第2章免疫球蛋白.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,免疫球蛋白,南华大学医学微生物学,与免疫学教研室,（,Immunoglobulin,Ig,）,1890,年,Behring,和北里用白喉外毒素免疫动物时发现了抗白喉外毒素的抗毒素即发现了抗体，,于,1901,年获诺贝尔奖。,1938,年，用,电泳方法,将血清蛋白分为,白蛋白、,1,、,2,、,及,球蛋白,等组分，,抗体活性主要存在于,区,，也可延伸到,区和,2,球蛋白区,。,概述：抗体与免疫球蛋白,Porter,（英）和,Edelman,（美）用酶解法和化学断链法，阐明,Ab,是四肽链结构。年获奖,1957年,F Macfarlane Burnet(,澳,1899,1986)Peter B,Medawar,(,英,1915,),二人合作,提出,抗体形成的选择学说,获得性免疫耐受,于,1960,年获诺贝尔奖。,1972,年,NK,Jerne,(,丹,1912,),免疫网络学说,提出,一个,B,细胞系产生一种抗体,于,1984,年获诺贝尔奖。,1975年,G Koehler(,德,1946,19)C Milstein(,英,阿根廷,1927,),此二人制备了单克隆抗体于,1984,年获诺贝尔奖。,1978,年,S,Tonegawa,(,日,利根川进,1939,),发现免疫球蛋白基因结构,抗体多样性遗传原理,阐明了,B,细胞,Ag,识别受体（,BCR）,多样性的产生机制，于,1987,年获诺贝尔奖。,抗体（,antibody,Ab,）：,B,细胞在抗原刺激,下增殖分化为浆细胞，产生的能与相应抗原,发生特异性结合、具有免疫功能的球蛋白。,免疫球蛋白（,immunoglobulin,，,Ig,),:,具有抗,体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。,一、抗体与免疫球蛋白的概念,概念,不同,Ab,都是,Ig,Ig,不一定是,Ab,（,Ig,包含,Ab,）,Ab,是生物学,功能,上概念,Ig,是化学,结构,上概念,分泌型（,secreted,Ig,sIg,),：,分泌进入体液,发挥各种免疫功能。,膜型,（,membrane,Ig,mIg,）,:,即,B,细胞表面抗原受体（,BCR,），,包括,mIgM,和,mIgD,。,二、,Ab,与,Ig,的区别与联系,三、,Ig,的存在形式,第一节 免疫球蛋白的结构,一、免疫球蛋白的基本结构,四肽链结构,:,两条相同的,重链,（,Heavy chain,H,链）和两条相同的,轻链,（,Light chain,L,链）以二硫键连接而成,“Y”,字型,。其基本结构称单体。,（一）,重链和轻链,IgG,-,IgA,-,IgM,-,IgE,-,IgD,-,分 类,(class),：,同一种属的,Ig,，,根据重链恒定区氨基酸组成和排列顺序不同，将,Ig,分为五类或五个同种型：,1,、重链（,H,链,，,450-550aa,，,50-75kDa,）,亚类,(subclass):,每类,Ig,根据其铰链区氨基酸残基的组成和,H,链二硫键数目、位置的不同，又可分为不同的亚类。如：,IgG,：,IgG1,IgG4,IgA,：,IgA1,、,IgA2,IgM,：,IgM1,、,IgM2,分型（,type),：,同一种属所有个体内，根据,各类,Ig,L,链恒定区（,C,区）氨基酸组成和排列,不同分为两型：,型、,型（,2,：,1,）,亚型（,subtype),：,根据,链,C,区个别氨基酸的差异,将,型分为,1,、,2,、,3,、,4,四个亚型,。