细菌检验技术全解.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章,细菌检验技术,第一节,细菌形态检验技术,一、细菌染色标本镜检,（一）染色标本检查的基本程序,1,、涂片,2,、干燥,3,、固定,4,、染色,染料种类：碱性染料、酸性染料、中性染 料，,碱性染料最常用,（,1,）单染法,用一种染料进行染色，可观察细菌的大小、形态和排列，但不能用于鉴别细菌。如：亚甲蓝染色法,（,2,）复染法,用两种或两种以上的染料进行染色，不仅可以观察细菌的大小、形态和排列。还可用于鉴别细菌，又称为鉴别染色。,鉴别染色,革兰染色,抗酸染色,复染法的一般步骤,初染媒染脱色复染,5,、镜检,显微镜：光学显微镜,所用放大倍数：,10100,1000,所用镜头：油镜头,镜油：香柏油或石蜡油,香柏油折光率（,n,1.515,）与玻片折光率,（,n,1.52,）接近,显微镜使用完毕须擦拭镜头。,（二）革兰染色法,1,、染液组成：,结晶紫染液、卢戈碘液、,95,乙醇、稀释复红,2,、染色方法,标本涂片，固定,结晶紫初染（,1,分钟）,碘液媒染（,1,分钟）,95%,乙醇脱色（,30,秒）,复红复染（,3-5,分钟）,3,、染色结果,兰阳性菌（,G,+,）,紫色,；,革兰阴性菌,(G,-,),红色。,4,、染色原理,（,1,）渗透学说：与肽聚糖结构有关,G,菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫,-,碘复合物在细胞膜上。呈紫色。,G,菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫,-,碘复合物溶出细胞壁，复红复染后呈红色。,（,2,）化学学说：与细菌细胞质中核糖核酸镁盐有关,（,3,）等电点学说：与细菌所带电荷有关,5,、临床意义,鉴别细菌,选择用药,理解细菌的致病作用,6,、影响因素,（,1,）操作因素,涂片的厚薄,脱色时间的长短,（,2,）染液因素,卢戈碘液放置时间过长,95,乙醇挥发,结晶紫与草酸铵混合时间太长,（,3,）细菌因素：,细菌种类、,细菌菌龄,（三）抗酸染色法,用于鉴别抗酸杆菌和非抗酸杆菌,步骤：,1,、苯酚复红加温染色,2,、盐酸酒精脱色,3,、亚甲蓝复染,结果：抗酸杆菌为红色,非抗酸杆菌为蓝色,（四）其他染色法,1,、特殊结构染色法,2,、负染色法,3,、荧光染色,二、细菌不染色标本镜检,应用：主要用于观察活菌的动力和运动方式,常用方法：压滴法、悬滴法、暗视野映光法,压滴法,载玻片,细菌悬液,盖玻片,悬滴法,镜检,3,、暗视野聚光法,4,、相差显微镜检查法,（二）影响因素,1,、操作因素,2,、玻片因素,3,、光线强度,第二节,细菌接种与培养技术,一、基本条件,（一）接种环与接种针,用于取菌、接种及分离细菌的器具,1,、接种针用于挑去单个菌落、穿刺接种及斜面接种,2,、接种环用于划线分离培养、纯种接种、挑取菌落和菌液以及制备细菌涂片。,3,、接种前后都应对接种环和接种针进行灭菌,（二）红外接种环灭菌器,利用红外线产热进行灭菌,（三）培养皿,制备固体培养基常用的器皿，用于细菌的分离培养。,附：微生物检验常用玻璃仪器的准备,1,、玻璃器材的种类及用途,2,、玻璃器皿灭菌前的准备,玻璃器皿在清洗、干燥后必须经正确的包裹和加塞后才能进行灭菌处理。,3,、玻璃器材的清洗,新购置的玻璃器材：,1,2,盐酸浸泡清水清洗,用过的无污染器皿：洗涤剂洗刷清水清洗,细菌污染的器材：消毒灭菌后再洗刷,盛培养基试管和平皿：高压灭菌趁热倒出洗涤剂洗刷清水冲洗,吸管：,3,来苏浸泡清水冲洗,玻片和盖玻片：,3,来苏和清洁液浸泡清水冲洗；染色后的玻片，应肥皂水煮沸,10min,再洗涤,含油脂的器皿：单独灭菌,（四）培养箱,1,、电热恒温培养箱,2,、二氧化碳培养箱,3,、厌氧培养箱,（五）培养基,培养基：是指人工配制的适合细菌生长繁殖的综合营养基质。