地中海贫血的研究进展.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,地中海贫血诊断和治疗的进展,中山大学附属第二医院儿科,李文益,发病率,(,含杂合子,),：,全世界约,1.5,亿人携带血红蛋白病基因,全国,：异常血红蛋白,0.33%,-,地贫,2.64%,-,地贫,0.66%,广东：,-,地贫,7.3%(9.64%),-,地贫,1.83,3.36%(3.54%),广西：,-,地贫,14.9%,继发性,-,地贫,遗传学,珠,蛋白基因簇位于,16,号染色体上,珠,蛋白基因簇位于,11,号染色体上,IVSI,IVS ,16,号染色体,5,3,1 31 32 99 100 141,5 3,1,2,1,Kb 0 10 20 30,IVS,IVS ,11,号染色体,5,3,1 30 31 104 105 146,5,3,2,G A ,1,kb,0 10 20 30 40 50 60,缺失型,-,地贫,全世界缺失型已达,31,种,其中,4.2,(,左侧缺失,),和,3.7,(,右侧缺失,),缺失型是遍布全世界的类型，其余突变则随地理和人群分布的不同而异。,在我国，除上述二种缺失外，尚有,SEA(,缺失,20kb),、,THAI(,缺失,31kb),、,FIL(,缺失,30,34kb),和,2.7,等。,非,缺失型,-,地贫,目前已报道,42,种,包括启动子突变、剪接点突变、移码突变、无义突变、终止密码子突变、核苷酸信号位点改变等,中国人非缺失型：,HbCS,终止密码子突变,2,TAACAA,HbQO,2,CD125,(,Lcu,Pro),其他：,Hb,Duan,，,Hb,westmead,Hb,Hekinan,HbH-CD30,HbH-CD31,HbH-CD59,获得性,-,地中海贫血,继发于恶性血液病,/MDS,机制：,acquired deletion of the-,globin,gene cluster limited to the,neoplastic,clone,more commonly,inactivating somatic mutations of the trans-acting chromatin-associated factor ATRX,which cause dramatic down-regulation of-,globin,gene expression.,-,地贫,以点突变为主，少数为缺失所致,全世界报告突变类型,170,，中国,28,种,中国常见类型：,(9,省区检测资料,),CD41-42(41.6%),、,IVS-654(21.8%),CD17(18.0%),、,TATA-nt-28(8.0%),CD71/72(+A)(3.9%),、,TATA-29(1.2%),CD26(HbE),诊断,临床表现,地贫：,轻型常无临床症状或轻微贫血。,重型患者在婴儿期出现慢性进行性贫血、轻度黄疸（间歇性）、肝脾肿大；常有发育不良和骨骼改变，出现地中海贫血面容。,中间型多在幼儿期出现贫血，其症状比重型轻。,地贫：,静止型无临床症状，,轻型常无临床症状或轻微贫血。,中间型（,HbH,）,多在幼儿期或以后出现贫血、黄疸、肝脾肿大；感染常使贫血加重甚至出现溶血危象。,重型多出现死胎或胎儿水肿综合征。,实验室检查,血象：贫血为小细胞低色素性，,MCV,80fl,，,MCH,28pg,，,MCHC,32%,。,网织红细胞正常或增高。外周血细胞涂片染色示红细胞大小不等，中央浅染色区扩大，出现异型、靶形、碎片红细胞和有核红细胞、点彩红细胞、嗜多染性红细胞、豪,-,周小体等。,地贫筛查：,地贫,5,项：溶血度（脆性），正常值：,60%,；,HbF,；,Hb,电泳：,HbA2,HbH,；,红细胞形态（参见上）；,ZPP,，,以排除缺铁性贫血,地贫,6,项：溶血度（脆性）；,Hb,电泳,；,HbF,；,HbA2,；,MHb,；,G6PD,活性。