gP96多肽复合物／树突状细胞疫苗研究.ppt

gP96,多肽复合物树突状细胞疫苗的实验研究,gP96,多肽复合物树突状细胞疫苗的实验研究,北京大学人民医院胸部微创中心胸外科,博士研究生：李运,导 师：王俊 教授,研究背景,全世界肺癌病例,1910,年,gP96,or,DC,科研工作新问题,单方面要素,两方面要素,gP96,多价性,特异性,（抗原库）,DC,识别抗原,激活细胞免疫,（专职抗原,呈递细胞）,研究内容,肺癌组织提取,gP96,SDSPAGE,凝胶电泳、银染鉴定、,Western,印迹分析,蛋白定量分析,RT-PCR,检测,RNA,水平表达,免疫组化检测蛋白水平表达,第一部分,gp96,多肽复合物提取鉴定,在肺癌组织中表达的研究,肺癌组织,gP96,提取和鉴定；,肺癌组织和正常组织,gP96,的表达水平；,目的,流程,定量分析测得所提取的,gp96,蛋白浓度在,0.1g/ul,左右，相当于,50-80ug/g,组织。,肺癌组织细胞浆中有棕黄色颗粒聚集,正常肺组织中细胞苏木素染色阴性,同一患者标本,Gene,N(,xs,),T(,xs,),t value,p value,gp96,0.67250.4713,1.1100.4467,-4.318,0.001,外周血单个核细胞提取及体外扩增,流式细胞仪鉴定,gP96,与树突状细胞共孵育制备疫苗,体外,CTL,反应，,INF-,浓度,淋巴细胞表型分析,第二部分,gP96,多肽复合物,/DC,疫苗体外,诱导,CTL,反应实验研究,外周血来源,DC,培养和鉴定,gP96,多肽复合物,/DC,疫苗的制备,gP96/DC,体外实验,目的,流程,培养,2-3,天后的,DC,培养,7,天后的,DC,A-1,培养前,CD1a,-,A-2.,培养后,CD1a,+,B-1.,培养前,CD86,-,B-2.,培养后,CD86,+,C-1.,培养前,CD83,-,C-2.,培养后,CD83,+,D-1.,培养前,CD80,-,D-2.,培养后,CD80,+,E-1.,培养前,CD14,+,E-2.,培养后,CD14,-,CD14,-,；,CD80,+,；,CD83,+,；,CD86,+,培养前淋巴细胞的,CD3,培养,10d,后淋巴细胞的,CD3,培养前淋巴细胞的,CD4,、,CD8,培养,10d,淋巴细胞的,CD4,、,CD8,CD3/CD8,T,细胞明显增加；,CD8,/CD4,细胞比例增加,样本,ELISA,反应的,OD,值,(XS),释放,IFN-,的量（,pg/ml,）,gp96/DC,2.2440.133,4150.835,gp96,1.6740.162,3066.847,DC,0.1260.011,122.966,建立动物模型,以制备的疫苗免疫动物并种植肿瘤,观察成瘤率，肿瘤体积，动物生存时间,第三部分,gP96,多肽复合物,/DC,疫苗,动物体内实验研究,gP96/DC,在小鼠体内的抑制肿瘤生长作用的研究,目的,流程,LA795,肺癌肿瘤组织,提取,Gp96,小鼠外周血,615,小鼠,肺癌模型,Gp96/DC,，,Gp96，DC,提取,DC,细胞,观察肿瘤生长情况及对小鼠生存期的影响,SCID,小鼠,PAa,肺癌肿瘤组织,提取,Gp96,人外周血,免疫重建小鼠,荷人肺癌免疫重建小鼠,Gp96/DC,疫苗,提取,DC,细胞,观察肿瘤生长情况及对小鼠生存期的影响,100%,75%,615,小鼠肿瘤植入后不同时间的肿瘤体积（,xs,cm,）,组数,处理,动物数,肿瘤植入后天数,21,28,35,种植,10,2.630.87,6.461.47,8.041.40,GP96,8,0.330.27,0.700.62,1.491.17,DC,8,0.300.22,0.640.49,1.160.92,GP96+DC,8,0.210.22,0.320.30,0.620.30,615-LA795,：与,组比较，,P,0.05,。