,2,、,轻链（,L,链,，,214aa,，,25kDa,）,可变区（,variable region,V,区）：,H,链,(1/4),和,L,链,(1/2),靠近,N,端的约,110,个氨基酸的序列变化很大，称为可变区。,（二）,可变区和恒定区,V,区,(V,L,、,V,H,),HVR,（CDR）,HVR1(CDR1),HVR2(CDR2),HVR3(CDR3),FR,FR1,FR2,FR3,FR4,Ig,的,结构域,Complementarity,determining,region,CDR,Framework,region,FR,V,H,和,V,L,的,3,个,CDR,共同组成,Ig,的,Ag,结合,部位，决定着,Ab,的特异性，负责,识别及,结合,Ag,。,恒定区,（,constant region,C,区,）,:,H,链和,L,链靠近,C,端的其余氨基酸数量、种类、排列顺序相对稳定，称为恒定区。,免疫球蛋白的基本结构示意图,*,不同类,Ig,的,C,H,长度不一,：,IgG,、,IgA,、,IgD,：,C,H,1,、,C,H,2,、,C,H,3,IgM,、,IgE,：,C,H,1,、,C,H,2,、,C,H,3,、,C,H,4,*,同一种属的个体，所产生针对不同,Ag,的,同一类别,Ig,，其,C,区氨基酸组成和排列顺,序比较恒定，即免疫原性相同，但,V,区各异。,易伸展弯曲，,有利于,Fab,段同时结合两个不,同的抗原表位；,易被,木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等,水解；,有利于,Ig,分子变构，暴露,Ig,的,补体结合位点；,五类,Ig,或亚类的铰链区,不尽相同,*,IgG,、,IgA,、,IgD,有,铰链区,*,IgM,和,IgE,无铰链区,（三）,铰链区,：,位于,C,H,1,与,C,H,2,间，富含脯氨酸,1,、,Ig,分子的两条重链和两条轻链都可折叠,为数个球形结构域,(,由链内,S-S,键,),，每个结构域一般具有其相应的功能。,L,链,:,V,L,，,C,L,H,链,:,IgG,、,IgA,、,IgD,:,V,H,，,CH,1,，,CH,2,，,CH,3,IgM,和,IgE,:,V,H,，,CH,1,，,CH,2,，,CH,3,，,CH,4,2,、,这些结构域的功能虽不同，但其结构相似,:,桶状或,三明治,（四）,结构域,（,功能区）,功能区的作用有：,VH,和,VL,是结合抗原的部位；,CH,和,CL,上具有部分同种异型的遗传标志；,IgG,的,CH2,和,IgM,的,CH3,具有补体,C1q,结合位点，可启动,补体活化经典途径,；,IgG,可通过胎盘；,IgG,的,CH3,可,结合细胞表面的,FcR,，,介导调理作用及,ADCC,作用。,IgE,的,CH2,和,CH3,可与肥大细胞和嗜碱性粒细胞的,IgE,Fc,受体结合,介导,I,型超敏反应,。,二、免疫球蛋白的其他成分,（一）,J,链（,joining chain,）,富含半,胱氨酸的多肽链,由浆细胞合成,主要功能：将单体,Ig,分子连接成多聚体。,如：,IgA,二,聚体、,IgM,五聚体,IgG,、,IgD,、,IgE,常为,单体，无,J,链。,（二）,分泌片,（,secretory,piece,SP,）,含糖肽链,合成、分泌细胞：,黏膜上皮细胞,以非共价键形式结合于,IgA,二聚体上，使其,成为,sIgA,功能,*,保护,sIgA,的铰链区免受蛋白水解酶降解；,*,介导,IgA,二聚体从黏膜下到黏膜表面的,转运。,三,、,免疫球蛋白的,水解片段,木瓜蛋白酶,（,papain,）,水解,IgG,2,个,Fab,段,(,fragment antigen,binding,抗原结合片段,),1,个,Fc,段,（,fragment,crystallizable,可结晶片段）,胃蛋白酶,（,pepsin,）,水解,IgG,F,(,ab,),2,可结合两个抗原表位形成凝集反应。