动物细胞融合与单克隆抗体ppt.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,电影,人兽杂交,剧照,动物细胞融合与单克隆抗体,1,、定义：,两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。也称细胞杂交,一、动物细胞融合,杂交细胞：,融合后形成的具有原来,两个或多个细胞遗传信息,的,单核细胞,成为杂交细胞,。,2,、,诱导融合的因素,生物法：,灭活的病毒,诱导融合,.(,病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。,),化学法：,聚乙二醇,PEG,诱导融合,.,物理法：,电激,融合,病毒颗粒黏 附细胞表面,细胞膜连接,细胞膜被 病毒颗粒穿通,细胞融合、形成杂种细胞,不能，因为不灭活的病毒会感染细胞。,(,三,),动物细胞融合的应用,1.,突破有性杂交方法的局限,使远缘杂交成为可能。,(,至今种间、属间、科间，甚至动物与植物之间的细胞融合已获得成功。,),2.,成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。,3.,为制造,单克隆抗体,开辟了新途径。,鼠,鸡、鼠,兔、鼠,猴、人,鼠、人,兔、,人,鸡、人,蛙、,酵母菌,鸡、人,胡萝卜,等,二、单克隆抗体,什么是抗体？,抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。,B,淋巴细胞（浆细胞）能产生抗体。,（一）获得抗体的传统方法,1,、把,某种抗原,反复注射到动物体内，然后从动物,血清,中分离出,所需的抗体,。,2,、缺点：,产量低，纯度低，,特异性差,。,人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的,B,淋巴细胞可以产生,多达百万种以上,的特异性抗体，但是,每一个,B,细胞只分泌一种特异性抗体。,要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的,B,淋巴细胞，形成细胞群,。,1,、请,从,以上文字资料中找出单克隆抗体的概念,用,单个,B,淋巴细胞,进行克隆，得到的细胞群能够分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体，这种抗体就叫做单克隆抗体。,2,、怎样才能获得单克隆抗体？,提示,1,：仅用细胞培养技术可行吗？,提示,2,：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？,提示,3,：有什么方法能使,B,细胞产生抗体的能力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？,如何大量生产单克隆抗体？,利用,B,淋巴细胞产生抗体的功能。,利用肿瘤细胞无限增殖的特性。,利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有,B,淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞。,利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞。,注射抗原,B,淋巴细胞,骨髓瘤细胞,细胞融合、筛选,杂交瘤细胞,细胞培养,筛选，继续培养,足够数量的、能产生特定抗体的细胞群,体外培养,注射到小鼠腹腔,单克隆抗体,单克隆抗体的制备,（二）单克隆抗体的制备,动物特异性免疫,分离,B,淋巴细胞（,B,）；找到骨髓瘤细胞（,G,）。注意,B,淋巴细胞是一个系列。（,B,1,B,2,B,3,-B,n,）,细胞融合,三种融合方式,:,（,BB;BG;GG,）,第一次筛选：在“,选择培养基培养,”上培养筛选,杂交瘤细胞,（只有,BG,杂交瘤细胞存活。但,BG,杂交瘤细胞也是一个系列：如,B,1,G,B,2,G-B,n,G,。而,BB,GG,在此培养基上不能存活。）,第二次筛选：在“,多孔培养板上,”培养,杂交瘤细胞系列,，,每孔只放一个杂交瘤细胞。,“克隆化培养”,每个杂交瘤细胞，并进行,“单一抗体检测”，“检测阳性”的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。,单抗的制备过程要点：,动物特异性免疫,分离,B,淋巴细胞（,B,）；找到骨髓瘤细胞（,G,）。注意,B,淋巴细胞是一个系列。（,B,1,B,2,B,3,-B,n,）,细胞融合,三种融合方式,:,（,BB;BG;GG,）,第一次筛选：在“,选择培养基培养,”上培养筛选,杂交瘤细胞,（只有,BG,杂交瘤细胞存活。但,BG,杂交瘤细胞也是一个系列：如,B,1,G,B,2,G-B,n,G,。而,BB,GG,在此培养基上不能存活。）,第二次筛选：在“,多孔培养板上,”培养,杂交瘤细胞系列,，,每孔只放一个杂交瘤细胞。,“克隆化培养”,每个杂交瘤细胞，并进行,“单一抗体检测”，“检测阳性”的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。,选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，,体外培养,或注射到,小鼠腹腔内增殖,。,提取单克隆抗体。,3,）、为何要进行两次筛选？,4,）、如何进行第,2,次筛选？,培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。,第,1,次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第,2,次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。,问题强化：,1,）、本过程利用了哪些原理？,免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理,2,）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与,B,细胞融合？,这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有,B,细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体,1,、,作为诊断试剂,：,在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等,与常规抗体相比,具有,准确、高效、简易、快速,特点,.,2,、单克隆抗体的优点：,特异性强，灵敏度高，可大量制备。,3,、单克隆抗体的应用,单克隆抗体与,早孕测试,试剂主要成分：抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体,原理：定性测定尿液中的人绒毛膜促性腺激素。（孕妇尿中的,人绒毛膜促性腺激素,能与抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体发生特异性结合）,从免疫学看，孕妇尿中的,人绒毛膜促性腺激素是什么？,1,、,作为诊断试剂,：,在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等,与常规抗体相比,具有,准确、高效、简易、快速,特点,.,2,、,用于治疗疾病和运载药物,：,主要用于癌症治疗。,生物导弹：,单克隆抗体：导向。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。,2,、单克隆抗体的优点：,特异性强，灵敏度高，可大量制备,。,3,、单克隆抗体的应用,为什么不用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的融合？