细胞工程的理论基础.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第二章 细胞工程的理论基础,山东师范大学生命科学学院,动物细胞与组织培养,（cell and tissue culture）是动物细胞工程的重要技术基础。,动物的细胞与组织培养,是指从活的机体中取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术。,组织培养的概念,组织培养这一名词实际上是一个通用名词，习惯上泛指所有的,体外培养,。根据培养物的不同可概括为三个不同概念：细胞培养、组织培养和器官培养。,A：细胞培养：,将组织块用机械方法或酶解法分离成单个细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单层细胞生长，或在培养液中呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养。,B：组织培养：,将活体的一小片组织放在盛有培养液的玻璃或塑料培养器皿中，待组织块粘着后，沿底面平面移动生长的过程称为组织培养。,从组织块中生长出来的仍然是细胞，细胞在生长的同时也发生移动，至使组织培养难以长时间维持其原有结构，结果也就成了细胞培养。,C：器官培养：,是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整个器官在体外存活、生长，并保持其原有结构和功能的培养技术。,体外培养的种类,二、细胞培养的现实意义,生物技术上：,生产各种生技术产品如：狂犬病、小儿麻痹,症等病毒疫苗，表皮生长因子及干扰素、白,细胞介素等生长因子及单克隆抗体等。,科学研究上：,在病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等方面。,临床医学上：,胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某些疾,病的治疗等,三、细胞培养的优点,1.研究的对象是活细胞,在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可,长时间监控,、检测甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括,活细胞,的形态、结构、生命活动等。,2.,研究条件可以人为控制,可以根据需要，控制包括pH、温度、氧气、二氧化碳、张力等物理化学的条件，同时，可以施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。,3.研究的样本可以达到比较均一性,通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要时，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。,4.研究内容便于观察、检测和记录,采用各种研究技术、记录方法：,研究:倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流,式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原,位杂交、同位素标记-,记录:摄影照片、缩时电影、电视,-,5.研究的范围比较广泛,学科多,：,细胞学、免疫学、肿瘤学、生物化学、遗传学、分子生物学等,对象广,：各种动物：低等动物-高等动物-人类 一种动物：不同年龄-不同组织-正常或异常（肿瘤-）,6.研究的费用相对较经济,可提供,大量,、,同一时期,、,重复性好,的、,生物学性状相似,的实验对象,四、细胞培养的缺点,现人工模拟体内环境的技术已经很高,但,人工所模拟的条件,与,体内,实际情况 仍,不完全相同,.当细胞被置于,体外培养,后,生活在缺乏动态平衡的环境中,久了，必然,发生变化,.,因此，对于体外培养的细胞，应该把他们视作一种,既能保持动物体内原细胞一定的性状、结构和功能,又具有某些改变的特定的细胞群体,，而不能将之与体内的细胞完全等同。,五、细胞培养的工作原则,有标准化的工作方法,培养用的液体极多（如培养液、胰蛋白酶、HANKS液及,抗菌素等），应由专人负责，并保证做到按规程行事，配制浓度准确，灭菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与否和制备日期等。,一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分开，已消毒品与未消毒品应分别存放。,第二节,组织培养的细胞生物学,一、体内外细胞的差异和分化,（一）体内外细胞的差异,培养细胞最多见的表现是：失去原有组织结构和细胞形态，分化减弱或不显，出现类似“反祖”现象；表现为细胞趋单一化，或获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。,1.,与体内主要不同,相对,孤立,、相对单一,缺乏体内的,系统作用、失去神经体液的调节 和细胞相互间的,影响,2.,主要表现,失去原有组织结构和细胞形态,分化减弱或不显,细胞趋向,单一化,；,3.,提示,要正确认识,体外培养细胞 是一种特定条件下生长的细胞群体。,（二）培养细胞的分化,1不适应(Deadaption)：,表现为，细胞在原体内时所拥有的分化特性减弱或不显，如肝细胞产生酪氨酸转移酶(Tyrosine Aminotranserase)特性的丧失.,2脱分化或去分化(Dedifferentiation),细胞也可能出现脱分化或去分化，即细胞失掉发生分化的能力。,二、培养细胞形态分类,体外细胞培养物的生长类型,按生长方式,:2,型,粘附型,细胞,:,附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。,悬浮型,细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。,绝大多数,有机体细胞,属粘附型,细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。,贴附(粘附)型细胞,粘附,:是大多数有机体,细胞,在体内,生存,和,生长发育,的,基本存在方式,含义,两,方面,结果,基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须,粘附,于一,固相表面,才能,生存,和,生长,。,培养时,：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，因而,属于粘附型细胞,。,粘附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有粘附于固相表面才能生存的细胞,类型,细胞在体内、外,的,粘附,方式,：,存在差异,体内,：,粘附,是,全方位,外形,具有,复杂的立体特征,体外,：,多数情况，细胞只有,一个附着平面,外形,一般,与体内时明显不同,按照培养细胞粘附生长时的主要形态，可分为,几大类型,分类,根据形态大致的不同，主要2类：,上皮细胞型,成纤维细胞型,其它，不定型,上皮细胞型,名称：,仅形态上似体内,，实际上不完全等于-,来源：,来源于外胚层,，内胚层细胞,如：皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性肿瘤,形态：,类似,体内的,上皮细胞,扁平,，,不规则多角形,，中有圆形核,生长特点,易相连,成片,相靠,紧密相连,成薄层,铺石状,生长,时呈,膜状,移动,很少,脱离细胞群而,单个活动,体外培养细胞类型（1）上皮细胞型,成纤维细胞型,名称：,凡在,培养中形态与成纤维细胞类似,的,来源：,由,中胚层间充质组织起源,的组织,如：真正的成纤维细胞,心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮,形态：,似体内成纤维细胞,的形态,胞体梭形,或不规则三角形,胞质向外伸出,23,个,长短不等的突起,中有卵圆形核,生长特点,排列成,放射状,，漩涡状,并不紧靠连成片,，,细胞细胞接触易断开而,单独行动,游离的,单独的,成纤维样细胞，常有几个,伸长的细胞突起,体外培养细胞类型（2）成纤维细胞型,贴附生长型-类型,1.,与体内,同名的,细胞,不完全相同,如：,形态相似,的成纤维细胞，,可不同来源,自同一动物不同组织的成纤维样细胞相似但,发展趋向不同,2.,培养细胞的,形态不稳定,条件改变,，细胞形态,可有变化,培养细胞形态不稳定,血清,Hela,高血清,低血清,成纤维细胞样 上皮样细胞,pH,Hela,太酸或太碱,标准,pH,成纤维细胞样 上皮样细胞,细胞密度,3T3,低密度,高密度,成纤维细胞样 上皮样细胞,生长状态改变 悬浮或贴附,悬浮,贴附,圆形 成纤维或上皮样,转化与否,未转化,转化后,成纤维样 可成上皮样,悬浮生长型,概念,培养时,不贴附于底物而呈悬浮状态生长,或以机械方法使保持悬浮状态下生长,来源,自,血,，,脾或骨髓，尤以血中白细胞,癌肿细胞也可能,特点,在,悬浮中生长良好,细胞,圆形,，单个或小细胞团,优点,生存空间大，,提供数量大,传代方便,(不需消化),易于收获,可获得稳定状态,缺点,观察不方便,很多细胞不能,悬浮生长(尤以正常细胞),三、培养细胞的生长特点,（一）贴附,（二）接触抑制,（三）密度抑制,四、培养细胞的生长和增殖过程,（,一）组织培养细胞生命期(Life Span of Culture Cells),所谓,培养细胞生命期,，是指细胞在培养中持续增殖和生长,的时间。