,pFc,IgG,二硫键近,N,端,木瓜,蛋白酶,二硫键近,C,端,胃,蛋白酶,单价,与抗原结合但,无凝集或沉淀反应,2Fab,1Fc,固定补体、结合,FcR,；,同种型的抗原性,F(ab),2,双价,与抗原结,合，有,凝集或沉,淀反应,pFc,无生物学活性,水解片段意义：,*,阐明,Ig,分子生物学作用；,*,用作生物制品：去掉,Fc,段，减少超敏反,应发生；,*,构建基因工程抗体。,第二节 免疫球蛋白的异质性,含义：,尽管所有的免疫球蛋白分子在结构上均由,V,区和,C,区组成，但不同抗原甚至同一抗原刺激,B,细胞产生的免疫球蛋白，在其特异性以及类型等诸多方面均不尽相同，呈现出明显的异质性。,Ig,异质性表现在,1,、不同抗原表位诱导的同一类型的,Ig,，,其结合抗原的特异性不同（可变区差异）。,2,、同一抗原表位刺激所产生的抗体分子，其结合抗原的特异性相同，但恒定区可不同（其,H,链类别和,L,链型别也有差异）。,1,、类：,在同一种属的所有个体内，,Ig,重链,C,区所含抗原表位不同，据此可将,Ig,分为五类，即同种型。,2,、亚类：,同一类,Ig,其,重链的抗原性及二硫键的数目和位置不同，据此可以将,Ig,又可以分为亚类。,一、免疫球蛋白的类型,3,、型：,同一种属所有个体内，根据,Ig,轻链,C,区抗原性的不同，将,Ig,轻链分为,2,种：,和,，,与此对应的,Ig,分为,和,两型（,2,：,1,）。,4,、亚型：,同一型,Ig,中，根据其轻链,C,区,N,端氨基酸排列的差异，又可分为亚型。,型有,1,4,四个亚型。,OZ(+)(,或,1),：,第,190,位,(,亮氨酸,),OZ(-)(,或,2),：,第,190,位,(,精氨酸,),Kern,(,+,)(,或,3),：,第,154,位,(,甘氨酸,),Kern,(-)(,或,4),：,第,154,位,(,丝氨酸,),多样性抗原：,自然界存在的抗原数目繁多，每一种抗原分子 的结构又十分复杂，含有多种不同的抗原表位。理论上，每一种抗原表位可诱导产生一种特异性抗体，以及针对同一抗原表位可产生不同类型的抗体。,二、外源因素所致的异质性,-,免疫球蛋白的多样性,三、内源性因素所致的异质性,-,免疫球蛋白的血清型,Ig,具有两重性，即可以是,抗体,，也可以成为,抗原,，表现,为三类不同的抗原表位：,(,一）同种型,：存在于同种抗体分子中的抗原表位，是,同一种属所有个体,Ig,分子共有的抗原特异性标志，,为种属型标志，存在于,Ig,C,区。,鼠,-,人，兔,-,人,，,Ig,在种之间的抗原性,(,强,),（二）同种异型,：同一种属,不同个体间,Ig,分子所具有的不同抗原特异性标志，为个体型标志。存在于,Ig,C,区，由同一基因座的不同等位基因所编码，均为共显性。,目前已鉴定的人类,Ig,分子上的同种异型,抗原决定基有：,Gm,、,Am,、,Km,Ig,在同种不同个体间的抗原性（弱）,人,人,（三）独特型（,idiotype,Id,),：每一,B,细胞克隆产生的,Ig,所具有的特有的抗原特异性标志。即使是同一种属、,同一个体,来源的抗体分子，主要由于其,CDR,区的氨基酸序列的不同，可显示不同的免疫原性，是,每个,Ig,分子所特有的抗原特异性标志,，其表位又称为,独特位（,idiotope,),。,存在于,V,区。（,Ig,分子间的抗原性,）,独特型可刺激异种、同种异体以及自体产生相应,Ab,即,抗独特型抗体（,AId,或,Ab2),Id(,idiotype,),和,AId,（,anti-,idiotype,antibody,）,Id,：,个体独特型，特异性抗体分子所特有的,Id,；,公有独特型，功能上有关联的,Ig,所共有的,Id,。