,就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其,融合率都不可能是,100%,。,仅用,两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞,。更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备。,主要用于制备,单克隆抗体,获得杂种植株,用途,物理、化学方法（同左）,灭活的病毒,物理（离心、振动,、,电激）,化学（聚乙二醇）,诱导方法,使细胞分散后诱导细胞融合,去除细胞壁后诱导原生质体融合,细胞融合的方法,细胞膜的流动性,细胞膜的流动性、植物细胞全能性,原理,动物细胞融合,植物体细胞杂交,比较项目,植物体细胞杂交、动物细胞融合的比较,思考与探究,1.,植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同？,植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，,不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁,，然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融合。,资料,：,目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。,2.,制备单克隆抗体时，为什么要选用,B,淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？,哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的,B,淋巴细胞，,B,淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过程中，每一种,B,淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的,B,淋巴细胞大量增殖。,B,淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。,因此，把一种,B,淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生,杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性,在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。,1,在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（）,A,结果是相同的,B,杂种细胞的形成过程基本相同,C,操作过程中酶的作用相同,D,诱导融合的手段相同,2.,单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和,B,淋巴细胞,诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在,这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）,淋巴细胞,小鼠骨髓瘤细胞,B,淋巴细胞自身融合细胞,小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞,杂交瘤细胞,A,B,C,D,C,植物体细胞杂交的意义：,打破生殖隔离，克服远缘杂交不亲和的障碍，培育作物新品种。,一、动物细胞融合,细胞融合是正常的生命活动。,两个细胞正在融合,受精作用,(,一,),动物细胞融合的概念,动物细胞融合也称细胞杂交,是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。,（二）动物细胞融合的过程,与植物原生质体融合原理相同，方法类似。,杂交细胞,:,融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的,单核细胞,。,细胞,A,细胞,B,杂种细胞,灭活的病毒,物理法,化学法,用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程,细胞核,病毒颗粒,细胞核,（三）,单克隆抗体的应用,与常规抗体相比，,单克隆抗体特异性强,，,灵敏度高,，并,可大量制备,。,应用主要有：,1,、作为诊断试剂,2,、用于,治疗疾病,和运载药物,准确、高效、简易、快速,把抗癌细胞的单克隆抗体与药物相结合，制成“,生物导弹,”。,为什么灭活的病毒能作为诱导剂？,因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。,不灭活的病毒能作为诱导剂吗？,不能，因为不灭活的病毒会感染细胞。,如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？,融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但,这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞,，通常用“,有限稀释法,”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用,多孔细胞培养板,培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后,检测各孔上清液中细胞分泌的抗体,（常用酶联免疫吸附试验法），,那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。,阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行,3,4,次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。,在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤细胞的情况下，培养得到的细胞群是单个杂交瘤细胞克隆得来的，所以产生的抗体必然是化学性质单一的，特异性强的单克隆抗体。这里的,单克隆,确有,单个细胞克隆,的含义，只不过,克隆的,不是,B,淋巴细胞，而,是杂交瘤细胞,。,杂交瘤细胞既能迅速大量繁殖，又能产生专一抗体。,整个制备过程为何要经过,两次筛选,?,第一次筛选：用特定的选择培养基筛选出多种杂交瘤细胞,第二次筛选,（克隆化培养和抗体检测）,：筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。,单克隆抗体的,概念：,由,单个杂交瘤细胞,进行无性繁殖,也就是通过克隆，形成细胞群，这一细胞群所产生的,化学性质单一、特异性强的抗体,称为单克隆抗体。,单克隆抗体的制备,抗原注入小鼠体内,骨髓瘤细胞,分离,B,淋巴细胞,细胞融合,杂交瘤细胞,细胞培养,选择培养细胞,注入小鼠,体内培养,培养基,体外培养,从腹水提取,从培养液提取,单克隆抗体,能产生抗体,能无限增殖,既能产生抗体又能无限增殖,我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。我们知道，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个,B,淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，,如果仅取一个脾细胞（含,B,淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；,若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。,