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硕硕硕硕 士士士士 研研研研 究究究究 生生生生开题报告开题报告开题报告开题报告5-氮杂脱氧胞苷联合放疗对鼻咽癌RASSF1A基因甲基化和表达的影响 硕士研究生开题报告硕士研究生开题报告硕士研究生开题报告硕士研究生开题报告研究生研究生 ：邓岩：邓岩导导 师：姚运红师：姚运红 副教授副教授时时 间：间：20052005年年8 8月月1919日日02膝关节周围滑膜囊的分布硕士研究生开题报告开题报告一、立题依据与研究现状二、实验目的三、技术路线四、主要实验方法五、预期结果六、经费预算七、时间安排03立立 题题 依依 据据第一部分第一部分04膝关节周围滑膜囊的分布硕士研究生开题报告立题依据RASSF1A基因RASSF1A蛋白RASSF1A基因的高甲基化与肿瘤 5-氮杂脱氧胞苷05膝关节周围滑膜囊的分布硕士研究生开题报告RASSF1A基因很早以来，医学研究人员就发现肿瘤患者3p染色体出现等位缺失的现象,（常见肺癌患者）,于是推测该区域可能存在某种抑癌基因。1998 年,Sekido等在肺癌及乳腺癌细胞系的研究中发现3p21.3存在一个120kb长的最小纯合缺少区。2000 年,Dammann等4 使用酵母双相杂交筛选的方法自该区分离出一种能与DNA修补蛋白(XPA)相互作用的候选cDNA(互补DNA),其核苷酸序列的羧基端与鼠RAS效应蛋白Nore1和Maxp1高度同源,遂命名为RAS区域相关家族1,即RASSF1基因 06膝关节周围滑膜囊的分布硕士研究生开题报告RASSF1A基因Ras基因除了具有促进细胞生长、增殖的作用外还具有一个非常重要的功能抑制细胞生长、促进细胞凋亡和衰老。RASSF1A基因可能是Ras激活信号传导通路中一个非常重要的负向调节基因,在肿瘤的发生、发展、预后等方面具有重要意义。该基因主要存在3 种不同的转录本，共同编码与Ras相关的同源区(RalGDS/AF26,RA)。这三个转录本分别是：RASSF1A、RASSF1B、RASSF1C07膝关节周围滑膜囊的分布硕士研究生开题报告RASSF1ARASSF1A 含外显子1和2,其cDNA 全长1 873 bp,含340 个氨基酸的开放读码框,编码产物为相对分子质量为38 800 的蛋白多肽,其N端与富含半胱氨酸的甘油二酯或佛波酯结合区高度同源,也被称作蛋白激酶C 保守区1(protein kinase C conserved region 1,PKCC1)。在正常组织中都有表达,但在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、鼻咽癌、肾癌等肿瘤中存在较高的表达缺失。08膝关节周围滑膜囊的分布硕士研究生开题报告RASSF1BRASSF1B 也含外显子2,但其外显子1与转录本A 不同,该转录本cDNA 全长1 664 bp,可能仅编码Ras同源区(RA)。主要表达于造血系统的组织细胞,在肿瘤中的表达缺失率不高,约37.13%09膝关节周围滑膜囊的分布硕士研究生开题报告RASSF1CRASSF1C 外显子起自1,无2,全长117 kb,编码含270 个氨基酸的蛋白,但不含PKCC1 区,相对分子质量为32 000。正常组织和肿瘤中都有较好的表达因此，RASSF1A基因可以成为一种研究的重要候选抑癌基因。表达产物是RASSF1A蛋白 10膝关节周围滑膜囊的分布硕士研究生开题报告RASSF1A蛋白RASSF1A 蛋白作为Ras 效应蛋白家族中的一员,主要以GTP 依赖的方式结合Ras 传导通路上游的Ras/GTP 而被激活发挥抑制细胞生长、促进细胞凋亡和衰老的功能。研究发现,RASSF1A 蛋白的氨基酸序列除了包含RA 区、PKCC1 区外还包含了一个ATM(ataxia telangiectasia mutated)蛋白的磷酸化位点，ATM参与细胞周期调控、有丝分裂中染色体重组、端粒长度监测及DNA 损伤细胞学反应。RASSF1A 蛋白通过磷酸化ATM 蛋白的PI3K位点活化来发挥抑制肿瘤的作用。11膝关节周围滑膜囊的分布硕士研究生开题报告RASSF1A蛋白1、RASSF1A 蛋白通过抑制Ras 激活生长效应信号的传导途径而发挥作用;另一种可能机制则是RASSF1A 蛋白的失活导致Ras 作用的失衡,使其主要发挥促进生长的作用。