,AId,:,称为,Ab2,分为,Ab2,、,Ab2,、,Ab2,、,Ab2,Ab2,：识别并结合,Ig,（,Ab1,）骨架区附近的独特型，不影响,Ab1,与抗原的结合，属于半抗原非抑制性,Ab2,。,Ab2,：识别,Ab1,上与抗原互补的表位，完全抑制抗原与,Ab,结合。具有类似抗原的结构，可模拟,Ag,产生,IR,，称“内影像”作用。,Ab2,：结合,Ab1,上与互补位相关及邻近的独特位，抑制或部分抑制,Ab1,与抗原结合，属于半抗原抑制性,Ab2,。,Ab2,：既识别,Ab1,骨架区附近的独特位，又识别抗原上的抗原表位，为双特异性抗体，与自身免疫病的发生有关。,第三节,Ig,的基因结构及其重排和表达,一、胚系基因结构,（一）,V,区基因和,C,区基因,每种肽链的编码基因可分为编码,V,区的,V,区基因,和编码,C,区的,C,区基因,两大部分。,重链,V,区基因,:,是由三种胚系基因片段：,V,、,D,、,J,片段拼接而成,轻链,V,区基因,:,是由,V,、,J,两个基因片段拼接成,BCR/,Ig,的各个,V,基因片断之前还有,前导序列（,L,序列）,，编码前导肽,;,V,区基因的下游是编码,C,区的,C,区基因,BCR/,Ig,各条肽链的基因定位于,不同的染色体上,H,链,:14,号染色体,链,:2,号染色体,链,:22,号染色体,（,二）,Ig,胚系,基因结构,VDJ,或,VJ,基因重排连接,V,区基因,转 录,初次,RNA,转录体,剪切加工成,mRNA,L,序列和,V,、,C,基因连接,入胞质翻译肽链,内质网,重链、轻链组装,完整的,BCR/,Ig,高尔基体,运送细胞膜,分泌型,Ig,或,膜型,Ig,二、,Ig,的基因重排和表达,三、,Ig,的类别转换（,class switching,）,一个,B,细胞克隆在分化过程中,V-D-J,功能性基因片段保持不变，而发生,C,基因重排，使其表达的抗体分子发生,H,链类的改变，称为类别转换。,B,细胞克隆,IgM,IgG,IFN-,IL-4,IgE,S,序列：,CH,基因,5,一段内部重复序列，使任一,C,区均可与,VDJ,单位连接,四、膜型,Ig,和分泌型,Ig,1,、,Ig,(,IgM,、,IgD,),既有膜型又有分泌型；,2,、,膜型,Ig,均为单体；,3,、膜型和分泌型,Ig,是在,转录加工过程,中造,成的。,A,、,编码,Ig,羧基端有两种外显子,SC,：,编码分泌型,Ig,羧基端,MC,：,编码膜型,Ig,羧基端,B,、,基因结构,：,V-D-J-C-SC-MC,-MC,a.,转录到,SC,止 编码分泌型,Ig,b.,转录到,MC,止 编码膜型,Ig,一、识别并特异性结合抗原,二、激活补体,三、结合细胞表面的,Fc,受体,（一）调理作用,（二）,ADCC,（,三）介导,型超敏反应,四、穿过胎盘和黏膜,第四节 免疫球蛋白的功能,一、,Ig,V,区的功能,:,1,、特异性识别、结合抗原,V,区的,CDR,在识别和结合特异性抗原中起,决定性作用,抗原结合价,：,Ig,结合抗原表位的个数,实际意义,:,*,中和效应,：,中和毒素、病毒，阻止细菌吸附,*,启动体液免疫应答,:,BCR,（,mIgM,、,mIgD,）,特,异性识别,Ag,分子,*,病理损伤,:,参与,、,、,型超敏反应,2,、免疫调节：,独特型网络调节,3,、超抗体活性：,Ig,除与特异性抗原结合外，还可与核苷酸及超抗原结合，从而发挥多种功能。可能与自身免疫病和抗感染免疫有关。,二、,Ig,C,区的功能,(,一）激活补体,Ab(,IgM,、,IgG1,-3,),与,Ag,结合,构型,改变,位于,C,H,2/C,H,3,功能区的补体结合位点暴露,激活,补体经典途径,IgG4,、,IgA,和,IgE,的凝聚物,激活,补体旁路,途径,1,、,调理作用,：,IgG,与细菌等颗粒性抗原结合后，可通过其,Fc,段与巨噬细胞和中性粒细胞表面相应,Fc,R,结合,，从而,促进吞噬细胞的吞噬作用。