,：,与,组和,组比较，,P,0.05,：与,组比较，,P,0.05,。,：,与,组和,组比较，,P,0.05,615,小鼠肿瘤植入后的生存时间,组数,处理,动物数,肿瘤植入后生存天数,种植,10,52,GP96,8,51.5,DC,8,58.5,GP96+DC,8,77,SCID-,PAa,：与,组比较，,P,0.05,。,：,与,组和,组比较，,P,0.05,SCID,小鼠肿瘤植入后不同时间的肿瘤体积,(XScm),组数,处理,动物数,肿瘤植入后天数,21,28,32,重建,16,0.380.12,0.750.30,0.900.33,GP96,8,0.090.06,0.170.06,0.220.11,DC,8,0.080.06,0.150.08,0.240.11,GP96+DC,8,0.030.03,0.080.08,0.120.13,87.5%,100%,SCID,小鼠肿瘤植入后的生存时间,组数,处理,动物数,肿瘤植入后生存天数,重建,16,37,GP96,8,52,DC,8,52.5,GP96+DC,8,62,讨 论,gP96,在肺癌中的表达,基因表达的检测,mRNA,水平：原位杂交、,Northern Blot,、核酸酶保护分析,Real-time RT-PCR,、半定量,RT-PCR,。,蛋白水平。,方法,比较,原位杂交,仅能提供,mRNA,在细胞内的定位信息，不能确定,mRNA,的含量，受人为因素影响大，无法检测极微量的,mRNA,Northern Blot,敏感性低，样品用量大，对实验条件要求高，需要应用放射性物质，不适合检测低丰度的,mRNA,Real-time RT-PCR,仪器和试剂盒价格昂贵，标准物难以获得,核酸酶保护分析,操作复杂，价格昂贵,半定量,RT-PCR,高度敏感、准确、简便、快捷、对仪器要求低、可重复性强、易于掌握,与正常组织相比，肺癌组织中编码,gp96,的基因在,mRNA,水平的表达明显增高的。这进一步证实了在罹患肿瘤时，以,gp96,为代表的,HSPs,合成明显增加，这是机体受到肿瘤刺激产生的热休克反应，以此来维持细胞内环境的稳定，是机体的一种保护性反应。,半定量,RT-PCR,法,mRNA,水平,gP96,肺癌组织,正常肺组织,免疫组化法,蛋白水平,引物设计,循环次数,操作中注意：,模板,内对照,gP96,的提取,提取,gP96,的经典方法（,Srivastava,）：,饱和硫酸铵沉淀,刀豆球蛋白,A,亲和层析,DEAE,离子交换层析,（提取率估计在,20-30%,，蛋白提取量在,15-150ug/g,组织）,存在的普遍问题：,蛋白提取率低，尚无法满足临床需要,解决：,更改其中的试剂或步骤：,去除饱和硫酸铵沉淀过程，离子交换层析柱换用,MonoQ,或,POROS20QE,柱,增加组织中,gP96,含量：,热刺激、缺氧等物理刺激或者通过转基因技术导入,gP96cDNA,重组真核表达质粒以增加细胞中,gP96,合成量,DC,的来源,来源,培养方法建立,比较,脐带血,1992,肿瘤患者多无法获得,外周血,1994,取材容易，操作简单，,DC,生成量大，纯度高，可以反复进行，患者痛苦小，便于临床应用，是目前获得,DC,的较理想的途径。