,1,、培养基的成分及作用,营养物质：肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血液、鸡蛋和动物血清、生长因子、无机盐,水,凝固剂：琼脂、明胶,抑制剂,指示剂,2,、培养基的种类,（,1,）按培养基的物理性状分类,液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和接种纯种细菌。,半固体培养基：含,0.3,0.5,琼脂，用于观察细菌的动力。,固体培养基：含,2,2.5,琼脂，多用于细菌的分离培养。,（,2,）按培养基的用途分类,基础培养基,：培养营养要求不高的细菌，如普通平板,营养培养基,：能满足营养需求较高细菌的生长，如血平板,鉴别培养基,：含有某些特定的底物，用于鉴别细菌，如克氏双糖培养基（,KIA,）,选择培养基,：具有选择性抑制作用，用于选择性的培养目的菌，如,SS,平板,增菌培养基,：促进目的菌的生长，适用于含菌量较少的标本，如葡萄糖肉汤。,厌氧培养基,：用于培养厌氧菌,3,、培养基制备的一般程序,调配,溶化,矫正,pH,过滤澄清,分装,灭菌,检定,培养基灭菌,基础培养基：,121,高压蒸汽灭菌,15,分钟,含糖培养基：,113,灭菌,15,分钟,鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌,3,天,3,次,不耐高温的液体成分：滤过除菌,保存,二、细菌接种与培养技术,（一）无菌技术,1,、细菌检验的操作需在无菌室或超净工作台内进行。,2,、无菌室、超净工作台使用前后需进行消毒。,3,、细菌检验使用的物品使用前后需严格灭菌,4,、无菌试管、烧瓶、吸管的使用,5,、标本的采集,6,、废弃物的处理,8,、个人防护,（二）细菌接种与分离技术,1,、细菌接种的基本程序,灭菌接种环,沾取标本,接种,灭菌接种环,杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本,杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境,2,、细菌接种法,（,1,）平板划线接种法,：,目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。,方法：,1,）分区划线法：适用于含菌量较多的标本,2,）连续划线法：适用于含菌量较少的标本,分区划线法,第一区划线,灭菌接种环,第二区划线,灭菌接种环,第三区划线,灭菌接种环,连续划线法,（,2,）液体培养基接种法,（,3,）穿刺接种法,:,用于观察细菌动力,（,4,）斜面接种法,（,5,）倾注培养法,:,用于细菌计数,（,6,）涂布接种法：见于药敏试验,（三）细菌的培养方法,一般培养（需氧培养）：,培养温度：,35,（采用恒温培养箱）,培养时间：,18,24h,二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养箱、化学法,厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等,三、细菌的生长现象（一）细菌在,液体,培养基中的生长现象,混浊,沉淀：多见于链状排列的细菌,菌膜：多见于厌氧菌,细菌在液体培养基中的生长现象,（二）细菌在,半固体,培养基中的生长现象,有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺线边缘模糊。,无鞭毛细菌：只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。,细菌在半固体培养基中的生长现象,有动力,现象,无动力,现象,（三）细菌在,固体,培养基中的生长现象,菌落,定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。,菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性,菌落类型：光滑型（,S,）、粗糙型（,R,）、黏液型（,M,）,菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。,菌 落,菌落与菌苔,第三节,细菌生化鉴定技术,细菌的生化反应：细菌具有各自独特的酶系统，因而在代谢过程中对底物的分解能力不同，所产生的代谢产物也不同，这些代谢产物各具有不同的生物化学特点，利用生物化学的方法来检验这些代谢产物，可用于鉴别和鉴定细菌，这种用生化反应测定方法称为细菌的生化反应。,一、碳水化合物的代谢试验,糖发酵试验,葡萄糖氧化发酵试验（,O/F,试验）,甲基红试验,V-P,试验,七叶苷水解试验,半乳糖苷渗透酶试验,（一）糖发酵试验,原理：不同细菌可分解不同的糖,多糖,单糖,丙酮酸,酸性产物,(,或产酸产气,),pH,指示剂呈酸性变色,(,若产气者有气泡出现,),培养基：糖发酵管、半固体发酵管、微量发酵管,试剂：酚红、溴甲酚紫等,结果,:,培养基呈酸性变色（红 黄）,应用：观察细菌对糖的分解情况，常用于肠道杆菌的鉴定,糖发酵试验结果判断,反应现象,结果描述,酸性,变色,、有气泡,分解,糖产酸、产气,酸性,变色,、无气泡,分解,糖产酸、不产气,培养基不变色,不分解,糖,糖,发酵试验,（二）葡萄糖氧化,/,发酵试验,1,、原理：细菌分解葡萄糖的过程中对氧的需求不同，分为氧化、发酵和产碱三型,单糖,丙酮酸,酸性产物,pH,指示剂呈酸性变色,2,、培养基：,HL,葡萄糖培养基,3,、试剂：石蜡,4,、结果：两管均不变色：产碱型,石蜡管变色：发酵型,非石蜡管变色：氧化型,5,、应用：肠杆菌和非发酵菌的鉴别,（三）甲基红试验,原理：细菌分解糖，产生丙酮酸，进一步生成大量混合酸，使培养基,pH,维持在,4.4,以下，加入甲基红（,4.4-5.4,）后，使甲基红呈现红色反应。此为甲基红试验,阳性。,培养基：葡萄糖蛋白胨水,试剂：甲基红试剂,结果：加入试剂后，培养基呈现,红色,：,+,培养基不变色：,应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌,葡萄糖,丙酮酸,大量混合酸,pH,降至,4.4,以下,甲基红试剂,培养基,变红,甲基红试验,甲基红试验,（四）伏普试验（,V-P,试验）,原理：细菌发酵葡萄糖，产生丙酮酸，丙酮酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境中乙酰甲基甲醇被氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基结合，生成红色化合物。,培养基：葡萄糖蛋白胨水,结果：加入试剂后，培养基呈现,红色,：,+,培养基不变色：,应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌,葡萄糖,丙酮酸,乙酰甲基甲醇,二乙酰,V-P,试剂,培养基,变红,V,P,试验,脱酸,葡萄糖发酵形成丙酮酸后的不同代谢途径,葡萄糖,丙酮酸,大量混合酸,pH,降至,4.4,以下,甲基红试剂,培养基,变红,乙酰甲基甲醇,二乙酰,V-P,试剂,培养基,变红,脱酸,（五）,B-,半乳糖苷酶试验,1,、原理：有些细菌产生的,B-,半乳糖苷酶可分 解邻硝基酚,B-,半乳糖苷（,ONPG,）产生邻硝基苯酚（黄色）,2,、培养基：,1%,乳糖肉汤琼脂,3,、试剂：甲苯、,ONPG,4,、结果：加入,ONPG,后，菌悬液黄色：,+,菌悬液无色：,-,5,、应用：迟缓发酵乳糖细菌的快速检测,（六）七叶苷水解试验,1,、原理：某些细菌可以分解七叶苷,七叶苷 葡萄糖,+,七叶素 黑色沉淀,2,、培养基：七叶苷培养基,3,、结果：培养基黑色：,+,培养基不变色：,-,4,、应用：,D,群链球菌和其他链球菌的鉴别,Fe,2+,二、蛋白质类代谢试验,靛基质试验,硫化氢试验,尿素酶试验,苯丙氨酸脱氨试验,氨基酸脱羧酶试验,（一）靛基质试验,原理：细菌产生色氨酸酶，可分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚），靛基质与试剂对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛基质。