2、RASSF1A 蛋白可能是细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的抑制蛋白。cyclin D1 对RASSF1A 蛋白的活性非常敏感,活化RASSF1A 蛋白能明显的抑制cyclin D1 在细胞内积聚从而抑制细胞由G1 期进入S 期,对细胞增殖起负性调节作用。12膝关节周围滑膜囊的分布硕士研究生开题报告RASSF1A蛋白3、RASSF1A 蛋白在分裂间期分布在细胞微管,在有丝分裂期分布在细胞中心体和纺锤体,并最终通过细胞分化周期调控蛋白20(cell division cycle control protein20,cdc20)作用到促后期复合物(anaphase promoting complex,APC)上,抑制APC 磷酸化活性使细胞有丝分裂停滞在中后期13膝关节周围滑膜囊的分布硕士研究生开题报告RASSF1A基因高甲基化与肿瘤现已明确RASSF1A 基因在肺癌等癌症中表达失活的机制是由于其启动子区CpG岛的特异性高甲基化所致。虽然抑癌基因的失活还可由突变所致,但对该基因的研究结果表明,RASSF1A 基因的突变率在肺癌中还不及10%,而RASSF1A 启动子区发生高甲基化的比率在小细胞肺癌、非小细胞肺癌系中分别高达100%和63%,非恶性肺组织中无一例发生甲基化。研究表明：不表达RASSF1A 蛋白的A549 肺癌细胞系经甲基化抑制剂处理并重新表达RASSF1A 蛋白后,可减少其细胞克隆形成,抑制非贴壁性细胞生长;而表达RASSF1A 蛋白的裸鼠移植肿瘤较对照组的肿瘤生长明显减慢。14膝关节周围滑膜囊的分布硕士研究生开题报告RASSF1A基因高甲基化与肿瘤邵康,赫捷,程邦昌,等RASSF1 基因不同转录本在肺癌组织中的转录表达及临床意义.中华肿瘤杂志,2003,25(2):1492153.研究还发现RASSF1A 与淋巴结转移及TNM分期相关,伴淋巴结转移者或病期较晚的病例癌组织者RASSF1A 的表达缺失均显著高于无淋巴结转移者(P 0.05)及病期较早者(P 0.01)15膝关节周围滑膜囊的分布硕士研究生开题报告5-氮杂脱氧胞苷DNA甲基化修饰有多种方式，其中DNA胞嘧啶C-5位甲基转移酶(DNA甲基化酶)识别DNA的5-CG-3序列(CpG),把S腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基转移到胞嘧啶的5位,生成5甲基胞嘧啶(5mC)2。DNA甲基化抑制剂能逆转甲基化效应,包括防止甲基化CpG的突变,重激活因甲基化抑制的基因等。16膝关节周围滑膜囊的分布硕士研究生开题报告5-氮杂脱氧胞苷这些抑制剂及其作用靶点较多。其中胞苷类似物5氮杂脱氧胞苷的作用机制已很清楚,目前已进入临床实验阶段，用于白血病治疗。其他化合物大多停留在临床前实验阶段。5氮杂胞苷、5氮杂脱氧胞苷和胞苷结构类似,它们能与DNA甲基化酶共价结合,降低酶的生物 活性。但此类化合物体内体外实验均有细胞毒和致突变作用。17鼻咽癌是一种多因素参与的多基因遗传鼻咽癌是一种多因素参与的多基因遗传性疾病。然而，研究性疾病。然而，研究RASSF1A RASSF1A 基因的甲基因的甲基化与鼻咽癌的转移关系的文章不很多，基化与鼻咽癌的转移关系的文章不很多，因此，本研究旨在从一个新的角度反映因此，本研究旨在从一个新的角度反映鼻咽癌的本质鼻咽癌的本质 研究现状18膝关节周围滑膜囊的分布硕士研究生开题报告研究现状Lo KW,Kwong J,Hui AB,et al.High frequency of promoter hypermethylation of RASSF1A in nasopharyngeal carcinoma.Cancer Res,2001,61:387723881.：分析了4 例鼻咽癌移植瘤标本、4 株鼻咽癌细胞系和21 例原发性鼻咽癌标本,发现RASSF1A 基因5Cp G 岛的完全甲基化率在移植瘤中为100%(4/4),在鼻咽癌细胞系中为75%(3/4),在原发性鼻咽癌中为66.17%(14/21),在正常鼻咽上皮没有甲基化,基因突变只在原发性鼻咽癌中发现2 个,19膝关节周围滑膜囊的分布硕士研究生开题报告研究现状在有高度甲基化的细胞系和移植瘤中发现有RASSF1A 基因的高表达缺失,在用甲基化抑制剂5氮杂脱氧胞苷(52aza22,deoxycytidine)处理后,RASSF1A 基因重新表达并显著抑制细胞的生长和增殖。