包括原代培养期、传代培养期及衰退期。,正常培养的细胞周期,原代培养(Primary Culture)期,也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一,次传代阶段，一般持续1-4周。,特点,：,细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。与,体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。,传代期,特点,：在全生命期中此期的持续时间最长，细胞增殖旺,盛，并能维持二倍体核型。,传代,：体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。初代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。,衰退期,特点,：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，,最后衰退凋亡。,（二）体外培养细胞一代生存期,潜伏期,指数增生期,停滞期,所谓细胞的“一代”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。,（三）单个细胞的生长过程,五、体外培养细胞的遗传学特征,（一）核型变化,（二）永生化和恶变,（三）细胞性别,六、体外培养细胞的生存环境,（一）无污染环境,（二）温度,（三）气体环境和氢离子浓度,七、体外培养细胞生存所需基本物质,（一）糖,（二）氨基酸,（三）维生素,（四）促生长因子,（五）其它物质,第三节 建立细胞系或细胞株,一、体外培养细胞的种类和命名,（一）初代培养,初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、,组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代,培养(5ubculture)的细胞，便不再称为初代培养，而改,称为细胞系。,（二）细胞系,初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。,有限细胞系,无限细胞系,(三)克隆细胞株,从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养,或通过筛选购方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细,胞株。,(四)二倍体细胞,培养细胞染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数,相同或基本相同(2n细胞占75或80以上)的细胞群，,称二倍体细胞培养。二倍体细胞在正常情况下具有限,生命期，故属有限细胞系。,(五)肿瘤细胞系或株,是现有细胞系中最多的一类，我国已建立细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈上皮细胞型，常已传几十代或百代以上，并并具有不死性和异体接种致瘤性。,对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称；细胞的命名无严格统一规定，大多采用有一定意义缩写字或代号表示。但不论什么形式，均不宜太长，以便记忆和了解，今列举以下几种代表性的细胞名称供参考；,HeLa：为供体患者的性名(来源于宫颈癌),CHO：中国地鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary),宫743：富颈癌上皮细胞，1974年3月建立,NIH3T3；美国国立卫生研究所(National Institute of Health)建立,每3天传代一次，每次接种310,6,细胞毫升。,（六）细胞系或细胞株的命名,二、建立细胞系（或株）的要求,（一）组织来源,（二）细胞生物学检测,（三）培养条件和方法,三、已建立细胞系或株的签定、管理和使用,培 养 简 历：,组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、,供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等。,冻 存 液：,培养基和防冻液名称。,细 胞 活 力：,融解前后细胞接种存活率和生长特性。,培 养 液：,培养基种类和名称(一般要求不含抗生素)，血,清来源和含量。,细 胞 形 态：,类型，如为上皮或成纤维细胞等。,核 型：,二倍体或多倍体，标记染色体的有无。,无污染测验：,包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等。,物 种 检 测：,检测同功酶，主要为G6PD和LDH，以证明细,胞有否交叉污染。,免 疫 检 测：,一两种血清学检测。,细胞建立 者：,建立者性名；检测者姓名。,C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%nWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdLH5E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0zoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkSdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQe7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9D2A-x*t$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL91z-w*t!qYmVjSgOdLaI6Ft$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjy(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkSdL9I6E3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5Dw&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXhQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXleMbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ8rZnWkTdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3CqZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+!qYmVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2*t$qZnVk4D1A-w*t$qYnVjSgv&s!pXiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qZnVkSL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*pUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(ZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)bK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOG5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%rgOdL9I6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+!qUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMa3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-aI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK91A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(vK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&tiQeNbJ8GrZ,