,（二）结合,Fc,受体,2,、,抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用,(antibody-dependent cell-mediated,cytotoxicity,，,ADCC,),:,IgG,与肿瘤或病毒感染的靶细胞结合后，可通过其,Fc,段与,NK,细胞,、巨噬细胞和中性粒细胞表面相应,Fc,R,结合，直接,杀伤,靶细胞。,IgE,的,Fc,段可与,肥大细胞,和,嗜碱性粒细胞,表面的高亲和力,IgE,Fc,受体（,FcR,),结合，并使其致敏。若相同变应原再次进入机体与致敏靶细胞表面的特异性,IgE,结合，即可使之脱颗粒，释放组胺等生物活性介质，引起,型超敏反应。,3,、介导,型超敏反应,(,三）穿过胎盘和黏膜,穿过胎盘：,IgG,意义：新生儿抗感染,穿过黏膜：,sIgA,意义,：,黏膜局部抗感染,一、,IgG,单体分子，少量,IgG,以多聚体存在；,四个亚类；,血清中含量最高,约占血清总,Ig,的,75%;,半衰期最长,(20,23,天），是再次应答的主要抗体；,抗感染的主要抗体；,是唯一能通过胎盘的抗体；,第五节 五类免疫球蛋白的特性与功能,激活补体；中和毒素。,与细胞表面,FcR,结合,调理作用、,ADCC,作用,能结合,SPA,纯化抗体、免疫诊断,参与,II,、,III,型超敏反应,某些自身抗体、,封闭抗体也属于,IgG,二,、,IgM,1.,占血清,Ig,含量的,5,10%,；,2.,单体：以膜结合型（,mIgM,）,表达于,B,细胞表,面，构成,BCR,分泌型：五聚体，分子量最大；,(,凝集作用强,),3.,个体发育中最早合成和分泌的,Ab,；,4.IgM,不能通过胎盘,脐带血,IgM,升高示胎儿,有宫内感染；,5.,初次体液免疫应答中最早出现的,Ab,-,早期抗感染,;,6.,半衰期,:5,天,-,血清中特异性,IgM,增高提示有,近期感染；,7.,激活补体能力强，中和毒素与病毒，促吞噬,8.,自身抗体（如：类风湿因子）、天然血型,Ab,为,IgM,；,9.,参与,II,、,III,型超敏反应。,1.,两种类型：,血清型,-,单体，血清中；与组织,Ag,有特殊,亲和力,可防止其诱导自身免疫应答。,分泌型,-,二聚体，由,J,链连接，含上皮细胞,合成的,SP,经分泌性上皮细胞分泌,至外分泌液中；有阻抑病原粘附、溶解,细菌、介导,ADCC,作用、中和毒素与病,毒及免疫排除等作用。,2.,占血清,Ig,含量的,10,15%,；,三、,IgA,3.,黏膜局部抗感染免疫的主要,Ab,：,抗感染：阻止病原体黏附到细胞表面,中和毒素,4.,婴幼儿从母体初乳中获得,sIgA,属重要的,自然被动免疫。,四、,IgD,1.,单体分子,;,2.,存在形式：,分泌型,:,血清中，不稳定，功能不清,;,膜结合型,:,构成,BCR,是,B,细胞发育成熟的,重要标志。,未成熟,B,细胞,:,mIgM,成熟,B,细胞,:,mIgM,+,mIgD,3.,占血清,Ig,含量的,0.2%,；,4.,半衰期,:3,天。,五,、,IgE,1.,单体分子；,2.,血清中含量最低,(,占,Ig,的,0.002%),；,3.,半衰期,:2,天；,4.,黏膜下淋巴组织中的浆细胞分泌；,5.,亲细胞抗体，,介导,I,型超敏反应；,6.,过敏性疾病和某些寄生虫感染患者血清中,特异性,IgE,水平增高。,第六节 免疫球蛋白超家族,概念与组成,与,Ig,结构相似、遗传基基同源的一类蛋白分子，它们主要以膜蛋白形式存在于细胞表面，有识别及传递信号的功能，将此类蛋白称为免疫球蛋白超家族。