,骨髓,1995,穿刺操作复杂，获得细胞量少，需多点反复操作，可能会增加创伤，给患者造成极大的痛苦,DC,的分离和培养,分离纯化,DC,的方法,物理方法,根据细胞的黏附性进行分离,黏附分离法、尼龙毛分离法和羰基碳分离法等,根据细胞比重进行分离,葡聚糖,-,泛影葡胺（,Ficoll,）密度梯度离心、,Percoll,非连续性,/,连续性密度梯度离心及,E,花环沉淀分离等方法,免疫分选,淘洗法、流式细胞技术、磁性细胞分离术等方法,密度梯度离心获取单个核细胞,富集前体,DC,细胞因子体外扩增培养,富集前体,DC,：去除粒、单核、,T,、,B,、,NK,和巨噬细胞,方法,特点,黏附法,直接黏附法,对细胞干扰小，,DC,获得率高,间接黏附法,培养体系小，节省细胞因子，细胞损伤大，,DC,获得率低,单抗法,免疫磁珠和流式细胞技术,需要大量的特殊抗体，细胞损失量大，价格昂贵，,细胞因子,作用,必需,GM-CSF,促进,DC,增殖，是最基本的因子,IL-4,抑制中性粒细胞和巨噬细胞增殖,争议,TNF-,促进,DC,成熟，抑制粒细胞产生,Flt3L,促进,DC,增殖，抑制,DC,分化,其他,LPS,、,CD40L,、,INF-,、,INF-,及,IL-1,等,方法,备注,形态结构,相差显微镜、电镜,直观,分子表达,CD1a,、,CD80,、,CD86,、,CD40,和,CD83,等，特别是,CD83-,树突状细胞的标志性分子,准确,功能状态,混合淋巴细胞反应,DC,的鉴定,关于动物肿瘤模型,动物模型的优越性：,避免了在人身上进行实验所带来的风险,临床上少见疾病可用动物随时复制出来,研究周期短，节省时间，克服人类某些疾病潜伏期长，病程长和发病率低的缺点,可在人为控制条件下进行实验,可以严格控制实验条件，增强实验材料的可比性,取材方便，可以简化实验操作和样品收集,成本低,有助于更全面地认识疾病的本质,按产生原因,自发性肿瘤模型,实验动物未经任何有意识的人工处置，在自然情况下所发生的疾病,诱发性肿瘤模型,使用物理的、化学的和生物的致病因素作用于动物诱发肿瘤,移植性肿瘤模型,人类肿瘤移植动物,按系统范围,疾病的基本病理过程模型,各种疾病共同的一些病理变化过程的模型,各系统疾病模型,与人类各系统疾病相应的模型,按模型种类,整体 模型,离体器官和组织,细胞株,分类,已建立动物模型的人类肿瘤：,肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胶质瘤等,常用的动物：,小鼠、大鼠、兔、鸡胚等,近交系小鼠：,BALB/c,、,C57,、,C3H,、,615,、,T739,、裸鼠、,SCID,小鼠等五十余种,SCID,小鼠,16,号染色体近着丝点处单个隐性基因发生,SCID,突变,基因重排异常,免疫球蛋白重链,T,细胞抗原受体,T,、,B,淋巴细胞前体分化,T,、,B,淋巴细胞,细胞免疫,体液免疫,免疫球蛋白缺如,淋巴细胞严重减少,对体外移植物免疫排斥低,联合缺陷,+,1983,年,Bosma,免疫重建,1988,年,Moiser,骨髓,胸腺,脾,胎肝,外周血淋巴细胞,腹腔,皮下,免疫系统恢复,且具有人类免疫系统的特征,与人体内环境极其类似,保证了患者本身的安全,带有人类肿瘤,具有人类免疫系统,研究肿瘤生长的理想动物模型,gP96/DC,在体外可诱发强烈的,CTL,反应,在体内可有效抑制肿瘤生长,gP96+DC-,特异性,+,多价性,-,避免了肿瘤的免疫逃逸,探寻机制,抗原肽（小分子,）,DC,gP96+,抗原肽,CD91,T,淋巴细胞,MHC,分子、共刺激分子,粘附分子,体外扩增培养,DC,未成熟,DC,凋亡,gP96,成熟,DC,直接与,T,淋巴细胞接触发生作用,未接触肿瘤抗原,不需激活,肿瘤抗原,非专职抗原呈递细胞,抗原特异性免疫耐受,专职抗原呈递细胞,特异性免疫防御反应,结 论,gP96/DC,，在动物体内可降低肿瘤成瘤率，明显抑制肿瘤生长，延长宿主生存时间,属于个体化治疗方案，是未来原发肿瘤切除后微小转移灶的预防和治疗的有效措施之一,gP96,在肺癌组织中,RNA,和蛋白水平的表达明显高于正常肺组织,gP96/DC,疫苗在体外可激发更强烈的,CTL,反应，刺激,T,淋巴细胞增殖，,CD8+/CD4+,细胞比例增加，并使,T,淋巴细胞,IFN-,分泌明显增加,