样,进样,进样,进样,平衡,平衡柱,2,分离柱,1,分离柱,2,分离柱,1,平衡柱,2,平衡柱,1,with SE,2 columns,同步平衡,Simultaneous equilibration,1,2,3,4,5,6,7000,高通量,HPLC,的切换阀,在柱,A,进行分离时，柱,B,在进行再生平衡,节省,50%,的时间,HPLC-,系统,平衡系统,1,2,3,4,5,6,7000,馏分收集器,进样阀,A,B,检测器,同步平衡,Simultaneous equilibration,1,2,3,4,5,6,1,2,3,4,5,6,1,2,3,4,5,6,1,2,3,4,5,6,1,2,3,4,5,6,1,2,4,5,6,3,HPLC,系统,平衡系统,高通量,HPLC-,系统,同时具备平衡及柱切换功能,1,2,3,4,