,-,地贫的,基因诊断,缺失型：,Southern,印迹杂交,限制性酶谱分析法,：,主要用于较大片段缺失,PCR,法：,跨越断裂点的,PCR,扩增法,(gap-PCR),：,可诊断、区分,地贫,1,纯合子和杂合子,由,gap-PCR,衍生的多重,PCR,：,一次,PCR,扩增能,够明确缺失突变形成的各种,地贫基因型,或临床类型。,非缺失型,Southern,印迹杂交诊断法,PCR-,酶解法：,扩建酶切点法：,PCR-ASO,其他方法：聚合酶链反应结合单链构象多态性分析（,PCR-SSCP,）,和变性梯度凝胶电泳（,DGGE,）,也曾用于,地贫点突变的基因分析，一般多用于点突变的研究而不是基因诊断和产前诊断。,-,地中海贫血的基因诊断,PCR,结合,ASO,探针斑点杂交技术,扩增不应突变系统法（,ARMS,法,）,DNA,芯片技术（,DNA chip,）,反向点杂交（,Reverse dot blot,RDB,）,-,地贫的鉴别诊断,与小细胞低色素性贫血的鉴别,缺铁性贫血,感染或炎症性贫血,肺含铁血黄素沉着症,铁粒幼红细胞性贫血,铅中毒,铜缺乏,先天性转铁蛋白缺乏症,缺铁性贫血,多于,6,月,2,岁发病，无家族史,不当喂养史,无溶血证据，网织红,N/,SI,、,TS,、,SF TIBC,、,FEP,骨髓内、外铁减少,慢性感染性贫血,有感染、炎症史及相应临床表现,贫血有时仅为小细胞性,无溶血，网织红,N/,SI,、,TIBC,、,TS,，,SF,、,FEP,铁粒幼细胞,，外铁,铁,粒幼,红细胞性贫血,顽固贫血，铁剂治疗无效，个别病例母,系,B,6,治疗有效,无溶血，网织红,N/,BM,、,外铁，铁粒幼红，可见环状,铁粒幼红细胞,SI,、,SF,、,FEP,、,TIBC N/,肺,含铁血黄素,沉着症,发作性苍白，无力，咳嗽，痰中带血,X,线胸片肺野中可见网点状阴影,痰和胃液中可找到含铁血黄素细胞,小细胞低色素性贫血，网织红,SI,、,TS,、,TIBC,SR,铅中毒,红细胞中可见嗜碱性点彩,长骨,X,线改变,FEP,铜缺乏性贫血,脂溢性皮炎，皮肤毛发色素少 浅表静脉扩,张，自发性骨折 精神障碍,贫血、,WBC,，,血铜蓝蛋白,转铁蛋白缺乏症,自幼 贫血，,1,岁时贫血严重,肝脾轻度大，铁剂治疗无效,网织红，,BM,内、外铁,SI,、,TIBC,、,TS,、,SF,其他：,Coombs,阴性自溶,*,地中海贫血的预防,人群普查,遗传咨询,产前诊断,治 疗,红细胞输注和去铁治疗,本疗法仍是最基本治疗方法,高、中量输血配合铁螯合剂,能活到成年并达到正常人的生活能力,缺点：,需终身治疗，费用昂贵,易出现输血副反应，尤其是输血传染病等,红细胞输注,低量输血法：目前已不用此法,中量输血法,(moderate transfusion),维持输血之前的,Hb,浓度,90,105g/L,高量输血法,(,hypertransfusion,):,维持输血前,Hb,100g/L,超量输血法,(,supertransfusion,),：,维持输血前,Hb,120 g/L,红细胞输注,每次输浓缩红细胞,10,20ml/kg,每,2,4,周,1,次,使输注后,Hb,浓度达,130,135g/L,无论何种方法，每次输注之后,Hb,不能超过,150g/L,浓缩红细胞输注速度应,4,5ml/,（,kgh,）,重度贫血者输注的速度应更慢,2ml/kg h,）,去铁治疗,铁螯合剂 去铁胺,(,deferoxamine,DFO,),过早使用（岁）可产生骨骼畸形、生长抑制等副作用，在规则输血年或输红细胞,10,20,单位之后进行铁负荷的评估,铁负荷的评估方法：,测定血清铁蛋白,(SF),简便可行，但影响因,素 较多；,肝穿刺后测定肝组织的铁含量，此法较准确,但属损伤性检查，一般医院难于实行；,影像学方法如,MRI,，,此法虽简便但准确度,不够且费用高,如有铁超负荷，则开始使用铁螯合剂,(3.2mg/g,干肝组织或血清铁蛋白,DFO,剂量,20,60mg/kg.d,，,每周应用,5,6,天,长期应用以控制铁蛋白在,1000,2000g/L,之间为 