,培养基：蛋白胨水,试剂：靛基质试剂（含对二甲基氨基苯甲醛）,结果：,加入试剂后，培养基出现红色液面：,+,培养基液面为黄色：,应用：用于肠道杆菌的鉴定,靛基质试验原理,色氨酸酶,色氨酸,靛基质,（吲哚）,玫瑰靛基质,（玫瑰吲哚）,对二甲基氨基苯甲醛,靛基质试验,（二）硫化氢试验,原理：细菌分解蛋白质中的含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐或铅盐结合生成黑色络合物。,培养基：含硫酸亚铁或醋酸铅的培养基,结果：培养基变黑：阳性,不变黑：阴性,应用：常用于肠道杆菌的鉴定,（三）尿素酶试验,原理：产生脲酶的细菌，能水解尿素生成氨和,CO2,，氨使培养基呈碱性变色。,培养基：尿素培养基,试剂：酚红指示剂,结果：培养基变红：,+,培养基不变色,应用：肠杆菌科属间鉴定,尿素酶试验原理,尿素,尿素酶,氨,+CO2,培养基,pH,升高,酚红呈碱性变色（红）,(,四,),苯丙氨酸脱氨实验,原理：细菌的具有的苯丙氨酸脱氨酶，可使培养基中的苯丙氨酸脱氨，形成苯丙酮酸，后者与三氯化铁作用，形成绿色化合物。,培养基：苯丙氨酸琼脂,试剂：,10,三氯化铁,结果：加入试剂后培养基呈现绿色为阳性,应用：多用于肠道杆菌的鉴定,苯丙氨酸脱氨试验原理,苯丙氨酸,苯丙氨酸脱氨酶,苯丙酮酸,10,三氯化铁,绿色化合物,（五）氨基酸脱羧酶试验,1,、原理：某些细菌可产生氨基酸脱羧酶，可使氨基酸脱羧成胺和二氧化碳，胺溶于水使培养基显碱性,2,、培养基：氨基酸脱羧酶培养基,（糖、氨基酸）,3,、指示剂：为溴甲酚紫,5.2,（黄）,-6.8,（紫）,4,、结果：培养基变紫色：,+,培养基为黄色：,-,5,、应用：肠杆菌科细菌的鉴别,三、碳源利用试验（一）枸橼酸盐利用试验,原理：某些细菌能力利用培养基中的枸橼酸盐作为唯一的碳源，也能利用其中的铵盐 作为唯一氮源，细菌生长过程中分解枸橼酸盐产生碳酸盐和分解铵盐生成的氨，使培养基变碱，是指示剂呈碱性反应。,培养基：枸盐酸盐培养基（淡绿色）,试剂：溴麝香草酚蓝（,pH6.0,以下呈黄色，,pH7.6,以上呈蓝色）,结果：培养基变蓝：,+,培养基不变色：,应用：肠杆菌科属间鉴别,枸橼酸盐利用试验原理,枸橼酸盐,铵盐,碳酸盐,氨,培养基,pH,升高,溴麝香草酚蓝,呈碱性变色,培养基变蓝,培养基,（二）丙二酸盐利用试验,1,、原理：某些细菌可利用丙二酸为唯一碳源，分解丙二酸为碳酸钠，碳酸根水解是培养基显碱性,2,、培养基：丙二酸钠培养基,3,、指示剂：,溴麝香草酚蓝（,pH6.0,以下呈黄,色，,pH7.6,以上呈蓝色）,4,、结果：培养基变蓝色：,+,培养基不变色：,-,5,、应用：肠杆菌科细菌属之间的鉴别,四、酶类试验,（一）触酶（过氧化氢酶）试验,1,、原理：有的细菌有触酶，能催化过氧化氢生成水和氧，氧分子，出现气泡。,2,、方法：取细菌少许，滴加,3%,试剂滴。,、结果：一分钟内产生大量气泡：,一分钟内不出现气泡：,、应用：用于革兰阳性球菌的初步分类,（二）氧化酶（细胞色素氧化酶）试验,、原理：某些细菌的氧化酶，可以将二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺氧化生成红色醌类化合物,、用洁净滤纸条粘取被检细菌菌落，或直接将试剂直接滴在被检细菌菌落上,、结果：出现红色：,不出现红色：,、应用：用于肠道杆菌科和假单胞菌的鉴别。