,Ig,、抗原受体（,TCR,与,BCR,）、提呈抗原的分子（,MHC,与,CD1,）、粘附分子、,IgFcR,、,CKR,及其他成员,结构特点,跨膜蛋白；胞外区、跨膜区、胞内区,生物学功能,激发,IR,、调节免疫、介导细胞间相互粘附、参与,Ig,转运与分泌。,第七节人工制备抗体,1,、制备抗血清,-,多克隆抗体,2,、单克隆抗体技术,3,、基因工程抗体,1,、含义：,指由多个,B,细胞克隆产生的针对抗,原物质中多种抗原表位的多种抗体混合物。,如,:,免疫血清（含多种特异性抗体）,优点：,作用全面,来源广泛，制备容易。,缺点：,特异性不高，易发生交叉反应。,一、多克隆抗体（,polyclonal antibody),多,克隆抗体,天然,Ag,免疫动物,多克隆抗体,二、单克隆抗体,（,monoclonal antibody,McAb,）,由单一克隆,B,细胞杂交瘤产生的，只识别抗原分子某一特定抗原表位的特异性抗体。,杂交瘤细胞：,骨髓瘤细胞,-,无限增殖；,免疫,B,细胞,-,合成、分泌特异性抗体。,杂交瘤技术,-HAT,培养基：次黄嘌呤,(H),氨基蝶呤,(A),和胸腺嘧啶核苷,(T),。,杂交瘤细胞,具有,无限增殖,和,分泌,特异性,抗体,的,能力,未融合脾细胞,（,HGPRT,+,）,:,不能在体外长,期存活而,死亡,(,次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶）,未融合的骨髓瘤细胞,（,HGPRT,-,）,:,合成,DNA,被氨基蝶呤,(A),阻断，又缺乏,HGPRT,，,不能,利用次黄嘌呤,(H),合成,DNA,而,死亡,融合的杂交瘤细胞,（,HGPRT,+,）,:,从脾细胞,获得,HGPRT,而能在,HAT,培养基中,存活和增殖,杂交瘤技术,的原理,单克隆抗体的制备过程,抗原,(,多表位,),免疫小鼠 骨髓瘤细胞培养,免疫脾细胞 骨髓瘤细胞,细胞融合,HAT,培养基,杂交瘤细胞的筛选与克隆化 ,mAb,的大量制备,PEG,优点：,结构均一、纯度高、特异性强、效价高、血清交叉反应少或无,缺点：,鼠源性对人具有较强的免疫原性，反复人体使用后可诱导产生人抗鼠的免疫应答（,HAMA,），,导致机体免疫损伤。,试图使用相同的技术生产人源,mAb,未能成功，其主要原因是缺乏合适的人骨髓瘤细胞系，另外，杂交瘤产生人源,mAb,在技术上还存在着融合难、不稳定、人体不能随意免疫等问题。,三,、,基因工程抗体,(,genetic engineering,antibody,),通过基因重组改良抗体性能,通过噬菌体抗体库技术研制新的抗体,原理：,借助,DNA,重组和蛋白质工程技术，按人们的意愿在基因水平上对,Ig,分子进行切割、拼接或修饰，重新组装成新型抗体分子。,基本思路：,将部分或全部人源抗体的编码基因，或克隆到真核或原核表达系统中，体外表达人,-,鼠嵌合抗体或人源抗体；或转基因至剔除自身抗体编码基因的小鼠体内，主动免疫诱生人源抗体。,根本出发点：,解决抗体的鼠源性问题,优点：,人源化或完全人源的抗体，均一性强，,可工业化生产；,缺点：,亲和力弱，效价不高。,基因工程抗体的种类,:,对鼠源性抗体的改造,噬菌体抗体,（将,B,细胞全套可变区基因克隆出来与噬菌体外壳蛋白基因连接，导入细菌体内使之表达，制备人全套抗体）,转基因小鼠制备人源抗体,鼠单抗人源化,小分子抗体,将,C,H3,的,C-,末端与,ScFv,的,N-,末端连接,二硫键稳定的,Fv(dsFv,),基因工程抗体的种类及其特性,基因工程抗体的应用,抗肿瘤作用,抗感染作用,在器官移植中的应用,抗血栓作用,在自身免疫性疾病中的应用,在中毒性疾病中的应用,在变态反应性疾病中的应用,免疫球蛋白的基本结构示意图,Ig,的,结构域,