理想，采用连续皮下注射,12,小时，,或持续静脉滴注,8,12,小时等方法,缺点是使用较麻烦,病儿依从性差，如使用,不当,(,铁负荷轻而用大剂量,DFO,）,可致白,内障、听力丧失、长骨生长障碍等副 作用,口服铁螯合剂,deferiprone(L1),化学名羟基吡啶,1,，二齿状分子结构,以,3:1,与,Fe,3+,结合，结合效率差些,吸收快，迅速转化成活性形式，排泄快,1984,年,临床实验，,1995,年上市,(,卬度,),常用量,75mg/kg.d,短期疗效较差，长期疗效仍有争议,副作用：关节痛、,(,常见,),粒细胞减少,(,严重,),、锌缺乏、胃肠反应、肝功能异常,ICL670,三齿状分子结构三氮唑化合物,以,2:1,与,Fe,3+,结合,吸收快，在血循环中存活几小时,效果为,DFO,的,5,倍，,L1,的,10,倍,剂量,20mg/kg.d,副作用：胃肠反应，皮疹。肝肾功能无影响。动物实验肾小管上皮细胞有改变,(,非铁超负荷,),造血干细胞移植（,HSCT,）,是目前能够根治重型,地贫的一种治疗方法,HSCT,分为骨髓移植,(BMT),、,脐血移植,(UCBT),和外周血干细胞移植（,PBSCT,）,胎儿期予,HSCT:,宫内造血干细胞移植,(IUSCT),BMT,治疗重型,地贫,1982,年首例成功,至今全世界应用已达,1000,余例,长期生存率达,80,供体来源困难，费用昂贵血,UCBT,治疗重型,地贫,1989,年首例,UCBT,治疗范可尼贫血成功,1995,年泰国治疗,HbE,地贫获得成功,1998,年,1,月中山二院在内地开展首例,不少医院开展，总数已超过,100,例,由血缘相关发展至无血缘相关,HLA,位点由全相合发展至,1,3,个位点不合,异基因外周血干细胞移植,(,Allo,-PBSCT,）,1989,年治疗,1,例慢性白血病取得成功，血细胞分离机从外周血可采到足够的造血干细胞供者无需麻醉，安全,PBSCT,治疗地贫国外从,1996,年开始，香港,1998,报告例，内地,1999,年中山二院首例，各地陆续开展,宫内造血干细胞移植,国外于,1996,年开始报告，但至目前仅数例,国内尚未开展,基因治疗,根治性基因治疗,（基因矫正治疗）,基因矫正治疗是把正常的目的基因导入体内，并达到适当、有效、持久的表达，以完全取代原来的病态基因,地贫是,珠蛋白基因的单基因缺陷遗传病，理论上是基因治疗最理想的模型,1984,年开始基因治疗的研究，进展缓慢，其原因之一是载体问题，二是转导的,珠,蛋白基因片段的大小。,珠蛋白基因族,非常庞大，调控也非常复杂,珠蛋白基因组,上游基因调节元件即,位点调控区,(locus,control region,LCR),的,DNase,敏感（,hypersensitive,HS,）,片段（包括,HS2,、,HS3,、,HS4,）,对转导后的基因表达非,常重要。,逆转录病毒载体,常用癌瘤逆转录病毒（,onco,-retroviral vector,）,携带,珠蛋白基因及其调节元件,将人珠蛋白基因导入小鼠红白血病,(MEL),细胞进行培养,可成功表达,珠蛋白,在小鼠动物模型上将,基因通过逆转录病毒载体转染鼠造血干细胞,在受体红细胞中获得表达。将人,珠蛋白基因导入,地中海贫血小鼠体内,其症状可获得部分改善,逆转录病毒载体有如下缺点：,载体的容量有限（仅,7kb,左右），无法完全包含,珠蛋白基因组及其上游,LCR,片段，因而表达效价低和不稳定；,不能转染静止期细胞；病毒随机插入靶细胞的基因组中可使插入点附近的基因表达失控，插入的基因也有可能不恰当的表达；病毒可能感染宿主；致癌作用，动物实验已发现淋巴瘤发生,。,慢病毒（,lentivirus,）,载体,优点是：载体容量大，能包含大片段的,珠蛋白基因组及其上游调节元件，保证,珠蛋白基因的高效、稳定表达；可以转染静止期细胞,并能永久表达。,常用的是,HIV-1,为基础的慢病毒载体。,2000,年,May C,等首次应用携带有大片段的调节序列的人的,珠,蛋白基因,慢病毒载体转染小鼠骨髓细胞，人的,珠,蛋白基因有效、准确的整合到宿主,DNA,中，并能高效表达，合成正常血红蛋白可达,17-24%,，达到治疗,地中海贫血小鼠的目的。