Chow 等将野生型RASSF1A 基因转染到RASSF1A 基因缺陷型的鼻咽癌细胞C66621 中,发现重新表达RASSF1A 蛋白的鼻咽癌细胞C66621 能显著减少其细胞克隆形成,抑制非贴壁性细胞生长。20以上资料表明：以上资料表明：1.1.RASSF1A RASSF1A 基因是鼻咽癌的一个非常基因是鼻咽癌的一个非常重要的候选抑癌基因重要的候选抑癌基因,启动子区的高度启动子区的高度甲基化至少是其失活的主要机制之一。甲基化至少是其失活的主要机制之一。（当然，基因缺失的作用不可忽视。）（当然，基因缺失的作用不可忽视。）2.2.RASSF1ARASSF1A基因表达低下是鼻咽癌的晚基因表达低下是鼻咽癌的晚期转移的重要事件，可能是伴随性改变，期转移的重要事件，可能是伴随性改变，甚至是鼻咽癌发生转移的主导因素甚至是鼻咽癌发生转移的主导因素 21第二部分第二部分实验目的22实验目的实验目的1.1.RASSF1A RASSF1A 基因的基因的高甲基化和高甲基化和RASSF1A RASSF1A 基因的表达在鼻咽癌转移基因的表达在鼻咽癌转移方面有无统计学意义方面有无统计学意义 23实验目的实验目的2.2.通过通过5 5-氮杂脱氧胞苷氮杂脱氧胞苷联合放疗对联合放疗对RASSF1A RASSF1A 基因基因的表达的影响，研究该药的表达的影响，研究该药物、放疗各自的疗效和联物、放疗各自的疗效和联合疗效合疗效 24第三部分第三部分技术路线25鼻咽癌细胞系接种裸鼠鼻咽癌细胞系接种裸鼠RASSF1ARASSF1A基因甲基化水平及其在鼻基因甲基化水平及其在鼻咽癌细胞系表达咽癌细胞系表达5 5-氮杂脱氧胞苷处理氮杂脱氧胞苷处理 检测检测RASSF1ARASSF1A基因甲基化水平基因甲基化水平 分析比较其差异性分析比较其差异性 RASSF1ARASSF1A基因及蛋白表达基因及蛋白表达放疗放疗空白对照空白对照5 5氮杂脱氧胞苷联合放疗氮杂脱氧胞苷联合放疗鼻咽癌组织鼻咽癌组织正常组织正常组织免疫组织化学免疫组织化学检测检测RASSF1ARASSF1A蛋白蛋白26主要实验方法主要实验方法v（一）甲基化特异性PCR（MSP）v MSPMSP法法原原理理:单单链链DNADNA的的胞胞嘧嘧啶啶(C)C)可可被被亚亚硫硫酸酸氢氢盐盐脱脱氨氨基基转转变变为为尿尿嘧嘧啶啶(U),U),而而5 5 甲甲基基胞胞嘧嘧啶啶(5(5 mC)mC)则则不不能能被被修修饰饰,仍仍保保持持为为5 5 甲甲基基胞胞嘧嘧啶啶(5(5 mC),mC),根根据据5 5 甲甲基基胞胞嘧嘧啶啶与与胞胞嘧嘧啶啶修修饰饰后后的的不不同同,发发生生甲甲基基化化与与未未发发生生甲甲基基化化DNADNA的的上上游游引引物物之之间间的的差差别别为为胞胞嘧嘧啶啶(C)C)变变为为胸胸腺腺嘧嘧啶啶(T),T),下下游游引引物物的的差差别别为为鸟鸟嘌嘌呤呤(G)G)变变为为腺腺嘌嘌呤呤(A)A)。据据此此设设计计甲甲基基化化(p16m)p16m)等等位位基基因因特特异异引引物物和和非非甲甲基基化化(p16u)p16u)引引物物,用用这这两两对对引引物物对对同同一一模模板板进进行行扩扩增增来来检检测测待待扩扩增增片片段段的的甲甲基基化化状状况况。能能用用p16mp16m引引物物扩扩增增的的,说说明明了了该该扩扩增增片片段段已已发发生生了了甲甲基基化化,能能用用p16up16u引引物物扩扩增增的的,说说明明了了该该扩扩增增片片段段没没发发生生甲甲基基化化,如如用用两两对对引引物物都都能能扩扩出出,则则说说明明了了该该扩扩增增片片段段存存在在部部分分程程度度的的甲甲基基化化。