,（三）凝固酶试验,、原理：金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆中纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白。,、方法：,（）玻片法：用于结合凝固酶试验,用未稀释的兔血浆和生理盐水各滴载玻片两端。挑少许分别与之混合。,（）试管法：用于游离凝固酶试验,取三支洁净试管，其中一支加入,.,:,稀释兔血浆，其余两支分别加入阴阳性对照，各加入,.,待检菌。,、结果：,出现凝集：,不出现凝集：,、应用：,主要用于葡萄球菌的鉴定,（四）酶试验,、原理：某些细菌能产生酶，能分解，使长链变成寡链,长链可被酸沉淀，寡链可溶于酸。,、培养基：,DNA,琼脂平板,3,、方法：将细菌接种在,DNA,平板，培养后,HCl,覆盖平板,4,、结果：菌落周围出现透明圈：,+,菌落周围无变化：,-,5,、应用：用于葡萄球菌、沙雷菌和变形杆 菌的鉴定。,（五）硝酸盐还原试验,1,、原理：,2,、培养基：硝酸盐培养基,3,、结果：试剂出现红色：,+,试剂不出现红色：,-,4,、应用：用于肠杆菌科细菌、假单胞菌和厌氧菌的鉴别。,硝酸盐,亚硝酸盐,亚硝酸,重氮磺酸,细菌,醋酸,对氨基苯磺酸,N-a,萘胺偶氮苯磺酸（红色）,a-,萘胺,五、其他试验,（一）复合生化试验,1,、克氏双糖铁（,KIA,）试验,（,1,）原理：,KIA,中含有牛肉膏、酵母浸膏、蛋白胨、乳糖、葡萄糖、枸橼酸胺铁、酚磺酞指示剂。乳糖是葡萄糖的十倍。,1,）若细菌只分解葡萄糖，只能产生少量的酸，在培养,8-11,小时内，分解葡萄糖的产生的酸可使培养基底层和斜面变黄色，,18-24,小时后，斜面所含氨基酸发生降解，中和斜面的酸，是斜面变红色（碱色），底层仍为黄色（酸色）,2,）若细菌能分解乳糖，则可以中和斜面的碱，使整个培养基呈黄色。,3,）若细菌能分解含硫氨基酸，产生,H,2,S,，,H,2,S,与枸橼酸铵铁反应，产生黑色沉淀。,（,2,）结果：,斜面碱性,/,底层碱性：不发酵糖类,斜面碱性,/,底层酸性：发酵葡萄糖,斜面碱性,/,底层酸性（黑色）：,发酵葡萄糖，产生,H,2,S,斜面酸性,/,底层酸性：发酵葡萄糖和乳糖,（,3,）应用：用于肠杆菌科细菌的鉴别,（,2,）动力靛基质尿素酶（,MIU,）试验,1,）原理：,动力靛基质尿素培养基的成分：,200g/ml,尿素、酚磺酞指示剂、大量的蛋白胨，半固体培养基。,2,）结果：半固体培养基，检测细菌动力,细菌含色氨酸酶，加入靛基质试剂后，接触面变红色,细菌含尿素酶：培养基变桃红色。,3,）应用：与,KIA,试验合用，用于肠杆菌的鉴别,（,3,）,IMViC,试验,靛基质试验（,I,）,甲基红试验（,MR,）,V-P,试验（,V,）,枸橼酸盐利用试验（,C,）,用于肠道杆菌的鉴定,（二）,CAMP,试验,1,、原理：,B,群链球菌可以促进金黄色葡萄球菌的,B,溶血活性。,2,、方法：取血琼脂平板，取金黄色葡萄球菌在平板中央画一条线，再将被检菌在局金黄色葡萄球菌,3mm,处垂直划一短线，设置阴阳性对照，培养,18-24,小时，观察结果,3,、结果：被检菌接种线与金黄色葡萄球菌接种线之间出现箭头状透明溶血区，即为,CAMP,试验阳性。反之阴性,4,、应用：链球菌属的鉴别。,第四节,细菌的其他,鉴定技术,一、免疫学鉴定,利用免疫学抗原抗体进行特异性结合的原理和方法，用已知的抗原（抗体）来检测标本中未知的抗体（抗原）的方法。,（一）抗原检测：用已知抗体鉴定未知的细菌或标本中的抗原,试剂（诊断血清）：含抗体,检测对象：特异性抗原,方法：,1,、玻片凝集法,2,、免疫荧光显微技术,3,、,ELISA,试验,（二）抗体检测：用已知抗原检测血清中的特异性抗体,试剂：含已知抗原,应用：检测待检者血清中有无相应的抗体以及抗体的效价,二、药敏鉴定试验（第八章）,三、毒力鉴定（第四章）,四、分子生物学检测,