文章发表在,Nature,Pawlin,等（,2001,）、,Imrens,等（,2002,）、,Persons,等（,2003,）、,Levasceur,等（,2003,）、,Rivella,等（,2003,）报告采用同样载体，在中间型,地贫鼠（,Hbb,th3/+,）,模型中显示每拷贝载体可使,Hb,增加,1.1,2.3g/dl,，,血液参数明显纠正,红细胞形态明显好转。,以上用的,Hbb,th3/+,鼠为中间型鼠,为了更接近人重型,地贫，,Rivella,等建立了重型,地贫鼠模型。这种鼠如不治疗将在,6,8,周内死于严重贫血（,Hb2,3g/dl,）,用上述载体基因转导后则转变为中间型地贫鼠。由此提示治疗人重型,地贫时，采用这些载体转导,或,珠蛋白基因还需要更高的表达。,位点独立性表达（,position independent expression,）：,在鼠的研究中还发现一个特征，尽管包含了,或,珠蛋白基因的调节元件，但,或,珠蛋白的表达在不同的鼠之间差异很大,鸡,HS4(cHS4),具染色质隔离成分（,chromatin insulator element,），,在癌瘤逆转录病毒载体中已发现可减少位点作用差异（,position effect variegation,PEV,）,cHS4,元件具有阻断增强子活性作用，可能有较好的载体生物安全性，对克服载体的致癌作用很重要。,Puthenveetil,等报告采用慢病毒载体，所包含的,珠蛋白基因族中加入,cHS4,染色质隔离成分,修正后的人,地贫,CD34,细胞在细胞培养中得到一致的红系分化和纠正异常的,地贫特征，移植入免疫缺陷鼠后，,3,4,个月后仍是红系正常分化。,基因调控治疗,是广义的基因治疗,机理是根据,地贫的病理生理基础是,链和非,链合成速率的不平衡，药物来激活,非,链珠蛋白基因的功能，增加非,链珠蛋白的合成速率；或抑制,珠蛋白基因功能，降低,珠蛋白的成速率的合成速率；减轻,和非,珠蛋白的失衡程度减轻临床症状,基因调控治疗主要有,：,药物基因调控治疗；,反义核酸性基因调控治疗；,造血生长因子治疗。,中药治疗,药物基因调控治疗,1982,年首先报告应用,-,氮胞核苷,许多药物，如羟基脲、丁酸盐、阿糖胞苷、马利兰、雷米封等都有研究报告,羟基脲（,HU,）,的研究报告最多，效果也较好,羟基脲（,HU,）,是抑制二磷酸核糖核苷还原酶的,S,期特异性细胞毒药物，一种相对低毒、有效的,珠蛋白基因激活剂，,动物实验和临床应用中被证实确有诱发,HbF,合成增加，,长期应用于,SCA,和部分,地贫病人中取得良好疗效。,HU,能增加,、,珠蛋白链的合成,HU,治疗中间型,地贫效果明显,丁酸类药物,主要包括丁酸钠、正丁酸、,-,氨基酸丁,在正常人体、地贫、和,SCA,病人的造血干细胞,培养中可大量产生,HbF,具有低毒性，但半衰期极短,探索更稳定的丁酸衍生物。,反义核酸治疗,是能抑制基因表达的,RNA,，,一段与靶基因互补的序列与靶基因的,mRNA,结合形成反义,NA-,靶,RNA,聚合体从而影响靶,RNA,的功能,部分,地贫病人是由于转录过程中错误剪切造成,利用反义核酸技术可封闭前,mRNA,上的错误剪切位点,从而产生正常的,mRNA,和,珠蛋白链,多肽核酸（,PNAs,）,是一种多肽骨架的核酸模拟物，具有与天然,DNA,分子相似的结构，与靶基因形成二聚体和三螺旋结构,PNAs,与,DNA/RNA,结合的亲和力强，特异性和化学稳定性高，不易被核酸酶和蛋白酶降解，且合成简单,造血生长因子治疗,重新激活,HbF,的作用仍有争议,能刺激,Hb,生成，但反应程度差异很大。,目前单独应用疗效不明显，且价格昂贵,常与,HU,等联合应用,利用基因转导技术通过诱导,地贫鼠分泌,EPO,取得良好效果,中药治疗,中药“益髓生血灵”治疗,地贫，,Hb,、,HbF,、,网织红细胞升高，减少输血,能促进红细胞生成素和造血生长因子的释放，,提高珠蛋白链,/+,比值，,再见,