本本研研究究所所扩扩增增的的片片段段位位于于启启动动子子和和第第一外显子一外显子,其引物序列见表其引物序列见表v -27膝关节周围滑膜囊的分布硕士研究生开题报告（一）甲基化特异性PCR（MSP）v 引物引物序列 bpv p16m(上游)5 TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC 3150v p16m(下游)5 GACCCCGAACCGCGACCGTAA 3 150v p16u(上游)5 TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT 3 151v p16u(下游)5 CAACCCCAAACCACAACCATAA 3 151vPCR:反应总体积50l,包括经亚硫酸钠修饰后的模板DNA约50ng,引物各300dNTP1.25mmol/L,1.25UDNA聚合酶,1*v PCR缓冲液(16.6mmol/L硫酸铵、67mmol/L Tris HClpH8.8、10mmol/L2-巯 基 乙 醇67mmol/LMgCl2)反应条件为95热启动15m,然后于9530s、6030s、7230s各循环35次,最后于72延伸10min,同时以正常人外周血淋巴细胞(PBI)DNA作为阴性对照3,以水作为空白对照。取扩增产物于2%琼脂糖凝胶中电泳,凝胶成像系统观察,拍照。28主要实验方法主要实验方法v（一）逆转录一）逆转录PCRv1 1、抽提鼻咽组织和鼻咽癌细胞株总抽提鼻咽组织和鼻咽癌细胞株总RNARNA，4242o oC C完成完成v2 2、引引物物OligoOligo（dTdT）1515：正正义义引引物物5 5-TCTGGGGCGTCGTGCGCAAA-3TCTGGGGCGTCGTGCGCAAA-3;反反义义产产物物5 5-GAACCTTGATGAAGCCTGTG-3GAACCTTGATGAAGCCTGTG-3v3 3、内对照：甘油醛内对照：甘油醛-3-3-磷酸脱氢酶（磷酸脱氢酶（GAPDHGAPDH）v4 4、扩扩增增产产物物在在10%10%聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳，溴溴化化乙乙啶啶（小小心心，强烈致瘤剂）染色强烈致瘤剂）染色v5 5、测测定定RASSF1ARASSF1A和和GAPDHGAPDH基基因因产产物物条条带带吸吸光光度度的的相相对对比比值值。该该比值表示比值表示RASSF1ARASSF1A基因的相对表达强度。基因的相对表达强度。-29主要实验方法主要实验方法v5 5氮氮杂杂脱脱氧氧胞胞苷苷 5 5 aza aza CdR1.0CdR1.0mol/Lmol/L（可可以以采采用用的的浓浓度度分分别别为为0.1,0.5,1.0,2.0,5.00.1,0.5,1.0,2.0,5.0mol/Lmol/L）v免疫组织化学技术免疫组织化学技术v放疗放疗v DT36Gy/18DT36Gy/18次次30第四部分第四部分预期结果311.1.未用未用5 5 氮杂脱氧胞苷与放疗前测甲基化氮杂脱氧胞苷与放疗前测甲基化正常组织程度低，鼻咽癌组织甲基化程度正常组织程度低，鼻咽癌组织甲基化程度高，能与转移能力正相关高，能与转移能力正相关322 2.未用未用5 5 氮杂脱氧胞苷与放疗前测氮杂脱氧胞苷与放疗前测RASSF1ARASSF1A表达正常组织高，鼻咽癌组织低，表达正常组织高，鼻咽癌组织低，表达能力与转移能力负相关表达能力与转移能力负相关333.3.用用5 5 氮杂脱氧胞苷与放疗后氮杂脱氧胞苷与放疗后 34膝关节周围滑膜囊的分布5 氮杂脱氧胞苷与放氮杂脱氧胞苷与放疗组疗组5 氮杂脱氧胞氮杂脱氧胞苷组苷组放疗组放疗组空白对照组空白对照组RASSF1A较高较高较高低甲基化较低较低较低高35第五部分第五部分经费预算36编编号号项目项目经费经费(元元)1RT-PCR RT-PCR 与与MSP MSP 12000元元2免疫组织化学免疫组织化学 3000元元3细胞培养基本材料及裸鼠细胞培养基本材料及裸鼠 7000元元4放射材料和药物、器材等放射材料和药物、器材等 2000元元合计：合计：24000元元具体花费视实验情况决定具体花费视实验情况决定37时间安排20052005、111120062006、完成临床资料的收集及实验准、完成临床资料的收集及实验准备工作（技术准备，预实验）备工作（技术准备，预实验）；20062006、3 320072007、3 3 完成鼻咽癌细胞的氮杂脱氧完成鼻咽癌细胞的氮杂脱氧胞苷与放疗处理并测定甲基化胞苷与放疗处理并测定甲基化 、RASSF1ARASSF1A表达表达 ；整理数据，进行统计学分析整理数据，进行统计学分析 20072007、4 420072007、5 5 撰写毕业论文，准备答辩撰写毕业论文，准备答辩38